專利名稱：一種建立多能人胚泡衍生的干細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于建立多能人胚泡衍生的干細胞(BS)細胞系的方法，所述方法獲得的干細胞，所述細胞向分化細胞的分化，分化的細胞，以及所述分化的細胞在制備藥物中的用途?？蓪⑽捶只亩嗄芨杉毎只啥喾N特化的細胞類型，其可用于制備治療如下病癥或病情的藥物，所述病癥或病情涉及組織退化(例如胰腺退化導(dǎo)致例如糖尿病的形成)或CNS退化(例如阿爾茨海默癥、帕金森氏癥等)或由例如中風(fēng)或物理創(chuàng)傷引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化。
背景技術(shù)：
干細胞是具有獨特能力的一種細胞類型，其能自我更新，且可以形成特化或分化的細胞。盡管大多數(shù)機體的細胞，如心臟細胞或皮膚細胞被委以執(zhí)行特定功能，干細胞是未被委派的，直到其接受形成一種特化細胞類型的信號。干細胞的獨特之處在于其繁殖能力，以及其可變?yōu)樘鼗偷哪芰?。多年來，研究人員一直致力于尋找使用干細胞替代受損或患病的細胞和組織的途徑。目前，多數(shù)研究集中在兩類干細胞上胚胎干細胞和體干細胞。胚胎干細胞衍生自預(yù)植入的受精卵母細胞，即胚泡，而體干細胞存在于成體器官如骨髓、表皮和腸中。多能性測試顯示胚胎或胚泡衍生的干細胞(以下稱為胚泡衍生的干細胞或BS細胞)可形成器官中的所有細胞(包括生殖細胞)，體干細胞則只具有有限的能力以形成后代細胞類型。
1998年，研究人員首次能夠從人受精卵母細胞中分離BS細胞，且將其在培養(yǎng)基中生長(見如美國專利5,843,780和6,200,806)。在上述專利說明書中所使用的方法依賴于使用帶有完整透明帶的胚泡。此外，在所述專利中公開的方法特別使用了內(nèi)細胞團細胞，其業(yè)已經(jīng)免疫切除法分離以置于小鼠胚胎飼養(yǎng)細胞上。該方法具有多種缺陷，例如，其費時，技術(shù)上困難且干細胞產(chǎn)率低?？傊?，上述缺陷使所述方法為昂貴的方法。
目前，只有兩篇關(guān)于hBS細胞的建立和表征的文章發(fā)表，數(shù)目之低顯示了與從人胚泡建立這些干細胞相關(guān)的許多意想不到的困難。結(jié)果，僅可得非常少的hBS細胞系。本發(fā)明描述了一種制備hBS細胞系的方法，以及一系列獨立的方法步驟的組合，所述方法步驟單獨不足以衍生hBS細胞，但一起使用時，它們構(gòu)成了hBS細胞之成功衍生的最低要求。
此外，本發(fā)明還允許由孵化的和完整的胚泡成功衍生hBS干細胞，以及在將胚泡種板于飼養(yǎng)細胞上后hBS細胞系的衍生。
前述已有方法的困難之一在于實現(xiàn)胚泡在飼養(yǎng)細胞上的高效附著。這導(dǎo)致了終產(chǎn)物細胞的低產(chǎn)率。本發(fā)明克服了上述困難。
也許，hBS細胞力所能及的潛在應(yīng)用是產(chǎn)生可用于所謂細胞治療的細胞和組織。許多疾病和紊亂源自細胞功能的破壞或機體組織的結(jié)構(gòu)喪失。今天，捐贈的器官和組織經(jīng)常用于替換生病或受損的組織。然而，患有適于通過上述方法治療的疾病的人數(shù)遠遠超過可供移值的器官數(shù)。hBS細胞的可得性以及引導(dǎo)所述細胞形成不同細胞(如產(chǎn)胰島素β-細胞，心肌細胞和產(chǎn)多巴胺神經(jīng)元)的命運之有效方法的大力研究，為將來在退化性疾病(如糖尿病、心肌梗塞和帕金森氏癥)的基于細胞的治療上的應(yīng)用提供了日益增長的可能性。
發(fā)明描述本發(fā)明人建立了用于從受精卵母細胞建立多能人胚泡衍生的干細胞系的方法，包括在未分化狀態(tài)中細胞系的增殖。
因此，本發(fā)明涉及一種獲得多能人胚泡衍生的干細胞系的方法，包括步驟i)利用任選的具有1級或2級的受精的卵母細胞，以獲得任選的具有A級或B級的胚泡；ii)將胚泡與飼養(yǎng)細胞共培養(yǎng)，以建立內(nèi)細胞團細胞的一個或多個集落；
iii)通過機械切開分離內(nèi)細胞團細胞；iv)將內(nèi)細胞團細胞與飼養(yǎng)細胞共培養(yǎng)，以獲得胚泡衍生的干細胞系；v)任選的，擴增胚泡衍生的干細胞系。
由上述，本發(fā)明的一個目的為提供一種建立未分化的人胚泡衍生的干細胞系的方法。作為此方法的起始材料，使用受精的卵母細胞。受精卵母細胞的質(zhì)量對所得胚泡的質(zhì)量很重要。
在本發(fā)明的方法中，按如下方法進行胚泡的建立和評估。在方法步驟i)中，人胚泡可衍生自冷凍或新鮮的人體外受精卵母細胞。下面描述了篩選用于本發(fā)明方法中的合適卵母細胞的步驟。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本方法之重要的成功標準是卵母細胞的正確選擇。因此，如果僅應(yīng)用3級卵母細胞，獲得滿足一般性要求(見下述)的hBS細胞系的可能性就低。
捐獻的新鮮受精卵細胞于第0日將卵母細胞在Asp-100(Vitrolife)中抽吸，在第1日于IVF-50(Vitro life)中受精。基于第3日的形態(tài)和細胞分裂評估受精的卵母細胞。下表用于受精卵母細胞的評估1級受精卵母細胞均為卵裂球，無碎片；2級受精卵母細胞＜20％的碎片；3級受精卵母細胞＞20％的碎片。
于第3日評估后，受精的1級和2級卵母細胞或植入或冷凍貯存。受精的3級卵母細胞移入ICM-2(Vitrolife)。進一步將受精的卵母細胞培養(yǎng)3-5天(即，受精后5-7天)。按下表評估胚泡A級胚泡擴增，于第6日帶有獨立的內(nèi)細胞團(ICM)，B級胚泡不擴增，但其它方面類似于A級，C級胚泡無可見ICM。
捐贈的冷凍受精卵母細胞；于第2日(受精后)受精卵母細胞于4細胞期利用Freeze-kit(Vitrolife)冷凍。在液氮中貯存冷凍的受精卵母細胞。在5年限期滿前取得捐贈人的知情同意。利用Thaw-kit(Vitrolife)融化受精的卵母細胞，自第2天起按照上述步驟操作。
如前述，新鮮的受精細胞來自3級質(zhì)量，而冷凍的受精卵母細胞來自1級和2級，依本發(fā)明方法所得的數(shù)據(jù)，發(fā)育成胚泡的新鮮受精卵母細胞的百分比為19％，而50％的冷凍受精卵母細胞發(fā)育成胚泡。這意味著冷凍的受精卵母細胞對于獲得胚泡而言更好，這可能是由于受精卵母細胞的質(zhì)量更高。衍生自新鮮的受精卵母細胞的胚泡中11％發(fā)育成干細胞系，而衍生自冷凍的受精卵母細胞的胚泡中15％發(fā)育成干細胞系?？傊?，在經(jīng)培養(yǎng)的受精卵母細胞中，2％的新鮮受精卵母細胞發(fā)育成干細胞系，7％的冷凍受精卵母細胞發(fā)育成干細胞系。
受精卵母細胞至胚泡階段的培養(yǎng)之進行參照本領(lǐng)域周知的方法。用于制備胚泡的方法參見Gardner等人，Embryo culture systems，InTrounson，A.O.和Gardner，D.K.(編)，Handbook of in vitro fertilization，第二版，CRC Press，Boca Raton，pp.205-264；Gardner等人，F(xiàn)ertil.Steril.，74，Suppl3，O-086；Gardner等人，HumReprod.，13，3434，3440；Gardner等人，J.Reprod.Immunol.，In press，和Hooper等人，Biol Reprod，62，Suppl1，249。
在步驟i)中任選地衍生自1級或2級的受精卵母細胞的胚泡建立后，具有A級或B級的胚泡與飼養(yǎng)細胞共培養(yǎng)，以建立一個或多個內(nèi)細胞團細胞集落。在種板于飼養(yǎng)細胞上后，監(jiān)測其生長，且當(dāng)集落足夠大以手工傳代時(種板后約1-2周)，細胞可與其它類型的細胞分開，通過在新飼養(yǎng)細胞上生長而擴增。內(nèi)細胞團細胞的分離通過機械切開而實行，其可通過利用玻璃毛細管作為切割工具來進行。內(nèi)細胞團細胞的檢測可容易地通過顯微鏡目測完成，且相應(yīng)的，不需要使用任何用酶和/或抗體損壞或移去滋養(yǎng)外胚層的對卵母細胞的處理。
因此，本方法避免了使用免疫切除術(shù)。通過比較使用免疫切除術(shù)與可保持滋養(yǎng)外胚層完整的本方法的成功率，發(fā)現(xiàn)免除免疫切除術(shù)的本方法更簡便、快捷且非創(chuàng)傷方法，比免疫切除術(shù)更有效率。新方法允許制備這樣的干細胞系，其分化更有商業(yè)實用性。由總共122個胚泡共建立19個細胞系(15.5％)。用免疫切除法處理42個胚泡，其中6個成功建立了細胞系(14％)。用本方法處理的80個胚泡，其中建立了13個細胞系(16％)。
在切開內(nèi)細胞團后，內(nèi)細胞團細胞與飼養(yǎng)細胞共培養(yǎng)，以獲得胚泡衍生的干細胞(BS)細胞系。在獲得BS細胞系后，任選的增殖細胞系以擴增細胞的量。因此，本發(fā)明涉及上述方法，其中，增殖胚泡衍生的干細胞系。一方面，本發(fā)明涉及如下方法，其中胚泡衍生的干細胞系的增殖包括每4-5天的干細胞系傳代。如果傳代前干細胞系的培養(yǎng)長于4-5天，不希望的細胞分化之可能性增加。
細胞傳代的具體方法見實施例5。
可從自發(fā)孵化的胚泡或從擴增的具有完整的透明帶之胚泡中分離hBS細胞系。因此，本發(fā)明涉及如上述方法，其中步驟i)中的胚泡是自發(fā)孵化的胚泡。對于孵化的胚泡，滋養(yǎng)外胚層可保持完整。孵化的胚泡或具有移除或部分移除的透明帶之胚泡可置于滅活的飼養(yǎng)細胞上。
在步驟ii)之前，例如通過用一種或多種酸化劑，如ZDTM-10(Vitrolife，Gothenburg，瑞典)、一種或多種酶或酶混合物(如鏈霉蛋白酶)處理，可至少部分消化或化學(xué)折皺(frill)胚泡的透明帶。
對帶有完整透明帶的胚泡的短暫鏈霉蛋白酶(Sigma)處理造成透明帶的移除。也可使用與鏈霉蛋白酶之蛋白酶活性相同或相似的其它類型的蛋白酶。在鏈霉蛋白酶處理后可將胚泡平板接種于所述滅活的飼養(yǎng)細胞上。
在本發(fā)明一個實施方案中，步驟ii)和/或步驟iv)可以在一種試劑中進行，所述試劑改善胚泡和/或有關(guān)的內(nèi)細胞團細胞對飼養(yǎng)細胞的附著。
適于此目的的物質(zhì)是透明質(zhì)酸。
適于將胚泡種于飼養(yǎng)細胞上的培養(yǎng)基可為BS培養(yǎng)液，其可補加透明質(zhì)酸，所述培養(yǎng)液似乎可促進胚泡在飼養(yǎng)細胞上的附著和內(nèi)細胞團的生長。透明質(zhì)酸(Hyaluronan，HA)是關(guān)節(jié)中胞外基質(zhì)的重要葡糖胺聚糖組成成分。其似乎通過與至少兩種細胞表面受體CD44和針對HA介導(dǎo)的運動之受體(RHAMM)以及胞外基質(zhì)中的蛋白的結(jié)合相互作用顯示其生物學(xué)作用。在hBS細胞建立過程中，HA的積極作用可通過其與細胞膜中磷脂的表面活性劑極性頭部的相互作用顯示，由此穩(wěn)定表面活性劑層，且因此降低胚泡或內(nèi)細胞團的表面張力，其可導(dǎo)致與飼養(yǎng)細胞結(jié)合的效率增加?；蛘撸琀A可與其在內(nèi)細胞團或胚泡上的受體結(jié)合和/或與飼養(yǎng)細胞結(jié)合，且顯示對附著和內(nèi)細胞團生長有積極影響的生物學(xué)作用。由此，除了透明質(zhì)酸，可以改變液體表面張力或以其它方式影響胚泡和飼養(yǎng)細胞之間的相互作用之其它試劑也可使用。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)對于hBS細胞系建立也很重要。在一個實施方案中，胚泡衍生的干細胞系的增殖包括最多3次，例如最多2次的飼養(yǎng)細胞傳代。
用于本發(fā)明方法的合適的飼養(yǎng)細胞為胚胎飼養(yǎng)細胞。在根據(jù)本發(fā)明的一個方法中，在步驟ii)和iv)中采用的飼養(yǎng)細胞是相同或不同的，且來自諸如包括人、小鼠、大鼠、猴子、倉鼠、蛙、兔等在內(nèi)的任一哺乳動物的動物來源。優(yōu)選來自人或小鼠的飼養(yǎng)細胞。
獲得滿足一般性要求的hBS干細胞系的另一重要標準為培養(yǎng)胚泡的條件。胚泡衍生的干細胞系可相應(yīng)地通過用飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)干細胞而增殖，其中所述飼養(yǎng)細胞的密度小于約60,000個細胞/cm2，如小于約55,000個細胞/cm2，或小于約50,000個細胞/cm2。在一個特定實施方案中，胚泡衍生的干細胞系的增殖包括用密度約45,000個細胞/cm2的飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)干細胞。這些數(shù)值適用于使用小鼠飼養(yǎng)細胞的情形，且預(yù)期對于其它類型的飼養(yǎng)細胞也能找到合適的密度。基于本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠找出所述合適的密度。
在依本發(fā)明的方法中，飼養(yǎng)細胞可以為有絲分裂失活的，以避免飼養(yǎng)細胞不希望的生長。
由本發(fā)明獲得的胚泡衍生的干細胞系維持了自我更新和在適當(dāng)時期內(nèi)的多能性，且相應(yīng)地，其在適當(dāng)?shù)臅r期內(nèi)穩(wěn)定。在本文中，術(shù)語“穩(wěn)定”意指當(dāng)于有絲分裂失活的胚胎飼養(yǎng)細胞上生長時在未分化狀態(tài)中保持增殖能力超過21個月。
由本發(fā)明獲得的干細胞系滿足一般性要求。因此，該細胞系i)當(dāng)于有絲分裂失活的胚胎飼養(yǎng)細胞上生長時，顯示在未分化狀態(tài)中的增殖能力超過21個月，且ii)顯示正常的整倍體染色體核型，且iii)維持在體內(nèi)和體外發(fā)育成胚層的所有類型衍生物的潛力，且
iv)顯示至少兩種如下的分子標記，OCT-4，堿性磷酸酶，糖表位SSEA-3，SSEA-4，TRA1-60，TRA1-81，和由單克隆抗體GCTM-2識別的硫酸角蛋白/硫酸軟骨素外周細胞基質(zhì)蛋白聚糖的蛋白質(zhì)核心，且v)不顯示分子標記SSEA-1或其它分化標記，且vi)保留其多能性且當(dāng)注射入無免疫應(yīng)答的小鼠中形成畸胎瘤，且vii)能分化。
根據(jù)本發(fā)明之未分化的hBS細胞由下列標準定義其從人植入前受精卵母細胞，即胚泡中分離；且當(dāng)在有絲分裂失活的飼養(yǎng)細胞上生長時在未分化狀態(tài)中顯示增殖能力；顯示正常染色體核型；表達未分化hBS細胞的典型標記，如OCT-4，堿性磷酸酶，糖表位SSEA-3，SSEA-4，TRA1-60，TRA1-81，和由單克隆抗體GCTM-2識別的硫酸角蛋白/硫酸輪骨素外周細胞基質(zhì)蛋白聚糖的蛋白質(zhì)核心，且不顯示任何糖表位SSEA-1或其它分化標記的表達。此外，體外和體內(nèi)(畸胎瘤)多能性測試顯示分化成所有胚層的衍生物。
由上述，本發(fā)明是一種基本上純的多能hBS細胞制劑，其i)顯示當(dāng)于有絲分裂失活的胚胎飼養(yǎng)細胞上生長時在未分化狀態(tài)中的增殖能力超過21個月；ii)顯示正常的整倍體染色體核型；iii)維持在體內(nèi)和體外發(fā)育成胚層所有類型衍生物的潛力；iv)顯示至少兩種如下的分子標記，OCT-4，堿性磷酸酶，糖表位SSEA-3，SSEA-4，TRA1-60，TRA1-81，和由單克隆抗體GCTM-2識別的硫酸角蛋白/硫酸軟骨素外周細胞基質(zhì)蛋白聚糖的蛋白質(zhì)核心；v)不顯示分子標記SSEA-1或其它分化標記；vi)保留其多能性且當(dāng)注射入無免疫應(yīng)答的小鼠中形成畸胎瘤；和vii)能分化。
檢測細胞標記的方法參見Gage，F(xiàn).H.，Science，2871433-1438(2000)。所述方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，且包括諸如RT-PCR方法，或使用針對細胞標記的抗體之免疫測定。在下文描述了檢測細胞標記的方法，雜交方法，核型分析，測定端粒酶活性以及畸胎瘤形成的方法。這些方法可用于研究根據(jù)本發(fā)明獲得的hBS細胞是否滿足上述標準。
免疫組化維持在培養(yǎng)基中的人BDP干細胞常規(guī)監(jiān)測其分化的狀態(tài)。用于監(jiān)測未分化BS細胞的細胞表面標記為SSEA-1，SSEA-3，SSEA-4，TRA1-60，TRA1-81。將hBDP干細胞固定在4％PFA中，隨后用0.5％TritonX-100滲透。用10％奶粉洗滌和封閉后，與一級抗體一起溫育細胞。充分洗滌后，將細胞與二抗一起溫育，通過DAPI染色觀察核。
堿性磷酸酶利用市售試劑盒依制造商指示(Sigma Diagnostics)確定堿性磷酸酶活性。
OCT-4RT-PCR用RT-PCR和特定基因引物套(5’-CGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTG，5’-CAAGGGCCGCAGCTTACACATGTTC)，用GAPDH作為看家基因(5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC，5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA)測定轉(zhuǎn)錄因子Oct-4的mRNA水平，原位熒光雜交(FISH)在FISH一輪中，用染色體特異性探針選擇一個或多個染色體。此技術(shù)允許檢測數(shù)量遺傳畸變，如果存在的話。為了分析，CTS使用含有針對染色體13、18、21和性染色體(X和Y)之探針的市售試劑盒(Vysis.Inc，Downers Grove，IL，USA)。對于每一細胞系，至少分析200個細胞核。細胞重懸于Carnoy’s固定劑中，且滴于帶正電的載玻片上。探針I(yè)SL 13/21與LSI雜交緩沖液混合，加至載玻片，用蓋玻片加蓋。探針CEP X/Y/18與CEP雜交緩沖液混合，且以相同方式加入另一載玻片。在70℃變性5分鐘，隨后于濕室中37℃下雜交14-20小時。在三步洗滌步驟后，用DAPI II染色核，在裝有合適的濾片和軟件的倒置顯微鏡中(Cyto Vision，Apph’ed Imagig)分析載玻片。
核型分析核型分析可以以直接方式研究所有染色體，且信息量大，可檢測數(shù)值和較大結(jié)構(gòu)畸變。為檢測鑲嵌現(xiàn)象，至少需要30個核型。然而，此技術(shù)非常耗時，且技術(shù)復(fù)雜。為改善測定條件，可通過秋水仙胺，一種合成的秋水仙素類似物和引起細胞停滯在間期的微管去穩(wěn)定劑提高有絲分裂指數(shù)，但仍需要大量的細胞(6×106個細胞/分析)。細胞在0.1μg/ml秋水仙胺的存在下培養(yǎng)1-2小時，然后用PBS洗滌和胰蛋白酶化。于1500rpm下離心10分鐘收集細胞。用乙醇和冰醋酸固定細胞，且用改進的Wrights染色觀察染色體。
競爭性基因組雜交競爭性基因組雜交(CGH)是對核型分析的補充。CGH提供了染色體之較高的分辨率，且技術(shù)上較容易。在DNA、A4、德州紅-dUTP/FITC12-dUTP和DNA聚合酶I混合物中缺口翻譯分離的DNA。進行瓊脂糖凝膠電泳以控制所得DNA片段的大小(600-2000bp)。沉淀測試和參比DNA，并重懸于含有甲酰胺、硫酸葡聚糖和SSC的雜交混合物中。在濕室中于變性載玻片上用中期進行雜交，37℃下3天。充分洗滌后，加入一滴抗退色固定混合物(Vectashield，0.1μg/ml DAPI II)，加蓋蓋玻片。隨后在顯微鏡下用影像分析系統(tǒng)評估載玻片。
端粒酶活性由于高活性被定義為BS細胞6的標準，在BS細胞系中測定端粒酶活性。已知當(dāng)細胞達到更為分化的狀態(tài)，端粒酶活性逐漸減低?；钚缘亩恳虼吮仨氠槍υ缙趥鞔蛯φ諛悠?，且可被用作檢測分化的工具。方法，端粒酶PCR ELISA試劑盒(Roche)利用端粒酶內(nèi)部活性，通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增產(chǎn)物，用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測。依制造商指示進行檢測。由該測定的結(jié)果顯示通常BS細胞的高端粒酶活性(＞1)。
細胞系保留其多能性且當(dāng)注射入無免疫應(yīng)答的小鼠，體內(nèi)形成畸胎瘤。此外，這些細胞體外可形成BS細胞衍生體。在這些模型中，可見所有胚層的細胞特征。
在無免疫應(yīng)答小鼠中畸胎瘤的形成分析hBS細胞系是否保持多能性的一個方法是將細胞異種移植入無免疫應(yīng)答小鼠以獲得腫瘤，畸胎瘤。在腫瘤中可見的多種組織類型應(yīng)代表所有三個胚層。報告顯示在衍生自異種移植的無免疫應(yīng)答小鼠的腫瘤之多種組織，如橫紋肌，軟骨和骨骼(中胚層)腸(內(nèi)胚層)和神經(jīng)玫瑰花結(jié)(外胚層)。還有，腫瘤細胞的大部分由去器官化(disorganized)組織組成。
使用嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠，缺乏B和T淋巴系細胞的一株分析畸胎瘤的形成。hBS細胞經(jīng)手術(shù)置于睪丸或在腎囊下。睪丸或腎中，以10,000-100,000個細胞的范圍移植BS細胞。理想地，一次每個細胞系用五六只小鼠。初步結(jié)果顯示，雌性小鼠比雄性小鼠更具操作后(post-operative)穩(wěn)定性，且異種移植入腎中與在睪丸中產(chǎn)生腫瘤一樣有效。因此，優(yōu)選雌性SCID-小鼠畸胎瘤模型。通常，腫瘤在約1月后可觸及。在1-4月后處死小鼠，切除腫瘤，固定用于石蠟包埋或冷凍切片。隨后腫瘤組織用免疫組化方法分析。使用所有三個胚層的特異性標記。目前使用的標記有人E-鈣粘蛋白用于區(qū)分小鼠組織和人腫瘤組織，α-平滑肌肌動蛋白(中胚層)，α-胎蛋白(內(nèi)胚層)，和β-III-微管蛋白(外胚層)。此外，對于一般形態(tài)學(xué)觀察進行蘇木精一伊紅染色。
由本發(fā)明方法獲得的hBS細胞系可用于制備分化的細胞。因此，本發(fā)明也涉及所述分化的細胞。
在另一實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的hBS細胞系具有分化成產(chǎn)胰島素細胞的能力。其可以形成胰島樣結(jié)構(gòu)，且產(chǎn)胰島素β-細胞的量一般高于25％，例如高于35％，或高于40％，或高于45％，或高于50％。
因此，在一個實施方案中，產(chǎn)胰島素細胞產(chǎn)生至少約300ng胰島素/mg總蛋白，如至少約380ng胰島素/mg總蛋白或至少約450ng胰島素/mg總蛋白。
胚泡衍生的干細胞可具有分化為分化的細胞之能力，其顯示胰腺細胞類型標記，包括至少一種胰島素、Glut-2、Pdx-1、葡糖激酶、胰高血糖素和抑生長素的表達。
另外，hBS細胞具有分化成產(chǎn)胰島素細胞的能力，其特征在于其組織成胰島樣結(jié)構(gòu)，包括一個由神經(jīng)元型細胞外層包圍的β細胞內(nèi)核，所述神經(jīng)元型細胞顯示至少一種下列神經(jīng)元細胞型標記的表達，包括神經(jīng)元特異性β-III微管蛋白(TUJ1)，NeuN，DoubleCortin，酪氨酸水解酶和Map2。
本發(fā)明的一個目的是提供可分化成少突膠質(zhì)細胞之BS干細胞的基本上純的制劑，和提供由此方法制備的少突膠質(zhì)細胞之基本上純的制劑。少突膠質(zhì)細胞可用諸如RIP、GalC或O4的細胞標記的存在來表征。
可被分化成分化的細胞之胚泡衍生的干細胞可顯示至少一種下列神經(jīng)元細胞型標記的表達，包括神經(jīng)元特異性β-III微管蛋白(TUJ1)，NeuN，DonbleCortin，酪氨酸水解酶和Map2。
另一方面，本發(fā)明涉及衍生自依本發(fā)明方法所得胚泡衍生的干細胞的分化細胞的制劑之用途，其用于制備預(yù)防或治療由組織退化引起的病理或疾病的藥物。
本發(fā)明又一目標是提供可用于制備治療和/或預(yù)防可由“細胞發(fā)生”治愈的疾病之藥物的制劑。術(shù)語“細胞發(fā)生”是指諸如下列新細胞的產(chǎn)生神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞、神經(jīng)膜細胞、星形神經(jīng)膠質(zhì)細胞、所有血細胞、軟骨細胞、心肌細胞、少突膠質(zhì)、星形神經(jīng)膠質(zhì)、和/或不同類型的上皮組織、內(nèi)皮、肝、腎、骨、結(jié)締組織、胰組織、外分泌和內(nèi)分泌腺組織細胞。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及衍生自所獲胚泡衍生的干細胞之分化的細胞制劑用于制備藥物的用途，所述藥物用于防止或治療諸如包括I型糖尿病之糖尿病的胰腺中的病理或疾病。
衍生自所獲胚泡衍生的干細胞系之分化的細胞也可用于制備預(yù)防或治療神經(jīng)系統(tǒng)中的病理或疾病的藥物。所述疾病包括多發(fā)性硬化、脊索損傷、腦病、帕金森氏癥、亨廷頓氏癥、中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷、缺氧誘發(fā)的腦損傷、缺血誘發(fā)的腦損傷、低血糖性腦損傷、神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病、腦腫瘤和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)疾病。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及實施本發(fā)明的方法之試劑盒。試劑盒至少包含在分隔的區(qū)室中的第一和第二成分。成分包括改善胚泡附著的試劑，消化試劑，BS細胞培養(yǎng)基和/或飼養(yǎng)細胞或其混合物。
試劑盒可進一步包括帶有完整透明帶的胚泡或自發(fā)孵化的胚泡。
另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生產(chǎn)胰島素分化干細胞之基本上純的制劑的方法，包括如下步驟i)通過在適當(dāng)培養(yǎng)基中失活的飼養(yǎng)細胞上生長，擴增人胚泡衍生的干細胞；ii)通過將步驟i)中形成的集落解離成較小的聚集體或單個細胞，產(chǎn)生胚泡衍生的干細胞體，隨后將所述聚集體或單個細胞移入非粘附容器，在其中于適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；iii)將容器中的胚泡衍生的干細胞體平板接種入適當(dāng)培養(yǎng)基；iv)在ITFSn培養(yǎng)基中選擇巢蛋白陽性的神經(jīng)元前體；v)在含有B27培養(yǎng)基補充物和堿性成纖維細胞生長因子的N2培養(yǎng)基中擴增胰腺內(nèi)分泌先祖細胞；vi)將培養(yǎng)基換為不含堿性成纖維細胞生長因子的N2培養(yǎng)基。
利用玻璃毛細管作為切割工具可進行手工切開。
用于本發(fā)明上述方法的人胚泡衍生的干細胞一般是如上述所獲得的那些。
更具體的，用于步驟i)中的培養(yǎng)基為人胚泡衍生的干細胞培養(yǎng)基，用于步驟ii)中的培養(yǎng)基為胚泡衍生的干細胞體培養(yǎng)基，用于步驟iii)中的是胚泡衍生的干細胞體培養(yǎng)基。
在步驟iv)后可加入煙酰胺。
本發(fā)明的試劑盒也可用于上述方法。在這種情況下，試劑盒含有在分隔區(qū)室中的至少兩種如下成分絲裂霉素C、hBS培養(yǎng)基、BS細胞體培養(yǎng)基、ITSFn培養(yǎng)基、N2培養(yǎng)基、B27培養(yǎng)基補充物、煙酰胺和bFGF。
試劑盒可進一步包含獲自本發(fā)明的基本上純的人胚泡衍生的干細胞系。
本發(fā)明還通過如下圖示

圖1胚泡(鏈霉蛋白酶處理前)，hBS細胞系167由其建立。
圖2胚泡(鏈霉蛋白酶處理后)，hBS細胞系167由其建立。
圖3種板于胚胎小鼠成纖維細胞上兩天后的胚泡167。
圖4培養(yǎng)于胚胎小鼠成纖維細胞上的hBS細胞第69代。
圖5培養(yǎng)于胚胎小鼠成纖維細胞上的hBS細胞第71代。
圖6BS細胞中的堿性磷酸酶(10X)。
圖7BS細胞中的堿性磷酸酶(40X)。
圖8未分化hBS細胞的分子標記表達。(A)用于Oct-4、胰島素、GLUT-2、高血糖素和PDX-1之mRNA存在的、提取自未分化的(ud)和已分化的(d)人BS細胞之總RNA的RT-PCR分析。對照中省略了反轉(zhuǎn)錄酶(-RT)。β-肌動蛋白作為看家基因。(B)在未分化的人BS細胞集落中由免疫染色顯示堿性磷酸酶的存在。(C)由未分化人BS細胞集落之免疫染色分析SSEA-1的表達。(D)未分化BS細胞對SSEA-3(數(shù)據(jù)未顯示)和SSEA-4呈免疫陽性。(E)對TRA-1-60免疫陽性的hBS細胞集落，和(F)對TRA-1-81顯示其未分化的狀態(tài)。放大40X。
圖9BS細胞的核型分析。
圖10畸胎瘤分析骨。
圖11畸胎瘤分析軟骨。
圖12畸胎瘤分析骨骼肌。
圖13畸胎瘤分析腎小球。
圖14畸胎瘤分析神經(jīng)元上皮玫瑰花環(huán)。
圖15畸胎瘤分析腺上皮。
圖16畸胎瘤分析產(chǎn)粘液上皮。
圖17hBS細胞體外分化為所有胚層細胞類型。相應(yīng)的熒光顯微圖片顯示體外10天后用胚層特異性標記染色的免疫陽性細胞。(A和B)顯示表達神經(jīng)元前體巢蛋白的神經(jīng)外胚層細胞(A)和分裂后神經(jīng)元的β-III-微管蛋白(B)的例子，而(C)顯示對結(jié)蛋白(Desmin)免疫反應(yīng)性的中胚層細胞的例子；(D)表達α-胎蛋白的細胞的例子。
圖18體外分化的hBS細胞中巢蛋白的免疫染色。
圖19體外分化的hBS細胞中胰島素的免疫染色。
圖20體外分化的hBS細胞中β-III-微管蛋白的免疫染色。
定義和縮略語如此處所用，術(shù)語“胚泡衍生的干細胞”稱為BS細胞，人型的則稱為“hBS細胞”。
如此處所用，術(shù)語“胚泡衍生的干細胞體”稱為“BS細胞體”。
如此處所用，術(shù)語“EF細胞”是指“胚胎成纖維飼養(yǎng)細胞”。這些細胞可衍生自任一哺乳動物，如小鼠或人。
用于本發(fā)明的一種合適的培養(yǎng)基稱為“BS細胞培養(yǎng)基”或“BS培養(yǎng)基”，且可由如下組成KNOCKOUTDulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基，補加了20％KNOCKOUT血清替代物，和終濃度分別為如下的組分50單位/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素，0.1mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、100μMβ-巰基乙醇、4ng/ml人重組bFGF(堿性成纖維生長因子)。
另一種用于本發(fā)明的合適培養(yǎng)基為“BS細胞體培養(yǎng)基”，其可由以下組成KNOCKOUTDulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基，補加了20％KNOCKOUT血清替代物和終濃度分別為如下的組分50單位/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素、0.1mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺和100μMβ-巰基乙醇(Itskovitz-Eldor，J.等人，2000)本文中，術(shù)語“穩(wěn)定”是指當(dāng)生長于有絲分裂失活的胚胎飼養(yǎng)細胞上時在未分化狀態(tài)中的增殖能力超過21個月。
現(xiàn)在結(jié)合下面的實施例說明本發(fā)明。此處所包括的實施例僅為說明用的目的，而不意在限制本發(fā)明的范圍。此處所述的一般性方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，且所有試劑和緩沖液均可得，無論是商購還是依本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的成熟方案制備。所有溫育均在CO2氣氛下37℃。
實施例實施例1.來自自發(fā)孵化的胚泡之未分化干細胞的基本上純制劑的建立人胚泡來自體外受精的冷凍或新鮮人胚胎。自發(fā)孵化的胚泡直接置于BS細胞培養(yǎng)基中的飼養(yǎng)細胞(EF)上(所述培養(yǎng)基配方KNOCKOUTDulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基，補加了20％KNOCKOUT血清替代物，和終濃度分別為如下的組分50單位/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素，0.1mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、100μMβ-巰基乙醇、4ng/ml人重組bFGF(堿性成纖維生長因子)，其中補加0.125mg/ml透明質(zhì)酸。在EF細胞上種板胚泡，監(jiān)測生長，且當(dāng)種板后約1-2周集落大到足以手工傳代)，從其它細胞類型中把內(nèi)細胞團細胞切出，通過在新EF細胞上生長來擴增。
實施例2.
來自帶有完整透明帶的胚泡之未分化干細胞的基本上純的制劑的建立對具有完整透明帶的胚泡，采用在rS2(ICM-2)培養(yǎng)基(Vitrolife，Gothenburh，瑞典)中鏈霉蛋白酶(10μ/ml Sigma)短暫溫育以消化透明帶，然后直接將胚泡置于補加有透明質(zhì)酸(0.125mg/ml)的BS培養(yǎng)基中的EF細胞層上。
實施例3.
堿性磷酸酶的組化染色收獲細胞，用于RT-PCR、組織化學(xué)(堿性磷酸酶)和免疫化學(xué)分析(見下)。
RNA分離和RT-PCR。依制造商推薦用Rneasy Mini試劑盒(Qiagen)制備總細胞RNA。用AMV第一鏈cDNA合成試劑盒(Roche)進行RT-PCR的cDNA合成，用Platinum Taq DNA聚合酶(Imitragen)進行PCR。利用市售試劑盒(Sigma)按制造商推薦進行堿性磷酸酶的組織化學(xué)染色。
實施例4hBS細胞系的制備和培養(yǎng)在組織培養(yǎng)皿中于EMFI培養(yǎng)基中培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維飼養(yǎng)細胞DMEM(Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基)，補加10％FCS(胎牛血清)，0.1μMβ-巰基乙醇，50單位/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素，和2mM L-谷氨酰胺(GibcoBRL)。用絲裂霉素C(10μg/ml，3小時)使飼養(yǎng)細胞有絲分裂失活。用手工切開在失活小鼠胚胎成纖維飼養(yǎng)細胞上擴增的hBS細胞集落。
在組織培養(yǎng)皿中用BS細胞培養(yǎng)基中于有絲分裂失活的小鼠胚胎成纖維飼養(yǎng)細胞上培養(yǎng)hBS細胞KNOCKOUTDulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基，補加了20％KNOCKOUT血清替代物，和終濃度分別為如下的組分50單位/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素，0.1mM非必需氨基酸、2mML-谷氨酰胺、100μMβ-巰基乙醇、4ng/ml人重組bFGF(堿性成纖維生長因子)。傳代后7天，集落大至足夠產(chǎn)生BS細胞體。
用玻璃毛細管將BS細胞集落切成0.4×0.4mm的塊，置于含有BS細胞體培養(yǎng)基的非粘附細菌培養(yǎng)皿中KNOCKOUTDulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基，補加了20％KNOCKOUT血清替代物和終濃度分別為如下的組分50單位/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素、0.1mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺和100μMβ-巰基乙醇(Itskovitz-Eldor，J.等人，2000)經(jīng)7-9日后形成包括囊性BS細胞體的BS細胞體。
實施例5.
hBS細胞的傳代傳代前，用Nikon Eclipse TE2000-U倒置顯微鏡(10X物鏡)和DXM1200數(shù)碼相機對hBS細胞照像。每4-5天傳代集落。當(dāng)集落可切成0.1-0.3×0.1-0.3mm小塊時集落的大小足以傳代。第一次細胞傳代時，其生長了1-2周，且可被切成約4塊。
在立體顯微鏡中逐一聚焦集落，依上述大小切成間格形式。僅將內(nèi)部同質(zhì)結(jié)構(gòu)傳代。用小刀移去集落的每一小塊，吸入毛細管，置于新飼養(yǎng)細胞上(最大為4日齡)。在每一新IVF皿上均勻放置10-16小塊。靜置5-10分鐘以使細胞粘附于新飼養(yǎng)細胞，然后置于培養(yǎng)箱中。每周更換hBS培養(yǎng)基3次。如果集落傳代，則該周換兩次培養(yǎng)基。通常進行“半更換”，即僅將一半培養(yǎng)基吸出且用等量的新鮮、溫和培養(yǎng)基替換。如需要，可更換全部體積的培養(yǎng)基。
實施例6.
hBS細胞的玻璃化切割來自細胞系的具有合適的未分化形態(tài)的集落用于傳代。將100-200ml液氮無菌過濾入足量的冷凍管中。制備溶液A和B(A800μlCryo PBS，含1M海藻糖，100μl etylen glycole和100μl DMSO；B600μlCryo PBS，含有1M海藻糖，200μl etylen glycole，和200μl DMSO)，將集落置于溶液A中1分鐘，B中25秒。封閉的吸管用于貯存冷凍集落。集落移入吸管后，立即置于含無菌液氮的冷凍管中。
實施例7.
胚胎小鼠飼喂(EMFi)細胞的種板用含絲裂霉素C的EMFi培養(yǎng)基滅活細胞，方法是37℃培養(yǎng)3小時。用明膠包被IVF皿。吸出培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞。用胰蛋白酶代替PBS以分散細胞。溫育后，用EMFi培養(yǎng)基終止胰蛋白酶活性。離心收集細胞，以1∶5稀釋入EMFi培養(yǎng)基，在Bürker室中計數(shù)。將細胞稀釋至終濃度170K細胞/mlEMFi培養(yǎng)液。IVF皿中的明膠用1ml細胞懸液替換，且置于培養(yǎng)箱中。種板后一天更換EMFi培養(yǎng)基。
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權(quán)利要求
1.一種獲得多能人胚泡衍生的干細胞系的方法，包括步驟i)利用任選的具有1級或2級的受精的卵母細胞，以獲得任選的具有A級或B級的胚泡；ii)將胚泡與飼養(yǎng)細胞共培養(yǎng)，以建立一個或多個內(nèi)細胞團細胞的集落；iii)通過機械切開分離內(nèi)細胞團細胞；iv)將內(nèi)細胞團細胞與飼養(yǎng)細胞共培養(yǎng)，以獲得胚泡衍生的干細胞系；v)任選的，增殖胚泡衍生的干細胞系。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟i)中的胚泡是自發(fā)孵化的胚泡。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中胚泡衍生的干細胞系是穩(wěn)定的。
4.權(quán)利要求1-3的方法，其中將胚泡衍生的干細胞系增殖。
5.權(quán)利要求4的方法，其中胚泡衍生的干細胞系的增殖包括每4-5天干細胞系的傳代。
6.權(quán)利要求4-5的方法，其中胚泡衍生的干細胞系的增殖包括用密度小于約60,000個細胞/cm2，如小于約55,000個細胞/cm2，或小于約50,000個細胞/cm2的飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)干細胞。
7.權(quán)利要求6的方法，其中胚泡衍生的干細胞系的增殖包括用密度約45,000個細胞/cm2的飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)干細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7的方法，其中胚泡衍生的干細胞系的增殖包括最多3次，例如最多2次的飼養(yǎng)細胞傳代。
9.權(quán)利要求1-8的方法，其中在步驟ii)之前胚泡的透明帶已至少被部分消化。
10.權(quán)利要求9的方法，其中胚泡的透明帶已至少被用選自酸性反應(yīng)物質(zhì)、酶和其混合物的消化劑部分消化。
11.權(quán)利要求1-10的方法，其中步驟ii)和/或步驟iv)在一種試劑中進行，所述試劑改善胚泡和/或有關(guān)的內(nèi)細胞團細胞對飼養(yǎng)細胞的附著。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述試劑是透明質(zhì)酸。
13.權(quán)利要求1-12的方法，其中飼養(yǎng)細胞是胚胎飼養(yǎng)細胞。
14.權(quán)利要求1-13的方法，其中步驟ii)和iv)中所用的飼養(yǎng)細胞相同或不同，且來自動物來源。
15.權(quán)利要求14的方法，其中飼養(yǎng)細胞為小鼠或人來源的。
16.權(quán)利要求1-15的方法，其中飼養(yǎng)細胞為有絲分裂失活的。
17.權(quán)利要求1-16的方法，其中干細胞系i)當(dāng)于有絲分裂失活的胚胎飼養(yǎng)細胞上生長時，顯示在未分化狀態(tài)中的增殖能力超過21個月，且ii)顯示正常的整倍體染色體核型，且iii)維持在體內(nèi)和體外發(fā)育成胚層所有類型的衍生物的潛力，且iv)顯示至少兩種如下的分子標記，OCT-4，堿性磷酸酶，糖表位SSEA-3，SSEA-4，TRA1-60，TRA1-81，和由單克隆抗體GCTM-2識別的硫酸角蛋白/硫酸軟骨素外周細胞基質(zhì)蛋白聚糖的蛋白質(zhì)核心，且v)不顯示分子標記SSEA-1或其它分化標記，且vi)保留其多能性且當(dāng)注射入無免疫應(yīng)答的小鼠中形成畸胎瘤，且vii)能分化。
18.獲自權(quán)利要求1-17的方法之人胚泡衍生的干細胞系用于制備分化細胞的用途。
19.權(quán)利要求1-17的方法，其中干細胞系具有分化為產(chǎn)胰島素細胞的能力。
20.權(quán)利要求19的方法，其中產(chǎn)胰島素細胞能形成胰島樣結(jié)構(gòu)。
21.權(quán)利要求19或20的方法，其中衍生自多能人BS細胞系的產(chǎn)胰島素β-細胞的量高于25％，例如高于35％，或高于40％，或高于45％，或高于50％。
22.權(quán)利要求19-21的方法，其中產(chǎn)胰島素細胞系產(chǎn)生至少約300ng胰島素/mg總蛋白，如至少約380ng胰島素/mg總蛋白或至少約450ng胰島素/mg總蛋白。
23.權(quán)利要求1-17或19-22的方法，其中胚泡衍生的干細胞具有分化為分化的細胞的能力，其顯示包括胰島素、Glut-2、Pdx-1、葡糖激酶、胰高血糖素和抑生長素中至少一種的胰腺細胞類型標記的表達。
24.權(quán)利要求1-17或19-23的方法，其中胚泡衍生的干細胞具有分化為產(chǎn)胰島素細胞的能力，其特征在于其組織成胰島樣結(jié)構(gòu)，包括一個由神經(jīng)元型細胞外層包圍的β細胞內(nèi)核，所述神經(jīng)元型細胞顯示至少一種下列神經(jīng)元細胞型標記的表達，包括神經(jīng)元特異性β-III微管蛋白(TUJ1)，NeuN，DoubleCortin，酪氨酸水解酶和Map2。
25.權(quán)利要求1-17的方法，其中胚泡衍生的干細胞能被分化成分化的細胞，其顯示至少一種下列神經(jīng)元細胞型標記的表達，包括神經(jīng)元特異性β-III微管蛋白(TUJ1)、NeuN、DonbleCortin、酪氨酸水解酶和Map2。
26.衍生自根據(jù)權(quán)利要求1-17或19-25的方法所獲得的胚泡衍生的干細胞之分化細胞的制劑的用途，其用于制備預(yù)防或治療由組織退化引起的病理或疾病的藥物。
27.衍生自根據(jù)權(quán)利要求1-17或19-24的方法所獲得的胚泡衍生的干細胞之分化細胞的制劑的用途，其用于制備預(yù)防或治療胰腺中的病理或疾病的藥物。
28.權(quán)利要求27的用途，所述疾病是糖尿病。
29.權(quán)利要求25或26的用途，其中疾病是I型糖尿病。
30.衍生自根據(jù)權(quán)利要求1-17或25的方法所獲得的胚泡衍生的干細胞之分化細胞的制劑的用途，其用于制備預(yù)防或治療神經(jīng)系統(tǒng)中的病理或疾病的藥物。
31.權(quán)利要求30的用途，其中疾病選自多發(fā)性硬化、脊索損傷、腦病、帕金森氏癥、亨廷頓氏癥、中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷、缺氧誘發(fā)的腦損傷、缺血誘發(fā)的腦損傷、低血糖性腦損傷、神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病、腦腫瘤和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)疾病。
32.一種用于進行權(quán)利要求1-17的方法的試劑盒，其包括在分隔的區(qū)室中的至少兩種如下成分透明質(zhì)酸、鏈霉蛋白酶、BS細胞培養(yǎng)基、和人或小鼠胚胎飼養(yǎng)細胞。
33.權(quán)利要求32的試劑盒，其還包括帶有完整透明帶的胚泡或自發(fā)孵化的胚泡。
34.一種產(chǎn)生產(chǎn)胰島素分化干細胞之基本上純的制劑的方法，包括如下步驟i)通過在適當(dāng)培養(yǎng)基中失活的飼養(yǎng)細胞上生長，擴增人胚泡衍生的干細胞；ii)通過將步驟i)中形成的集落解離成較小的聚集體或單個細胞，產(chǎn)生胚泡衍生的干細胞體，隨后將所述聚集體或單個細胞移入非粘附容器，在其中于適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；iii)將容器中的胚泡衍生的干細胞體平板接種入適當(dāng)培養(yǎng)基；iv)在ITFSn培養(yǎng)基中選擇巢蛋白陽性的神經(jīng)元前體；v)在含有B27培養(yǎng)基補充物和堿性成纖維細胞生長因子的N2培養(yǎng)基中擴增胰腺內(nèi)分泌先祖細胞；vi)將培養(yǎng)基換為不含堿性成纖維細胞生長因子的N2培養(yǎng)基。
35.權(quán)利要求34的方法，其中人胚泡衍生的干細胞通過權(quán)利要求1-17的方法獲得。
36.權(quán)利要求34-35的方法，其中步驟i)中所用的培養(yǎng)基為人胚泡衍生的干細胞培養(yǎng)基。
37.權(quán)利要求34-36的方法，其中步驟ii)中所用的培養(yǎng)基為胚泡衍生的干細胞體培養(yǎng)基。
38.權(quán)利要求34-37的方法，其中步驟iii)中所用的培養(yǎng)基為胚泡衍生的干細胞體培養(yǎng)基。
39.權(quán)利要求34-38的方法，其中在步驟vi)后加入煙酰胺。
40.一種分化的干細胞之基本上純的制劑，其中細胞顯示包括胰島素、Glut-2、Pdx-1、胰高血糖素、葡糖激酶和抑生長素中至少一種的胰腺細胞類型標記的表達。
41.權(quán)利要求40的制劑，其能夠產(chǎn)生至少約320ng胰島素/mg總蛋白，如至少約380ng胰島素/mg總蛋白或至少約420ng胰島素/mg總蛋白。
42.權(quán)利要求40或41的制劑，其中制劑的產(chǎn)胰島素細胞的比例至少為25％，例如至少35％，或至少45％，或至少50％。
43.權(quán)利要求40-42的制劑，其特征在于其組織成胰島樣結(jié)構(gòu)，包括一個由神經(jīng)元型細胞外層包圍的β細胞內(nèi)核，所述神經(jīng)元型細胞顯示至少一種下列神經(jīng)元細胞型標記的表達，包括神經(jīng)元特異性β-III微管蛋白(TUJ1)，NeuN，DoubleCortin，酪氨酸水解酶和Map2。
44.權(quán)利要求40-43的制劑，其由權(quán)利要求34-39的方法獲得。
45.一種分化的干細胞之基本上純的制劑，其中細胞顯示至少一種下列神經(jīng)元細胞型標記的表達，包括神經(jīng)元特異性β-III微管蛋白(TUJ1)、NeuN、DoubleCortin、酪氨酸水解酶和Map2。
46.權(quán)利要求45的制劑，其由權(quán)利要求34-39的方法獲得。
47.一種由權(quán)利要求34-39的方法獲得的基本上純的細胞制劑。
48.權(quán)利要求40-44的制劑用于制備預(yù)防或治療胰腺中的病理或疾病的藥物的用途。
49.權(quán)利要求48的用途，其中所述疾病是糖尿病。
50.權(quán)利要求48或49的用途，其中所述疾病是I型糖尿病。
51.權(quán)利要求45-46的制劑用于制備治療神經(jīng)系統(tǒng)中的病理或疾病的藥物的用途。
52.權(quán)利要求51的用途，其中疾病選自多發(fā)性硬化、脊索損傷、腦病、帕金森氏癥、亨廷頓氏癥、中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷、缺氧誘發(fā)的腦損傷、缺血誘發(fā)的腦損傷、低血糖性腦損傷、神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病、腦腫瘤和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)疾病。
53.用于進行權(quán)利要求34-39的方法的試劑盒，含有在分隔區(qū)室中的至少兩種如下成分絲裂霉素C、hBS培養(yǎng)基、BS細胞體培養(yǎng)基、ITSFn培養(yǎng)基、N2培養(yǎng)基、B27培養(yǎng)基補充物、煙酰胺和bFGF。
54.權(quán)利要求53的試劑盒，其還包括由權(quán)利要求1-17的方法獲得的基本上純的人胚泡衍生的干細胞系。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于建立多能人胚泡衍生的干細胞(BS)細胞系的方法，所述方法獲得的干細胞，所述細胞向分化細胞的分化，分化的細胞，以及所述分化的細胞在制備藥物中的用途?？蓪⒎只亩嗄芨杉毎只啥喾N特化的細胞類型，其可用于制備治療如下病癥或病情，所述病癥或病情涉及組織退化(例如胰腺退化導(dǎo)致例如糖尿病的形成)或CNS退化(阿爾茨海默癥、帕金森氏癥等)或由例如中風(fēng)或物理創(chuàng)傷引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化。
文檔編號A61K38/26GK1671835SQ02826386
公開日2005年9月21日 申請日期2002年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月28日
發(fā)明者H·塞姆, A·湯寧 申請人:塞拉提斯股份公司