專利名稱：含咪唑基的假二肽產物及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及假二肽產物，具體涉及一種新型的包含咪唑基或N-取代咪唑基的假二肽產物，及該產物在醫(yī)療、美容和食品領域的應用。
本發(fā)明的目的是一種新型的假二肽產物，其結構通式如下 其中A為a)以下形式 其中→B代表氮原子直接與碳原子相連的胺，并選自1)伯胺2)結構式為-NH-X的仲胺，其中X表示烴基、氟烷基、?；虬?)環(huán)烷基型的環(huán)狀叔胺或內酰胺
4)結構式為 的叔胺，其中Y或Y’表示烴基、?；蝓Ｑ趸?)結構式為 的亞胺，其中Y表示烴基，Y’表示氫原子或烴基6)結構式為 的銨其中Y、Y’、Y”表示烴基，離子W表示鹵離子、硫酸根離子、磷酸根離子、碳酸氫根離子、對甲苯-磺酸根離子、或帶有羧酸基團的化合物，→R表示氟原子、氟烷基、功能團如硫酸、磷酸或羧酸、?；翱杀灰粋€或幾個功能團取代的直鏈烷基，鏈烯基或芳香基，→R’表示氫原子、氟原子、烷基或氟烷基，→Im表示咪唑或N-取代咪唑，如 1-甲基-咪唑 3-甲基咪唑 W如上所定義b)或為以下形式 其中R表示氫原子或氟原子、氟烷基、?；?、或可被一個或幾個功能團取代的烴基，R”表示?；蚩杀灰粋€或幾個功能團取代的烴基。
假二肽產物的通式為形式a)的情況中，B是內酰胺，更多情況下是δ-或γ-內酰胺，或是環(huán)狀叔胺，如優(yōu)選為-氮丙啶 -吡咯烷 -哌啶 假二肽產物的通式為形式a)的情況中，B表示銨，或當咪唑環(huán)的氮原子涉及額外的氫原子時，離子W可以是鹵離子、硫酸根離子、磷酸根離子、碳酸氫根離子、對-甲苯-磺酸根離子或帶有一個羧酸基團的化合物，如乙酸鹽、三氟乙酸鹽、檸檬酸鹽、葡糖酸鹽、苦味酸鹽、或氨基酸如天冬氨酸或谷氨酸鹽。
在假二肽產物的通式是形式a)或b)的情況中，R、R’或R”表示烴基，后者可被一個或幾個功能團取代，例如醇、胺、羧酸、烷氧基、硫醚、硫醇、磷酸或硫酸。
某些此類化合物可以與屬于過渡金屬族的原子形成穩(wěn)定的配合物，這些“螯合物”由金屬原子如鋅、銅、鐵、鈷、錳或鎳(優(yōu)選鋅)，與一個或幾個假二肽分子(這取決于制備方式和假二肽種類)的締合構成。
下面列舉本發(fā)明中特別具有代表性的假二肽產物的實例。
通式為形式a)的產物O L-谷氨酰-組胺R’＝HR＝CH2-CH2-COOHB＝NH2O D-谷氨酰-組胺，它是前一產物的對映體R’＝CH2-CH2-COOHR＝HB＝NH2O N-甲基-2-氨基-L-丁?；?組胺R’＝HR＝CH2-CH3X＝CH3O α-氨基異丁酰基-組胺R＝R’＝CH3B＝NH2O L-正亮氨酸-組胺R’＝HR＝CH2-CH2-CH2-CH3B＝NH2O L-2-氨基辛基-組胺R’＝H
R＝CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3B＝NH2O BOC-2-氨基-1-戊基-組胺R’＝HR＝CH2-CH2CH3B＝叔丁基-O-C＝0O L-苯基甘氨酰-組胺R’＝HR＝苯基B＝NH2O L-鳥氨酰-組胺R’＝HR＝CH2-CH2-CH2-NH2B＝NH2O L-2，6-二氨基庚酸單酰基-組胺R’＝H B＝NH2O N-乙?；?2-氨基丁?；?組胺R’＝HR＝CH2-CH3 O N-苯乙?；?2-氨基丁酰基-組胺R’＝H
R＝CH2-CH3 O L-精氨酰-組胺R’＝H 通式為形式b)的產物O L-脯氨酰-組胺R＝HR1＝CH2-CH2-CH2即A＝ O 4-羥基-L-脯氨酰-組胺R＝H R＝H 即
本發(fā)明的假二肽產物可看作是α-氨基酸和組胺或甲基取代組胺(如1-甲基-組胺或3-甲基-組胺)的縮合產物。而且，我們可用硫原子取代所得酰胺鍵上的氧原子。
因此，假二肽產物可用不同合成方法制備得到化學合成或酶促合成。
制備本發(fā)明所指的假二肽產物的適當化學制備方法以符號方式，AA-Hist(AA指氨基酸，Hist指組胺)表示為如下路線(1)AA+X+Y-->X-AA-Y(2)X-AA-Y+Hist(.2HCl)-->X-AA-Hist制備過程的第一步目的在于以X基團N-保護氨基酸(AA)，Y基團O-活化AA。
N-保護最好是通過取代氨基酸氨基的氫原子來完成，取代基可以是?；蝓Ｑ趸?。在最有用的保護基團中，我們可舉出芐氧羰基(Z)、9-芴基-甲氧基羰基(Fmoc)、芐基、鄰苯二甲酰基、2-硝基苯基亞磺?；腿阴；?。
盡管不必活化反應也可能進行，但最好還是通過酯化氨基酸的羧酸官能團進行O-活化，用來活化的化合物包括氰基甲醇、鄰硝基苯酚、2，4，5-三氯苯酚、對硝基苯酚、2，4-二硝基苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚、N-羥基鄰苯二酰亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、1-羥基哌啶和5-氯-8-羥基-喹啉。
在O-活化方式中我們可列舉的方法還包括將羧酸轉化為酰氯、酰肼、“混合”或對稱酸酐。
一種特殊的活化方法是將氨基酸與光氣反應，形成該氨基酸的N-羧基酸酐。
制備過程的第二步是與組胺的縮合，有無縮合劑此步都能進行。將N-保護、O-活化(或未活化)氨基酸與優(yōu)選二鹽酸鹽形式的組胺反應。應該指出的是當使用D-活化氨基酸時，就不必使用縮合劑。
在無任何縮合劑情況下，縮合反應在以下條件中進行在有機溶劑(如氯仿、1，2-二甲氧基-乙烷、二甲基甲酰胺……)，酸(如乙酸……)或堿(如三乙胺)存在下；在水-有機溶劑中(如水-吡啶、或水-1，2-二甲氧基乙烷)，堿存在下(如蘇打或碳酸氫鈉……)，然后加酸(如鹽酸……)；在催化條件下(如咪唑、N-乙基嗎啉……)。
如果使用縮合劑，例如可用二環(huán)己基碳二亞胺、N-羥基苯并三唑和它的衍生物如苯并三唑基氧基三(二甲基-氨基)鏻六氟磷酸鹽(BOP)、1-異丁氧基羰基-2-異丁氧基-1，2-二氫喹啉、羰基二咪唑、伍德試劑K、α-氯乙烯基乙基醚、α，α-二氯二乙醚、二氯甲基甲醚、DCC和添加劑、DCC-五氯苯酚、DCC-五氟苯酚、氨基氰、鯨蠟烯亞胺和鯨蠟烯、噁唑啉鎓鹽、EEDQ(1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二氫喹啉)、ynamines、酰基磷、亞磷酸三苯酯和咪唑、銅(II)配合物、SiCl4。
必要時基團X或N-保護基在第三步除去
(3)X-AA-Hist→AA-Hist消除方式根據(jù)保護基團而定，可用氫解、鈉-液氨還原、肼解、酸解、水解或酶促方式。較理想的方法是在三氟乙酸存在下以酸解方式進行脫保護步驟。在最后這種情況下，經氨處理得到堿式假二肽產物。此外，研究時可將堿式化合物與過渡金屬鹽放在一起以形成螯合物。
作為一個實例，L-谷氨酰-組胺的制備方法按以下步驟進行向冷卻至0℃含2.0g(6.59mmol)Boc-Glu-(OtBu)-OH、1.456g(7.91mmol)五氟苯酚和8ml乙酸乙酯的懸浮液中，滴加4ml 1.631g(7.91mmol)溶于乙酸乙酯的二環(huán)己基碳二亞胺溶液。于0℃搖動30分鐘，然后于室溫搖動1小時。
過濾反應混合物，除去二環(huán)己基脲。用乙酸乙酯洗滌二環(huán)己基脲，然后蒸發(fā)濾液，油狀的殘余物用漿式泵干燥2小時。
得到3.1g白色固體形式的Boc-Glu(OtBu)-Opfp。
向含1.213g(6.59mmol)鹽酸組胺，15ml二甲基甲酰胺和1.331g(13.18mmol)N-甲基嗎啉的懸浮液中，于0℃逐滴加入5ml溶于二甲基甲酰胺的Boc-Glu(OtBu)-Opfp溶液。反應混合物于0℃攪拌2小時，室溫下攪拌1.5小時，然后過濾，沉淀用二甲基甲酰胺洗滌。
過濾混合物以除去鹽酸N-甲基-嗎啉沉淀，沉淀用乙酸乙酯洗滌，于t≤40℃，真空下用漿式泵蒸發(fā)二甲基甲酰胺。加入25ml乙酸乙酯到殘余物中，然后過濾除去所得的不溶部分。
產物依次以20ml 0.5M碳酸氫鈉、10ml 0.5M碳酸氫鈉、20ml水和20ml飽和氯化鈉溶液洗滌。
在硫酸鈉上干燥有機相1小時后，蒸發(fā)得到白色粉末。
回收3.234g(產率＞100％)產物，但TLC表明仍殘留一些苯酚和組胺，它們可在下步中除去。
加入25ml三氟乙酸到1.12g固體Boc-Glu(OtBu)-Hist中，室溫下?lián)u動1小時，用漿式泵于t≤40℃下蒸發(fā)溶劑。
加入12ml乙醚到產物中，室溫下攪拌30分鐘，在研制過程中形成白色產物。將醚傾析除去，殘余物用10ml乙醚洗滌，然后用漿式泵干燥。
殘余物溶解于7ml乙醇中，然后加入氨(濃度5％)直到pH＝7.5為止。再加入25ml乙酸乙酯，整個溶液于0℃下放置數(shù)小時。
形成兩相后用傾析法分離，蒸發(fā)下部黃色油狀相。形成一種吸濕性白色粉末。用乙醇/乙酸乙酯重結晶產物，過濾后用乙醇/乙酸乙酯(1∶1)洗滌固體。
得到510mg產物(產率＝65％)。
考慮產量和成本，可以全部或部分使用酶促合成方法制備類肽產物。
根據(jù)該方法，我們可以提出以下合成路線縮合反應如下列方程式所述X-AA-Y+hist+酶→X-AA-hist+Y其中X-AA-Y是N-保護氨基酸，其制備方法如前所述，保護基團X可以是?；?、酰氧基……。
這種情況下，基團X還可以提高AA在反應介質中的溶解度。這樣可選擇X以提高AA在有機介質中的溶解度，例如 芐氧羰基X-AA-Y的O-活化是用醇酯化羰酸功能團，醇選自脂肪醇尤其是乙醇、鹵代烷基醇如2，2，2-三氯乙醇、芳香醇如苯酚、以及所有前面提到的用于化學合成中活化的醇類。但是，所有叔醇類不包括在內。
與堿式組胺(或甲基化衍生物)或組胺鹽(或某個甲基化衍生物)如二鹽酸組氨酸的縮合反應可在多種有機溶劑中進行，例如脂肪烴溶劑(環(huán)己烷、己烷……)或芳香族溶劑(甲苯)、叔醇(叔丁醇、叔戊醇)、鹵代烴(二氯甲烷)、醚(異丙醚)、乙腈、二甲基甲酰胺或二甲基亞砜。
這些溶劑可單獨使用或結合使用，可在無水或微量水存在下使用。
反應可在有堿如三乙胺或無堿條件下進行。
酶催化劑屬于酶中的水解酶類(脂酶、蛋白酶)，它們來源于微生物、動物或植物，可在純化或未純化形式下使用。
我們可列出一些低成本商品級酶，如脂酶，從微生物中提取得到假單胞屬菌種、皺落假絲酵母、毛霉；或來源于動物豬胰脂肪酶(PLP)，蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Substilisine、木瓜蛋白酶……。
這種催化劑不溶于反應介質，可單獨分散于溶劑中或固定于外部惰性載體上，使其更易于再循環(huán)。
-反應在4℃到70℃，但優(yōu)選35℃到45℃溫度范圍內、攪拌下進行。
-過濾收集縮合產物或用適當溶劑萃取得到。
-這樣，脫保護和純化步驟可按照化學合成所述的方法進行。
然而，脫保護步驟也可按照下面的酶促反應進行X-AA-hist+酶→AA-Hist+X-ORR-OH其中R＝H或烷基。
該方法同縮合步驟所述，但我們要注意在R＝H的特殊情況下，反應是在水中進行。
對于縮合步驟，可以預見情形要略微不利一些，但可以通過下面的重要方法降低生產成本-使用無N-保護(這里X＝H)、O-活化同前的氨基酸-使用N-保護但無O-活化(這里Y＝H)的氨基酸-或甚至使用原氨基酸(X＝Y＝H)。
反應條件同前面N-保護、O-活化衍生物的制備方法所述。
本發(fā)明的假二肽產物的結構特征使其具有對酶促減活化作用不靈敏的有效要素。
其基本結構特征是在位于肽鍵氮原子α位的碳原子上缺少羧酸基團；對本發(fā)明某些產物來說，另一個結構特征是與B相連的碳原子上設有氫(也就是說R和R’不是H)，氫原子可被氟原子、氟烷基(R或R’＝CF3)或烴基取代。
通常，借助位于末端碳(與B相連)的空間位阻取代基以利于抗酶促減活化作用，例如異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基或新戊基。
當末端胺含于環(huán)狀結構中時，例如上面通式中的b)型或a)型中的B是環(huán)叔胺(如哌啶)，也會加強抗酶促減活化作用。
更普遍的是，當部分假二肽產物的α氨基酸具有不同于某個天然氨基酸的結構時，(這樣我們稱為非蛋白形成性或非天然氨基酸)，也會加強耐酶性，尤其是耐蛋白酶。適當選擇與通式中B相連碳的立體化學即可實現(xiàn)這一點。事實上，末端不對稱碳的存在就可得到不同于某個天然氨基酸的絕對構型。
藥理特性本發(fā)明假二肽產物的藥理特性來自于對酶促減活化作用的不敏感性。
首先，它們具有抗氧化性。事實上，它們能抗氧化性應激反應，即抵抗自由基對生物結構的損傷。這些產物可在不同方面起作用它們可直接與各種類型的自由基(F.R.)反應；也可與氧化性應激反應的毒性副產物反應。研究表明這些活性產物還具有對自由基引發(fā)的生物結構改變的修復活性。
某個此類化合物對這些自由基的反應性取決于其特定的結構組成，其實不能建立結構-活性規(guī)則。例如，一個很小的結構差異就會導致一個重要的變化，如假二肽氧化還原電勢、直接關系到抗氧化潛力的物理化學性質的變化。此特殊性解釋了這類化合物性質的多樣性。例如，以兩種假二肽進行體外實驗的結果表示如下1°)對自由基OH·的抑制能力實驗過程如J.M.C.Gutteridge在Biochemistry Journal，Vol 224(1984)，P.761-767中所述-氧化底物脫氧核糖，-羥基自由基OH-的制備體系EDTA/鐵，H2O2-檢測硫代巴比妥酸/mondialdehyde(MDA)-參比抗氧化劑二肽β-丙氨酰-L-組氨酸(對酶促減活化作用敏感)抑制率％對照組(無抗氧化劑) 0β-丙氨酰-組氨酸(10mM) 38L-脯氨酰-組胺(10mM) 62L-谷氨酰-組胺(10mM) 02°)對超氧陰離子O2·-的抑制能力-超氧陰離子的制備體系黃嘌呤氧化酶/次黃嘌呤(無鐵)。-超氧陰離子是還原物質，尤其是能夠還原底物細胞色素C。它的還原結果用紫外分光光度計于550nm處檢測。
抑制百分率表示如下 L-谷氨酰-組胺(mM)抑制率％13,551410 2420 35
在產生超氧陰離子的酶促體系中，L-谷氨酰-組胺能強烈抑制細胞色素C的還原。抑制率隨濃度變化。L-脯氨酰-組胺或參比抗氧化劑β-丙氨酰-組氨酸不具備抑制超氧陰離子的能力。
某些情況下，當B是仲胺時，基團X可加強本發(fā)明假二肽產物的抗氧化性，尤其是當取代基X是叔丁氧羰基或芐氧羰基時。
這些產物的另一個重要特性是具有對抗氧化性應激反應，保護生物親油結構(細胞膜)或親水結構(生物多聚體如蛋白質、DNA)的能力。
由于存在咪唑環(huán)或親核性胺，某些這類化合物具有抗-糖化活性，抵抗其本身與蛋白質上糖的非酶促反應，從而避免其降解。
對某些這類化合物來說，其部分結構與組胺相似，使其具有抑制組胺生物效應的活性。
相反，在某些極特殊情況下，還可能得到具有組胺部分生物特性的化合物。
最后，這些產物還具有細胞刺激性，可在溫和條件下促進一定類型細胞的增殖。此特性還可解釋某些這類化合物的免疫刺激和免疫調節(jié)特性。
按照這種作用方式，本發(fā)明的假二肽化合物可促進愈合后期所涉及的免疫系統(tǒng)細胞的治愈作用(淋巴細胞、肥大細胞、單核細胞)，其主要作用是分泌生長因子。
對鼠脾細胞的體外試驗表明了這種“免疫刺激”特性。實驗過程摘自J.Kunert-Radek，H.Stepien，K.Lyson和M.Pawlikowki-”鈣道調節(jié)劑對體外鼠脾淋巴細胞增殖的作用”-Agents and Actions，Vol.29 Nos 3-4(1990)，P.254-258。
細胞增殖后測定細胞中氚標胸腺嘧啶的摻入速率，以每分鐘的裂解數(shù)表示，減去背景噪音而導出。
以參比免疫刺激劑刀豆球蛋白A所得的結果作為對照。
免疫刺激作用以刺激指數(shù)(SI)表示。 數(shù)值為三次測量的平均值。
我們可看出L-谷氨酰-組胺濃度為5μg/ml時，免疫刺激作用最大。我們得出結論假二肽濃度在5到10μg/ml之間，具有中等免疫刺激作用(細胞增殖)。
免疫調節(jié)劑濃度 (μg/ml)2.5 5.0 10.0 25.0IS(L-谷氨酰-組胺)7.8 42.7 42.1 5.6IS(刀豆球蛋白A) 8.3 33.4 61.5 4.3該活性與參比有絲分裂原刀豆球蛋白A的活性相當。但是，用于本試驗的細胞制備物是異源性的，實際上包括幾種類型的單核細胞。
為確定假二肽的作用方式，對人單核細胞同源群體進行了第二個實驗。
細胞增殖的測量方法同前免疫調節(jié)劑濃度(μg/ml)2.50 5.00 10.0025.00IS(L-谷氨酰-組胺)8.23 39.80 23.502.50IS(刀豆球蛋白A) 4.82 29.60 21.10這樣證明對單核細胞的刺激作用最佳時的濃度同前。我們還可看出假二肽的活性略高于刀豆球蛋白A，平均倍數(shù)為1.34。
這些結果支持了通過單核細胞活化以間接方式作用于淋巴細胞的假說。
多數(shù)情況下，本發(fā)明假二肽產物的體內活性保存與其跟水解酶體系(尤其是肽酶體系)接觸時分子完整性的保存相關聯(lián)。
但是，本發(fā)明假二肽產物對酶促體系的一定靈敏性是以特殊應用為目的的。這樣的實例中B表示仲胺，X表示 或 例如第一種情況所得的活性產物可在體內酶促水解并重新形成一種新的仍具活性的假二肽
因此，我們不只得到對類肽化合物的暫時保護，它也是“就地”再生類肽的伯胺功能團的一種方法，從而重新建立與親核胺(在生理pH下可離子化)分子相關的特性。我們可以說抗糖化作用部分是由于氨基化合物可以共價鍵形式鍵接到還原性糖上。
當希望改變原類肽的極性(如為與特殊配方相容)、或希望避免分子在生理pH下電離、或為減小類肽對配方中其它化學物質的反應性(與親電化合物不相容)時，此方法是很有效的。
某些情況下，此方法還能改進這類活性產物的生物利用度和藥物動力學，進一步加強藥效。
醫(yī)療和美容應用本發(fā)明假二肽產物的所有上述特性都具有醫(yī)療和美容應用價值。
本發(fā)明假二肽的抗氧化性使得人們可提出這些產物用于治療與“氧化性應激反應”有關的疾病。
在這些特性中，一個重要的醫(yī)療應用就是內障治療。不同的內障病因也不相同。在“老年內障”型或“糖尿病內障”型病癥中，有關致病機理可歸納為兩種氧化機理(M.A.Babizhayev，A.I.Deyev，L.F.Linberg，“脂質的過氧化作用是內障的一個可能因素”，Mechanisms of Ageing Dev.，Vol.44(1988)；p.69-89)，和網(wǎng)狀形成機理糖化類型(T.J.Lyons，G.Silvestri，J.A.Dunn，D.G.Dyer，J.W.Bayhes“在糖尿病性和非糖尿病性老年內障中晶狀體糖化的作用”，Diabetes Vol.40，N°8，(1991)，P.1010-1015)。
如前所述，假二肽的抗氧化性主要來自其抗自由基活性，“過氧化物酶”樣活性和抗-糖化活性，這使其成為治療內障的有效產物。具有修復活性的這些化合物這種能夠修復由F.R.引發(fā)的生物結構改變的性能對治療內障尤其重要，因為它能致使晶狀體渾濁減退。
本發(fā)明假二肽產物可防止引起動脈粥樣硬化的氧化現(xiàn)象。在此病癥中，循環(huán)血液中的低密度脂蛋白微粒(LDL)的氧化引起蛋白部分(脫輔基蛋白質B)的裂解，也引起脂部分的裂解。形成的碎片會導致出現(xiàn)不正常細胞(載有膽固醇的單核細胞和巨噬細胞)，它們聚集在血管壁上形成動脈粥樣硬化斑。
而且，就最近證明的糖化現(xiàn)象也與產生動脈粥樣硬化斑有關而言，本發(fā)明假二肽產物尤其適合治療這類疾病。(參見T.J.Lyons-“糖化作用和氧化作用-在動脈粥樣硬化致病機理中的作用”-American Journal of Cardiology，Vol.71，N°6(1993)，P.1326-1331)。
目前己證明氧自由基與DNA鏈的切斷和改變有關，這些轉變又是健康細胞向腫瘤細胞發(fā)展的起始，因而本發(fā)明假二肽產物可抵抗致癌過程。
同樣，本發(fā)明假二肽產物的抗氧化性適于治療炎癥，尤其是適于治療類風濕性關節(jié)炎。事實上，滑液變質是炎性關節(jié)炎的特征癥狀，并表明它的主要組成之一透明質酸由于“氧化性應激”而降解。最近研究(參見B.Halliwell and J.M.C.Gatteridge-“慢性炎癥和自身免疫性疾病”-Free Radicals in Biology andMedicine-B.Halliwell and J.M.C.Gutteridge Eds-ClarentonPress(1989)，Oxford P.422-438)也表明該過程中涉及脂質過氧化現(xiàn)象，這說明本發(fā)明產物的有益作用。
本發(fā)明假二肽產物的抗氧化性還可作為輔助治療用于放射治療。已知β-丙氨酰-組氨酸的放射保護作用取決于這類化合物的細胞刺激特性，該作用尤其適于保護對放療輻射非常敏感的骨髓細胞。
根據(jù)最近資料，某些癲癇癥產生于氧自由基對大腦局部區(qū)域的損傷(參見G.R.Jackson，K.Werrbach-Perer，J.R.Perez-Polo-“氧化-抗氧化平衡和神經元損傷中神經生長因子的作用-II-A conditioning lesion paradigon”-Journal ofNeuroscience Research，Vol.25，N.3(1990)，P.369-374)。本發(fā)明產物的組織再生性(本情況為神經組織)是與神經組織退化有關病癥中的一個重要因素。本產物還可用于帕金森氏病的治療，該病涉及對腦組織的“氧化性應激”。
某些血管病，尤其是內毒素血癥，與氧化氮NO·自由基的過度產生有關。由內皮細胞和血管平滑肌細胞產生的這種自由基的作用導致慢性血管舒張。當使用血管收縮劑進行治療時，這種狀態(tài)尤其有害。細胞中的酶，NO-合成酶，催化L-精氨酸轉化NO·。本發(fā)明的一種抗氧化性假二肽結構中含有L-精氨酰基(或衍生物NG-甲基-L-精氨?；?，可直接作用于NO·；也可通過對酶催化的抑制，作用于合成NO·的酶。
在皮膚表面，假二肽產物的抗氧化性可用于中和光照產生的氧自由基的作用。這樣它們將有效阻斷光敏反應(自由基引發(fā)皮膚表面產生光敏分子)。對易于氧化的活性化合物(例如冬眠靈)，它們將阻止其轉變?yōu)槎拘曰衔铩?br> 在以光化學療法治療某些皮膚病時，這一原理的應用效果最佳。事實上，這些療法主要使用光敏劑(例如補骨脂素)，它在放射線下具有有益的療效(與DNA作用)，但不幸的是它又伴隨產生自由基，帶來不利的副作用。
本發(fā)明產物還可用于防止卟啉癥患者出現(xiàn)皮膚病，因為卟啉加強了由自由基引起的損傷。
它們也可用于防止患有自身免疫性疾病(例如全身性紅斑狼瘡(SLE))的患者出現(xiàn)與“氧化性應激”有關的皮膚病。
它們還可有效地抵抗皮膚上“曬斑”(紅斑)、水腫和特征細胞的形成。
本發(fā)明化合物的抗氧化性當然也可用于防止皮膚老化。實際上，許多實驗、分析和流行病學討論支持由自由基引發(fā)的生化損傷累積構成老化的基本過程這一理論。顯然，暴露在太陽照射將引起氧自由基的形成，它是皮膚過早老化的原因。
最后，實驗證明這些化合物可消除皮膚組織老化的其它明顯現(xiàn)象-以糖為介質引起的非酶促蛋白質交聯(lián)，例如膠原和彈性蛋白(V.M.Monnier-“非酶促糖基化作用，美拉德反應和老化過程”-Journal of Gerontology，Vol.45，N°4(1990)P.B105-111)，-脂蛋白復合物的形成脂褐質(與氧化應激副產物交聯(lián))。
實驗證明L-精氨酸可抗非酶促交聯(lián)反應(該氨基酸可在糖和某些二羰基化的氧化應激副產物上縮合)。因此，本發(fā)明化合物中結構含L-精氨酰基的假二肽可抵抗組織老化進程。
本發(fā)明假二肽產物的另一系列應用取決于其細胞刺激特性，同免疫刺激特性一樣，本特性也已得到證實。這些特性利于組織的再生和愈合，通常也可以調節(jié)涉及免疫應答介質的功能。
這樣，它們可用于促進受損皮膚結締組織的再生。它們也利于燒傷、化療和放療后粘膜的修復。
根據(jù)該原理，這些產物還可用于防治皺紋。
假二肽的細胞刺激和再生特性對肌肉組織具有特殊作用，肌肉組織含高濃度有關天然二肽β-丙氨酰-組氨酸。即使目前該化合物的生理學作用還未確立，但可以肯定它與肌肉代謝具有密切關系。所以本發(fā)明產物能參與改善肌肉收縮性，調節(jié)心臟收縮力。我們也可應用該特性治療某些肌肉退化病，如Dushen肌營養(yǎng)障礙。
在許多領域都能發(fā)現(xiàn)本發(fā)明假二肽產物治愈特性的應用。我們可舉出與肌肽有關的二肽產物對胃潰瘍的治療已取得良好效果。(M.Ito，T.Tanaka and Y.Susuki-Effect of N-13-aminoproprionyl-L-histidinato Zinc(Z-103)on healing andhydrocortis-one-induced release of acetic acid ulcers in rats withlimited food-intake-time”-Japanese Journal ofPharmacology，Vol.54(1990)，P.513-521)。此外，本發(fā)明產物的抗氧化和抗炎癥特性適用于治療這類疾病。如前所述，本發(fā)明鋅螯合物尤其適于這方面的應用。
本發(fā)明假二肽產物的治愈特性尤其適于治療角膜損傷。它們可施用于術后治療，如在校正近視的角膜切割手術后。它們最大的優(yōu)點是可用于“干眼”疾病治療，促使角膜hepitelium的愈合；而且由于“人工眼淚”特性保護損傷組織抗“氧化應激”(健康狀態(tài)、發(fā)炎、紫外射線)，還可配入促使淚膜修復的藥方中。
含有本發(fā)明假二肽產物的組合物由于具有免疫刺激和組織再生作用，可防止視網(wǎng)膜退化現(xiàn)象。因為這類疾病涉及氧化反應，所以它們的作用效果也得以加強。(參見R.E.Anderson，L.M.Rapp，R.D.Wiegand-Current Eye Research.Vol.3(1984)，P.233-227)。
最后，本發(fā)明假二肽產物的免疫刺激特性可強化疫苗的效力，取代通常用于加強人體免疫應答的佐劑(鋁鹽、細菌提取物、單磷?；鵄……)，因為這些佐劑的副作用并不是微不足道的。(RK Gupta，EH Relyveld，EB Linblad，B Bizzini，S Ben-Efraim and CK Gupta“佐劑-毒性和輔助性間的平衡”Vaccine，Vol.11，n°3(1993)，P.293-306)。
如前所述，符合上述通式的某些假二肽可起到組胺抑制劑的作用。在此特性的醫(yī)療應用中，我們可列舉-組胺的拮抗劑應用于外周血管系統(tǒng)的疾病治療，防止血小板凝集。事實上，已證明組胺是加速血小板凝集的細胞內介質。(S.P.Saxena，L.J.Brandes，A.B.Becker K.J.Simons，F(xiàn).S.LaBella and J.M.Gerrard，Science，Vol.243，n°24(1989)，P.1596-1599)。組胺也是細胞發(fā)育和增殖中涉及的細胞內介質(JR.Chanda，A.K.Ganguly，Cancer Letters，Vol.34(1987)，P.207)。因此，本發(fā)明拮抗性假二肽可用于調節(jié)細胞增殖，尤其是在肥大瘢痕組織中(瘢痕瘤)。
-組胺也是干擾許多生物過程的細胞外介質。所以本發(fā)明拮抗劑可用于抗變態(tài)反應、某些心機能不良的炎癥治療，以及所有涉及過度釋放組胺的疾病治療。
因此，在芳香劑或除臭劑中包括本發(fā)明假二肽產物特別利于抗變態(tài)反應，尤其是由某些氣味強烈的組分引起的過敏性休克。
與上面情況相反，某些這類化合物具有組胺的某些特性(前一組胺特性)。組胺H2受體的拮抗特性可抑制中性白細胞的活化從而抑制這些細胞過度產生自由基。(R.Burde，R.Serfert，A.Buschaeur，G.Schultz，“組胺通過H2-受體抑制人中性白細胞和HL-60白血病細胞的活化”Naunyn-Shcmiedebergs Arch.ofPharmacology，Vol.340，n°6(1989)，P.671-678)。所以可考慮利用這些假二肽治療某些疾病的炎癥。
組胺還利于細胞的增殖和發(fā)育(G.Kahlson，E.Rosengren，C.Steinhardt Journal of Physiology，Vol.151(1960)，P.131)。具有“前-組胺性”的化合物還可促進細胞再生。
本發(fā)明中某些具有L-脯氨?；?和衍生物)結構的假二肽產物的性能與一系列應用有關，它們可防止不正常的膠原合成和在組織中的累積。該特性與其結構類似于天然二肽有關，L-甘氨酰-L-脯氨酸利于膠原降解；此特性也與抗氧化性有關，因為最近發(fā)現(xiàn)氧化應激參與膠原的過度產生(J.C.Geesin，L.J.Hen drichs，P.A.Falkenstein，J.S.Gordon，R.A.Berg“抗壞血酸對膠原合成的調節(jié)抗壞血酸鹽作用的鑒定-受激脂的過氧化作用”Archives of Biochemstry and Biophysics，Vol.290，n°1(1991)P.127-132)。
膠原在心臟組織的累積是糖尿病的主要并發(fā)癥之一。
這類化合物可減少治愈過程中膠原的過度產生而引起的瘢痕瘤。因為本發(fā)明假二肽產物也能起到抗-組胺的作用以及最近證明的組胺刺激膠原的產生(A.Hatamochi，H.Ueki，C.Mauch，T.Krieg“組胺對人皮膚成纖細胞中產生膠原和膠原m-RNA的作用”Journal of Dermatologic Sciences，Vol.2(1991)，P.407-412)，本發(fā)明產物尤其適于這方面的應用。
穩(wěn)定劑和防腐劑方面的應用本發(fā)明假二肽優(yōu)越的耐受性、溫和的抗氧化性和細胞刺激性使其適于保存和保護易氧化的物質，并適用于食品加工和離體器官和組織的保存。
我們可舉出這類化合物可防止脂質體的氧化從而提高它們的穩(wěn)定性并避免形成毒性副產物；保護摻在美容配方中的透明質酸以防止自由基的解聚作用；保護易于氧化的油類、食品和特種食品。
本發(fā)明產物還可改善血液和血清疫苗的保存及用于移植術器官的保護(尤其是心臟移植)。
權利要求
1.具有以下通式的假二肽產物 其中A為a)以下形式 其中→B表示氮原子直接與碳原子相連的胺，選自1)伯胺，2)仲胺-NH-X，其中X表示烴基、氟烷基、?；虬?，3)環(huán)烷基型的環(huán)叔胺或內酰胺，4)叔胺 ，其中Y或Y’表示烴基、酰基或酰氧基，5)亞胺 ，其中Y表示烴基，Y’表示氫原子或烴基，和6)銨 其中Y、Y’、Y”表示烴基，離子W表示鹵離子、硫酸根離子、磷酸根離子、碳酸氫根離子、對-甲苯-磺酸根離子或帶有羧酸基團的化合物，→R表示氟原子、氟烷基、功能團如硫酸、磷酸或羧酸、?；翱杀灰粋€或幾個功能團取代的直鏈烷基、鏈烯基或芳香基，→R’表示氫原子、氟原子、烷基或氟烷基，→Im表示咪唑或N-取代咪唑，b)或以下形式 其中，R表示氫原子、氟原子、氟烷基、酰基或可被一個或幾個功能團取代的烴基，R”表示酰基或可被一個或幾個功能團取代的烴基。
2.按照權利要求1的假二肽產物，其中通式A中的碳原子是不對稱碳，其絕對構型不同于以肽鍵與組胺相連的天然α氨基酸中的α碳。
3.按照權利要求1和2的假二肽產物，其中R’基團不是氫原子。
4.按照權利要求3的假二肽產物，其中R基團和R’基團至少有一個是氟原子。
5.按照權利要求1至3之一的假二肽產物，其中R基團和R’基團至少有一個是CF3。
6.按照權利要求1或2的假二肽產物，其通式為a)形式，且B表示氮丙啶、吡咯烷、哌啶或內酰胺如δ或γ-內酰胺。
7.按照權利要求1或2的假二肽產物，其通式為a)形式，且B表示銨，其離子W表示具有選自以下基團的化合物乙酸根、三氟乙酸根、檸檬酸根、葡糖酸根、苦味酸根、天冬氨酸根、谷氨酸根、鹵離子、硫酸根、磷酸根、碳酸氫根和對-甲苯-磺酸根基團。
8.按照權利要求1至7之一的假二肽產物，其中R或R”表示可被一個功能團取代的基團，例如醇、胺、羧酸、烷氧基、硫醚、硫醇、磷酸和硫酸功能團。
9.按照權利要求1至7之一的假二肽產物，其中R’可選自異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基或新戊基。
10.按照權利要求1或2的假二肽產物，其可與一種選自鋅、銅、鐵、鈷、錳或鎳的金屬原子形成螯合物。
11.按照權利要求1或2的假二肽產物，其通式為形式b)，且R”表示CH2-CH2-CH2基團，即A表示 該假二肽產物是L-脯氨酰-組胺。
12.按照上述任一個權利要求的假二肽產物，其特征在于在組胺與α氨基酸縮合反應得到的酰胺鍵上，?；难踉颖涣蛟哟?。
13.制備權利要求1至11之一的產物的化學方法，其特征在于以下步驟-以基團XN-保護所述α氨基酸，-以基團YO-活化所述α氨基酸，-將所述N-保護和O-活化α氨基酸與組胺或N-取代組胺縮合，-根據(jù)所需假二肽產物，除去或不除去X。
14.按照權利要求13的方法，其特征在于通過酯化所述氨基酸的羧酸功能團進行α-氨基酸的O-活化。
15.按照權利要求14的方法，其特征在于通過與選自以下的化合物反應進行α氨基酸O-活化的酯化步驟氰基甲醇、鄰硝基苯酚、2、4、5-三氯苯酚、對硝基苯酚、2，4-二硝基苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚、N-羥基鄰苯二甲酰亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、1-羥基哌啶和5-氯-8-羥基喹啉。
16.制備權利要求1至11之一的產物的酶促方法，其特征在于在水解酶類型的酶催化劑存在下，α氨基酸與組胺或甲基-取代的組胺縮合。
17.按照權利要求16的方法，其特征在于所述酶催化劑是水解酶，其選自從微生物中或從動物中提取得到的脂酶和蛋白酶。
18.按照權利要求1至12之一的產物用于制備治療內障的藥物。
19.按照權利要求1至12之一的產物用于制備治療動脈粥樣硬化的藥物。
20.按照權利要求1至12之一的產物用于制備治療炎癥的藥物。
21.按照權利要求1至12之一的產物用于制備治療與氧化應激有關的疾病的藥物，例如光敏癥、卟啉癥和紅斑狼瘡。
22.按照權利要求1至12之一的產物用于制備抗內毒素血癥和與過度產生自由基NO·有關的其它血管病的藥物。
23.按照權利要求1至12之一的產物用于制備治愈組織如皮膚組織、胃粘膜和眼組織的藥物。
24.按照權利要求10的產物用于制備治療胃損傷的藥物，其中所述假二肽產物的形式是與鋅原子的螯合物。
25.按照權利要求1至12之一的產物用于制備作為放射保護劑的藥物。
26.按照權利要求1至12之一的產物用于制備用作膠原合成抑制劑的藥物。
27.按照權利要求26的應用所得藥物，其用于治療某些糖尿病并發(fā)癥，減少皮膚治愈過程中的瘢痕瘤。
28.按照權利要求1至12之一的產物用于制備用于組織如粘膜和皮膚組織的再生和復壯的治療或美容組合物。
29.按照權利要求1至12之一的產物用于制備作為強化疫苗效力的免疫刺激劑的藥物。
30.按照權利要求1至12之一的產物用于制備能抗血小板凝集的藥物。
31.按照權利要求1至12之一的產物用于制備抗變態(tài)反應的藥物。
32.按照權利要求1至12之一的產物用于保存和穩(wěn)定易氧化物質、食品和保存離體器官和組織。
全文摘要
以下通式的假二肽產物，其中A為形式a)其中B代表氮原子直接與碳原子相連的胺，可以是胺、亞胺或銨，R表示氟原子、氟烷基、功能團、?；⒅辨溚榛?、鏈烯基或芳香基，R表示氫原子、氟原子、烷基或氟烷基，Im表示咪唑環(huán)或N-取代咪唑環(huán)；或為形式b)，其中，R表示氫原子、氟烷基、?；蚩杀灰粋€或幾個功能團取代的烴基，R″表示烴基或?；?。
文檔編號A61P7/00GK1136808SQ9419438
公開日1996年11月27日 申請日期1994年11月3日 優(yōu)先權日1993年11月5日
發(fā)明者M-C·西根, M·巴比扎耶吾 申請人:摩納哥愛克希莫爾股份有限公司, M·巴比扎耶吾