專利名稱：siRNA微乳載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種可將特定疾病相關(guān)基因的SiRNA包封于其中的經(jīng)皮轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)——siRNA微乳載體及其制備方法。
背景技術(shù)：
基因治療是疾病治療理念、技術(shù)和方法中的重大突破，其中RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及siRNA的應(yīng)用為基因治療提供了新的手段，也豐富了基因藥物開發(fā)的內(nèi)容。RNA干擾(RNA interfering, RNAi)現(xiàn)象是由與祀基因序列同源的雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)裂解成由21 25個核苷酸組成的小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)而引發(fā)的廣泛存在于生物體內(nèi)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程(參見文獻(xiàn)①HannonGJ. RNA interferences. Nature. 2002Jul 11；418(6894) :244-51.②Dykxhoorn DM,NovinaCD, Sharp P. Killing the messenger Short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003Jun ;4 (6) :457-67.)。目前RNAi技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因功能研究領(lǐng)域，而且在疾病治療領(lǐng)域也日益引起重視。其相對于傳統(tǒng)藥物和抗體治療的優(yōu)勢在于
(I)siRNA設(shè)計遠(yuǎn)比一個化學(xué)藥物或抗體藥物的設(shè)計合成制備周期要短，因為所有siRNA藥物的合成路線是一樣，而每一個化學(xué)藥物都有其特殊性；(2) siRNA藥物可靶向任何一個基因，包括藥物或抗體不能靶向的基因或蛋白；(3)其對致病基因的高特異性也是傳統(tǒng)藥物無法相比的；(4)因為所有siRNA具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其藥代動力學(xué)特點是相似的，不需要專門的研究。因此RNAi技術(shù)可以大大簡化藥物研發(fā)過程，基于以上優(yōu)點，可以看到以siRNA作為治療手段的前景誘人，許多科研機(jī)構(gòu)在致力于研究siRNA藥物，甚至一些公司已經(jīng)開始開發(fā)這類藥物，并進(jìn)入I期或II期臨床實驗或臨床前實驗，目前的siRNA藥物主要是針對黃斑變性、病毒(如HIV)感染，炎癥性疾病(如哮喘)及腫瘤等，涉及的基因主要有 VEGF、VEGFR、IL4R 等(Liu G, Wong-Staal F，Li QX. Development of new RNAitherapeutics. Histol Histopathol. 2007 Feb ；22 (2) :211-7. )。siRNA 用于科研或藥物研發(fā)，其給藥方式一般為整體給藥，如靜脈注射，或局部給藥，如皮內(nèi)、皮下注射，吸入、滴入。siRNA治療學(xué)面臨的主要問題是給藥方法問題，幾家RNAi治療學(xué)公司正在通過開發(fā)復(fù)合給藥系統(tǒng)發(fā)展siRNA治療學(xué)。第一類RNAi技術(shù)治療學(xué)方法是將siRNA直接應(yīng)用到病變的部位。例如，Sirna公司的先導(dǎo)siRNA分子就是直接注射到眼部，用以治療年齡相關(guān)的黃斑退化癥；位于麻省劍橋市的Alnylam制藥公司是將siRNA直接吸入肺部，治療呼吸道合胞體病毒感染。據(jù)Sirna(舊金山)公司負(fù)責(zé)科研工作的副總裁Berry Pollisk講道“核酸治療學(xué)還是一種理想中的治療方法，最終還有待去實現(xiàn)。咎其原因，完全是由于對給藥系統(tǒng)沒有給予足夠的重視，對這個問題的重要性也沒有作出準(zhǔn)確的判斷?！甭槭±砉ご髮W(xué)醫(yī)學(xué)院專門從事RNAi研究的Philip D. Zamore說，“我們對RNAi治療學(xué)中的藥物輸送系統(tǒng)問題保持一種樂觀的態(tài)度。向肺部給藥很有希望，但如果想向肺部以外的其他器官或組織給藥，那還需要做很多工作。如果你已經(jīng)能將RNAi輸送到肝臟和肺臟，并不意味著就完成了 RNAi給藥方法研究的使命，因為不同組織和器官的給藥方法不同，所需要的輔助材料和藥物載體也不同。有好多人患有不同的組織和器官疾病，意味著需要很多的給藥系統(tǒng)和方法?！?張殿增(編譯)，RNAi技術(shù)產(chǎn)業(yè)化最新動向.生物技術(shù)世界，2007，(I))因此，siRNA作為藥物用于治療主要的瓶頸問題主要是一個是穩(wěn)定性的問題，siRNA非常容易被環(huán)境中的核酸酶水解而失去活性；另一個是轉(zhuǎn)運(yùn)問題，目前用于局部基因敲除的siRNA經(jīng)常采用皮下注射或靶器官注射，但這些方法不方便真正應(yīng)用于臨床，只能用于科研中的動物給藥。目前對于siRNA藥物研發(fā)，還沒有經(jīng)皮給藥的給藥模式，因為缺乏經(jīng)皮給藥的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。目前尚無文獻(xiàn)報道一種能夠有利于保護(hù)siRNA的穩(wěn)定性，又要有利于其順利透過皮膚或粘膜的siRNA載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明擬在研究一種將siRNA包封于其中，能夠?qū)崿F(xiàn)經(jīng)皮轉(zhuǎn)運(yùn)的載體，同時解決siRNA的穩(wěn)定性和經(jīng)皮或經(jīng)粘膜的轉(zhuǎn)運(yùn)問題。

本發(fā)明的目的是提供一種可將特定疾病相關(guān)基因的siRNA包封于其中的經(jīng)皮轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)——siRNA微乳載體，該siRNA微乳載體不僅保護(hù)了包封其中的siRNA的穩(wěn)定性而且透皮能力強(qiáng)。本發(fā)明的另一目的是提供該siRNA微乳載體制備方法。本發(fā)明人設(shè)想本發(fā)明的技術(shù)方案既要能夠有利于保護(hù)siRNA的穩(wěn)定性，又要有利于siRNA順利透過皮膚，因此，制備siRNA微乳載體應(yīng)該是最優(yōu)化的技術(shù)方案。首先，微乳中的水相可以將siRNA很好地進(jìn)行包封，不受核酸酶的影響，進(jìn)一步提高其穩(wěn)定性；其次，微乳的透皮能力使的分子量較大的siRNA(平均分子量為13300)更容易進(jìn)入皮下；再次，微乳的乳滴是由表面活性劑構(gòu)成的雙分子層形成，而不是固體層，所以進(jìn)入皮膚后，能夠迅速釋放藥物，發(fā)揮作用；最后，微乳這種劑型具有一定粘度，適合皮膚給藥，也可以作為中間劑型進(jìn)一步制成其他劑型，如凝膠、乳膏等劑型使用等。微乳是由水相、油相、表面活性劑和助表面活性劑按適當(dāng)比例混和而自發(fā)形成的各向同性、透明、熱力學(xué)穩(wěn)定的膠體分散體系，結(jié)構(gòu)上分為水/油(W/0)、油/水(0/W)和雙連續(xù)型，液滴粒徑通常在IOnm lOOnm，既具親脂性又具親水性，與角質(zhì)層的細(xì)胞間脂質(zhì)雙分子層有更高的相容性，可穿透角質(zhì)層進(jìn)入體循環(huán)而發(fā)揮治療作用。作為一種非常有前景的經(jīng)皮給藥載體，微乳主要具有以下幾個優(yōu)點(I)W/0型則可延長水溶性藥物的釋放時間，起到緩釋作用；(2)微乳屬于熱力學(xué)穩(wěn)定體系，易于制備和保存；(3)微乳粒徑小，可采用過濾滅菌；(4)微乳液滴的特殊構(gòu)造，使經(jīng)皮給藥后的藥物釋放時間更長；(5)微乳作為包合藥物的載體可以提高藥物的穩(wěn)定性，降低藥物刺激性(① Peltola S, Saarinen-Savolainen P, Kiesvaara J, SuhonenTM, Urtti A. Microemulsions for topical delivery of estradiol. Int J Pharm. 2003Mar 26 ；254(2) :99-107.② Rhee YS, Choi JG, Park ES, Chi SC. Transdermal deliveryof ketoprofen using microemulsions. Int J Pharm. 2001 0ct9 ;228 (1-2) 161-70.③寇欣.微乳給藥系統(tǒng)的研究進(jìn)展.天津藥學(xué)，2005，17 (6) 52-5.④吳曉輝，劉玉玲等.微乳作為經(jīng)皮給藥載體的研究進(jìn)展·中國藥學(xué)雜志，2006,41(22) 681.⑤Kogan A，GartiN. Microemulsions as transdermal drug delivery vehicles. Adv Colloid InterfaceSci.2006 Nov 16 ; 123-126 :369-85. Epub2006Jul 14.)因此，微乳用于經(jīng)皮給藥已經(jīng)成為目前藥劑學(xué)研究的熱點。本課題的研究藥物為siRNA，基于siRNA為水溶性的物理性質(zhì)，我們采用W/0型微乳。而且微乳與可以經(jīng)皮給藥其他劑型，如脂質(zhì)體、納米粒相比，對于siRNA的包裹和轉(zhuǎn)運(yùn)更俱優(yōu)勢的特點在于(I)微乳是由脂質(zhì)雙分層構(gòu)成，而不是固體層，當(dāng)進(jìn)入皮內(nèi)后，由于其脂質(zhì)雙分子層的流動性和與細(xì)胞膜的親和力，將里面包裹的siRNA釋放，進(jìn)入靶細(xì)胞發(fā)揮作用，而不會象納米?；蛑|(zhì)體等載體，由于其為固體顆粒，難以透皮后釋放藥物，更容易直接進(jìn)入血液循環(huán)。(2)微乳制備工藝簡單，在制備過程中僅需要攪拌，這對于性質(zhì)不穩(wěn)定，極易被核酸酶分解且遇熱、一些試劑后易發(fā)生變性的siRNA來說非學(xué)重要，許多載體劑型的制備工藝中均含加熱和需要有機(jī)溶劑等環(huán)節(jié)，如納米粒、脂質(zhì)體的制備。所以微乳是適合包裹和經(jīng)皮膚或粘膜轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA的最佳載體劑型。本發(fā)明提供了一種siRNA微乳載體，由油相基質(zhì)、乳化劑、助乳化劑和水相基質(zhì)組成，各組分的重量百分比如下
油相基質(zhì) 40-70%
乳化劑10-20%
助乳化劑 10-20%
水相基質(zhì) 5-20%，其中的油相基質(zhì)選自辛酸甘油三酯或癸酸甘油三酯；其中的乳化劑(表面活性劑)是聚甘油-6雙異油酸酯；其中的助乳化劑(助表面活性劑)是聚乙二醇-8辛酸酯或聚乙二醇-8癸酸酯；其中的水相基質(zhì)是無酶水(RNase, DNase-free water)；微乳為W/0型，siRNA包封在水相中。上述的siRNA微乳載體，較佳地，油相基質(zhì)乳化劑助乳化劑水相基質(zhì)的重量百分比為 50-60% 15-20% 15-20% 10-15%。最佳地，一種siRNA微乳載體，其配方及配比具體如下
油相基質(zhì)辛酸/癸酸甘油三酯5.6 g
乳化劑聚甘油-6雙異油酸酯1.7 g
助乳化劑聚乙二醇-8辛酸/癸酸酯 1.7 g 水相基質(zhì)無酶水I mL
共10 g本發(fā)明還提供上述siRNA微乳載體的制備方法，油相基質(zhì)及乳化劑、助乳化劑于烘箱中，60-90°C (75°C最佳)烘烤6-10小時(8小時最佳)；按比例稱取油相和乳化劑、助乳化劑，使用攪拌器攪拌混合5-20分鐘(IOmin最佳)，使混勻，在攪拌狀態(tài)下逐漸滴加水相(只滴加水相，即為空乳載體，不含siRNA，做考察用)或溶有siRNA的水相，體系開始呈現(xiàn)乳濁并有粘度增加現(xiàn)象，濁度逐漸降低，恒速攪拌至完全澄清，為均一無色澄清液體，即成siRNA微乳。于4°C或_20°C儲存?zhèn)溆谩?br> 上述制備方法中為防止RNA酶污染，在微乳配制過程中，所有使用的藥品、容器、材料均需無酶處理或本身為無酶產(chǎn)品。其中制備微乳所用的油相及兩種乳化劑于烘箱中，75°C烘烤8h ;金屬容器于烘箱中180°C烘烤3h ;塑料、膠皮及其他不耐高溫的材料于O. 1% DEPC水中浸泡24h，可以耐受高溫高壓的再120°C，20min滅菌；一次性材料使用無酶產(chǎn)品。本發(fā)明的siRNA微乳載體可將一種或多種人工合成的與特定疾病相關(guān)的基因的siRNA包封于W/0型微乳的脂質(zhì)雙分子層中，形成siRNA微乳，將微乳局部給藥于皮膚或粘膜，將siRNA帶入皮內(nèi)、皮下或粘膜下，并且使siRNA較長時間儲留在皮內(nèi)、皮下或粘膜下，進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致疾病相關(guān)基表達(dá)的下調(diào)從而起到治療作用，也可使siRNA經(jīng)皮進(jìn)入血液循環(huán)，發(fā)揮系統(tǒng)性基因敲除效應(yīng)而達(dá)到治療疾病的目的，亦可用于基因表達(dá)相關(guān)的科學(xué)研究。本發(fā)明的技術(shù)方案既要能夠有利于保護(hù)siRNA的穩(wěn)定性，又要有利于其順利透過皮膚，其特點是(I)微乳可以將溶于無酶水的siRNA很好地進(jìn)行包封，不受核酸酶的影響， 進(jìn)一步提高其穩(wěn)定性；(2)微乳的透皮能力使的分子量較大的siRNA(平均分子量為13300)更容易進(jìn)入皮下；(3)微乳的乳滴是由表面活性劑構(gòu)成的雙分子層形成，而不是固體層，所以進(jìn)入皮膚后，能夠迅速釋放藥物，發(fā)揮作用；(4)微乳的制備條件溫和，制備時間短，僅需要攪拌即可形成，有利于保護(hù)對外界環(huán)境敏感的siRNA的活性；(5)利用其緩釋作用使siRNA滯留于皮膚功粘膜的時間更長，則siRNA與皮膚及粘膜細(xì)胞充分接觸，提高細(xì)胞攝取量，提高靶向基因敲除效率；(6)具有一定粘度，適合皮膚給藥，也可以作為中間劑型進(jìn)一步制成其他劑型，如凝膠、乳膏等劑型使用；(7)即可作為皮膚和粘膜組織內(nèi)基因敲除的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，又可作為以系統(tǒng)性基因敲除為目的的發(fā)揮全身作用的siRNA載體。此外，通過以下實施例證實，本發(fā)明所制備的siRNA微乳載體，可以將siRNA包封于微乳載體中，形成規(guī)則、均一的熱力學(xué)穩(wěn)定體系，粒徑小至納米級，有利于透過皮膚。zeta電位為正電，易于與帶負(fù)電的細(xì)胞膜親和，而產(chǎn)生滲透作用。該載體的包封作用還延長了siRNA藥物在皮內(nèi)的滯留時間，為其在皮內(nèi)或皮下充分發(fā)揮作用提供了有利條件。該微乳載體很大程度上保護(hù)了 siRNA的穩(wěn)定性，使其生物學(xué)活性保持較長時間，這也是作為藥物需要有一定貯備時間所必須的。其凍存于_20°C，微乳仍然保持其特性而沒有破乳等情況發(fā)生，提示該類藥物還可冷凍保存，這對siRNA穩(wěn)定性的提高又是一有利條件。模型藥物eotaxin特異的siRNA微乳證實了其可以將eotaxin特異的siRNA帶入皮內(nèi)，發(fā)揮療效。因此，本發(fā)明所制備的siRNA微乳載體可以完全達(dá)到對siRNA藥物保護(hù)及經(jīng)皮轉(zhuǎn)運(yùn)作用，發(fā)揮siRNA的治療效果，作為siRNA藥物的有效載體劑型。


圖I :siRNA微乳偽三元相2 =SiRNA微乳外觀及包封情況其中A為微乳類型判定染色實驗，B為激光共聚焦顯微鏡下微乳形態(tài)及包封效果觀察，C為冷凍蝕刻技術(shù)處理后透射電鏡下微乳形態(tài)觀察圖3 =SiRNA微乳理化性質(zhì)考察其中A為粒徑測量，B為zeta電位測量，C為粘度測量圖4 =SiRNA微乳透皮吸收及消除速率考察
其中A為微NC-FAM siRNA乳透皮吸收過程，B為NC-FAM siRNA微乳皮內(nèi)消除過程，C為NC-FAM siRNA皮下注射后消除過程圖5 :模型藥物嗜酸粒細(xì)胞趨化因子(eotaxin) siRNA微乳(ESM)生物效應(yīng)穩(wěn)定性
考察其中A為不同時間ESM及eotaxin水溶液對細(xì)胞中eotaxin mRNA敲除效果檢測，B為不同時間ESM及eotaxin水溶液對細(xì)胞中eotaxin蛋白分泌量的影響圖6 =ESM對接觸性皮炎(AOT)模型小鼠皮膚組織中eotaxin分泌的抑制作用其中A為ESM對小鼠A⑶模型皮膚中eotaxin mRNA表達(dá)的影響，B為ESM對小鼠A⑶模型皮膚中eotaxin蛋白表達(dá)的影響
具體實施方式
現(xiàn)結(jié)合實施例和說明書附圖對本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實施不僅限于此。實施例I :NC-FAM siRNA微乳的制備為防止RNA酶污染，在微乳配制過程中，所有使用的藥品、容器、材料均需無酶處理或本身為無酶產(chǎn)品。其中制備微乳所用的油相及兩種乳化劑于烘箱中，75°C烘烤8h ;金屬容器于烘箱中180°C烘烤3h ;塑料、膠皮及其他不耐高溫的材料于0. 1% DEPC水中浸泡24h，可以耐受高溫高壓的再120°C，20min滅菌；一次性材料使用無酶產(chǎn)品。NC-FAM siRNA微乳配方及配比
NC-FAM siRNA400 pg
無酶水I mL
辛酸甘油三酯5.4 g
聚甘油-6雙異油酸酯1.8 g
聚乙二醇-8辛酸酯1.8 g
共IOg制備方法為設(shè)計任意序列的siRNA (NC siRNA)，并加以羧基熒光素(FAM)修飾，成NC-FAM siRNA，將其溶于無酶水中。按上述比例稱取油、乳化劑和助乳化劑，使用磁力攪拌器攪拌混合lOmin，使混勻，在攪拌狀態(tài)下逐漸滴加溶有NC-FAM siRNA的水相，體系開始呈現(xiàn)乳濁并有粘度增加現(xiàn)象，之后濁度逐漸降低，恒速攪拌至完全澄清，為均一無色澄清液體，即成NC-FAM siRNA微乳。于4°C或_20°C儲存?zhèn)溆?。本實施例制備了一種熒光標(biāo)記的任意序列的SiRNA微乳，可用于科研探索，如實施例5中用于微乳形態(tài)和包封效果的考察，實施例6中用于觀察其微乳的透皮效果。凡需要熒光檢測，包括定量和定性觀察等要求，均可以此作為一個研究工具來使用。使微乳的質(zhì)量評價指標(biāo)更豐富和易于掌握。實施例2 :eotaxin siRNA微乳的制備為防止RNA酶污染，在微乳配制過程中，所有使用的藥品、容器、材料均需無酶處理或本身為無酶產(chǎn)品。其中制備微乳所用的油相及兩種乳化劑于烘箱中，75°C烘烤8h ;金屬容器于烘箱中180°C烘烤3h ;塑料、膠皮及其他不耐高溫的材料于0. 1% DEPC水中浸泡24h，可以耐受高溫高壓的再120°C，20min滅菌；一次性材料使用無酶產(chǎn)品。Eotaxin siRNA微乳配方及配比
Eotaxin siRNA800 pg
無酶水0.8 mL
癸酸甘油三酯5.4 g
聚甘油-6雙異油酸酯1.9 g
聚乙二醇-8癸酸酯1.9 g
共IOg制備方法為設(shè)計eotaxin 特異的 siRNA,即 eotaxin siRNA(按 NCBI GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中序列 Accession Number 為 NM_011330 的 Mus musculus smallchemokine (C_C motif) ligand 11 (CCLll)mRNA(982bp)設(shè)計，Sense strand :5，GCU UUAUCA UGA CCA GUA ATT 3，；Antisense strand :5，UUA CUG GUC AUG AUA AAG CAG 3，)，將其溶于無酶水中。按上述比例稱取油、乳化劑和助乳化劑，使用磁力攪拌器攪拌混合lOmin，使混勻，在攪拌狀態(tài)下逐漸滴加溶有eotaxin siRNA的水相，體系開始呈現(xiàn)乳濁并有粘度增加現(xiàn)象，之后濁度逐漸降低，恒速攪拌至完全澄清，為均一無色澄清液體，即成eotaxin siRNA微乳。于4°C或_20°C儲存?zhèn)溆?。實施? STAT6siRNA微乳的制備SATA6siRNA微乳配方及配比
STAT6 siRNA800 μ g
辛酸甘油三酯6.6 g
聚甘油-6雙異油酸酯1.2g
聚乙二醇-8癸酸酯1.2 g
無酶水ImL
共10 gSTAT6 (Signal transducers and activators of transcription 6,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子6)特異的siRNA,即STAT6siRNA,序列參考Rippmann JF等的報道(RippmannJF,Schnapp A,Weith A,Hobbie S. Gene silencing with STAT6specific siRNAs blockseotaxin release in IL-4/TNFalpha stimulated human epithelial cells.FEBSLett. 2005Jan 3 ；579(1) :173-8.)，Sense strand :5，CAG UUC CGC CAC UUG CCA ATT 3，；Antisense strand :5’ UUG GCA AGU GGC GGA ACU GTT3’。其余同實施例 2。實施例4 C0X-2siRNA微乳的制備C0X_2siRNA微乳配方及配比COX-2 siRNA800 μ g
辛酸甘油三酯5.6 g
聚甘油-6雙異油酸酯1.7g
聚乙二醇-8癸酸酯1.7 g
無酶水ImL 共10 g設(shè)計C0X-2 (Cycloxygenase-2,環(huán)氧化酶-2)特異的 siRNA,即COX-2 si RNA (GenBank Accession No NM_000963), 5; -CUGCUCAACACCGGAAUUUtt-3'，其余同實施例2。 實施例5 :本發(fā)明的siRNA微乳載體的產(chǎn)品質(zhì)量評定(I)偽三元相圖將一對實施例I中NC siRNA作為siRNA藥物，溶于水相，用于制備微乳。將乳化劑聚乙二醇-8辛酸/癸酸酯、助乳化劑聚甘油-6雙異油酸酯和油相辛酸/癸酸甘油三酯不同比例混勻，于室溫滴加水相，觀察系統(tǒng)由澄清變混濁，由混濁變澄清的臨界點，用0rigin7. O軟件繪制偽三元相圖，圖1，其陰影區(qū)域為可以成乳的區(qū)域。(2)微乳類型采用染色法(安紅麗，歐陽五慶，等.非離子型表面活性劑微乳的研制.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)· 2007, 35 (3) :65-9. Watnasirichaikul S, Davies NM,Rades T，Tucker IG. Preparation of biodegradable insulin nanocapsules frombiocompatible microemulsions. Pharm Res. 2000Jun ; 17 (6) :684-9.)鑒別 siRNA 微乳的類型。取相同體積的siRNA微乳，同時分別加入蘇丹紅III染料(和亞甲藍(lán)染料溶液各兩滴，觀察兩種染料在微乳中的擴(kuò)散速度以及外觀變化，確定微乳的類型。如圖2-A，油溶性的蘇丹紅滴入到微乳中后，很快在作為外相的油相中形成均一的溶液，而水溶性的亞甲藍(lán)則無法與油相相溶，以液滴形式分散在微乳中，證明所制備的微乳為W/0型。(3)包封情況將實施例I中NC-FAM siRNA微乳(40 μ g/mL)及空乳各I滴于激光共聚焦顯微鏡下觀察液體內(nèi)熒光分布情況。如圖2-B，視野中為密集的圓形綠色熒光亮點，大小均勻，證明siRNA可以很好地包裹于微乳之中。不載藥的空乳(圖2-B-a)在鏡下視野中則無熒光斑點。⑷形態(tài)觀察米用冷凍蝕刻技術(shù)處理NC siRNA微乳樣品，于透射電鏡下觀察,如圖2-C,微乳顆粒基本為大小均一的球形。(5)粒徑、zeta電位和粘度我們考察了 NC siRNA于制備完成時及于4°C放置3個月后(平衡至室溫)的粒徑(圖3-A)、zeta電位(圖3_B)、粘度(圖3_C)等理化參數(shù)，沒有顯著性差異，說明微乳在一定時間內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。用粒度儀測得其平均粒徑約為50nm，呈正態(tài)分布，分散系數(shù)為
0.075，表明該制劑粒徑小且均一。其zeta電位顯示帶正電。且粘度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于水(20°C時為I.005mPa. s)，說明其附著力較強(qiáng)，可以用于皮膚給藥。結(jié)果見表I。表I :siRNA微乳理化性質(zhì)考察(η = 3)
存貝士時間粒徑(nm)Zeta電位mV) 粘度(mPa.s)
^Od50.4±3.264.32士2.7886.30±1.68
3 mon49.5±2.765.82±2.0988.73±1.34實施例6 :本發(fā)明的siRNA微乳載體的透皮效果考察 將40 μ LNC-FAM siRNA微乳(200 μ g/mL)涂于裸鼠背部皮膚，將裸鼠置于小動物整體成像系統(tǒng)中(異氟烷吸入呈麻醉狀態(tài))，至熒光強(qiáng)度增至最強(qiáng)，即透皮吸收與體內(nèi)消除達(dá)平衡狀態(tài)。在siRNA微乳透皮吸收已達(dá)峰值時，將背部微乳用棉簽輕輕拭去，每間隔一定時間拍照一次，至皮下熒光全部消失。同時設(shè)對照組，皮下注射40 μ L NC-FAM siRNA水溶液，觀察熒光消失速度。比較兩者皮下消除的時間。如圖4-A，NC-FAM siRNA微乳皮下吸收Ih 2h可達(dá)至高峰。如圖4-B，NC-FAM siRNA微乳并可于皮下保持約5h。如圖4-C，NC-FAM siRNA水溶液皮下注射組只可以在皮下維持2h 3h，說明微乳具有延長siRNA在 皮下滯留時間的作用。實施例7 :本發(fā)明的siRNA微乳載體穩(wěn)定性實驗嗜酸粒細(xì)胞趨化因子(eotaxin)在皮膚過敏性疾病中趨化嗜酸粒細(xì)胞的重要因子(Palframan RT, Collins PD, Williams TJ, Rankin SM. Eotaxin induces a rapidrelease of eosinophils and their progenitors from the bone marrow. Blood. 1998Aprl ；91(7) :2240-8.)，且腫瘤壞死因子-a (TNF- a )可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞中eotaxin的產(chǎn)生(Matsukura S, Stellato C, Plitt JR, Bickel C, Miura K, Georas SN, Casolaro V,Schleimer RP. Activation of eotaxin gene transcription by NF—kappa B and STAT6in human airway epithelial cells. J Tmmunol.19 Dec 15 ；163 (12) :6876-83.)。實施例2將eotaxin作為祀基因，設(shè)計eotaxin特異的siRNA,并制備eotaxin特異的siRNA微乳(ESM)將微乳，同時對照組為相同濃度的eotaxin siRNA的水溶液(ES)，與ESM做相同處理。成品置于4°C,于不同時間點(2wk、4wk、6wk、8wk、10wk、12wk)取出進(jìn)行檢測，另一組于_20°C儲存16wk。微乳中eotaxin生物活性檢測方法如下采用小鼠成纖維細(xì)胞株NIH3T3細(xì)胞做為模型細(xì)胞。首先將微乳進(jìn)行破乳，取水層，用Am-blue法檢測使siRNA成IOOnM時對NIH3T3細(xì)胞的生存性無顯著影響，48h生存率大于90%。并將保存了不同時間的微乳破乳后取水層，作用于正常細(xì)胞和TNF- α刺激的細(xì)胞，檢測eotaxin敲除效率,real-time PCR法檢測eotaxin mRNA的表達(dá)(見圖5_A),ELISA檢測eotaxin蛋白的分泌情況(見圖5-B)，來判定微乳中siRNA的生物活性。研究表明在IOwk內(nèi)，微乳可以很好地保護(hù)siRNA不受外界核酸酶的影響，依然保持對目的基因的干擾活性，在12wk時其活性有下降趨勢，但仍未形成統(tǒng)計學(xué)差異。而儲存于_20°C 16wk的兩組微乳樣品中的eotaxinsiRNA活性沒有下降,但ES組中eotaxin siRNA的活性只能保持4wk左右。實施例8 :模型產(chǎn)品藥效學(xué)驗證制備小鼠接觸性皮炎(AO))動物模型(NagaiH, UedaY, Tanaka H, Hirano Y,Nakamura N,Inagaki N,Takatsu K,Kawada K. Effect of overproduction of interleukin5 on dinitrofluorobenzene-induced allergic cutaneous response in mice. JPharmacol Exp Ther. 1999 Jan ;288 (I) :43-50.),于小鼠皮膚過敏反應(yīng)激發(fā)前 24h 給藥,20 μ L實施例2制備得到的eotaxin特異的siRNA微乳(ESM，40 μ g/mL)涂于鼠耳，每8h給藥一次，共給藥三次，觀察ESM對小鼠過敏皮膚中eotaxin表達(dá)的影響。除給藥組外，另設(shè)兩組對照組正常組和疾病模型組，采用real-time PCR法檢測小鼠皮膚中eotaxin mRNA的 表達(dá)(見圖6-A)，western blotting法檢測eotaxin蛋白的分泌情況(見圖6-B)，GAPDH為管家基因。檢測結(jié)果表明，ESM可以顯著抑制小鼠A⑶模型皮膚組織中eotaxin的上調(diào)，從在體的角度證明了其透皮效果和治療效果。
權(quán)利要求
1.一種siRNA微乳載體，由油相基質(zhì)、乳化劑、助乳化劑和水相基質(zhì)組成，各組分的重量百分比如下油相基質(zhì) 40-70%乳化劑10-20%助乳化劑 10-20%水相基質(zhì) 5-20%， 其中的油相基質(zhì)選自辛酸甘油三酯或癸酸甘油三酯； 其中的乳化劑是聚甘油-6雙異油酸酯； 其中的助乳化劑是聚乙二醇-8辛酸酯或聚乙二醇-8癸酸酯； 其中的水相基質(zhì)是無酶水； 微乳為W/0型，siRNA包封在水相中。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的siRNA微乳載體，其特征在于，各組分的重量百分比如下油相基質(zhì) 50-60%乳化劑 15-20%助乳化劑 15-20%水相基質(zhì) 10-15%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的siRNA微乳載體，其特征在于，其配方及配比具體如下油相基質(zhì)辛酸/癸酸甘油三酯5.6 g乳化劑聚甘油-6雙異油酸酯1.7 g助乳化劑聚乙二醇-8辛酸/癸酸酯 1.7 g水相基質(zhì)無酶水I mL共10 g。
4.一種如權(quán)利要求I所述的siRNA微乳載體制備方法，其特征在于，包括如下步驟油相基質(zhì)及乳化劑、助乳化劑于烘箱中，60-90°C烘烤6-10小時；按比例稱取油相和乳化劑、助乳化劑，使用攪拌器攪拌混合5-20分鐘，使混勻，在攪拌狀態(tài)下逐漸滴加溶有siRNA的水相，體系開始呈現(xiàn)乳濁并有粘度增加現(xiàn)象，濁度逐漸降低，恒速攪拌至完全澄清，為均一無色澄清液體，即成siRNA微乳。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的siRNA微乳載體制備方法，其特征在于油相基質(zhì)及乳化劑、助乳化劑于烘箱中，75°C烘烤8小時；金屬容器于烘箱中180°C烘烤3小時；塑料、膠皮及其他不耐高溫的材料于0. 1% DEPC水中浸泡24小時；一次性材料使用無酶產(chǎn)品。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的siRNA微乳載體制備方法，其特征在于制備得到的siRNA微乳于4°C或_20°C儲存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，目前尚無siRNA的經(jīng)皮給藥的給藥模式，因為缺乏經(jīng)皮給藥的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。本發(fā)明的目的是提供一種可將特定疾病相關(guān)基因的siRNA包封于其中的經(jīng)皮轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)——siRNA微乳載體，該siRNA微乳載體不僅保護(hù)了包封其中的siRNA的穩(wěn)定性而且透皮能力強(qiáng)。本發(fā)明的另一目的是提供該siRNA微乳載體制備方法。本發(fā)明提供一種siRNA微乳載體其油相∶乳化劑∶助乳化劑∶水相的比例為40-70％∶10-20％∶10-20％∶5-20％。本發(fā)明siRNA微乳載體可將大分子siRNA包封于水相之中，經(jīng)皮及粘膜將siRNA帶入皮膚和粘膜，解決了siRNA經(jīng)皮轉(zhuǎn)運(yùn)的問題，同時大提高了siRNA的穩(wěn)定性，可用于siRNA藥物的開發(fā)及科研應(yīng)用。
文檔編號A61K47/34GK102805726SQ20121008724
公開日2012年12月5日 申請日期2012年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月29日
發(fā)明者胡晉紅, 彭程 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)