專利名稱：一種hcv的dna疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和感染免疫領(lǐng)域，具體涉及ー種丙型肝炎病毒(hepatitisC Virus, HCV)的DNA疫苗，本發(fā)明還涉及該疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
我國是HCV高感染率國家之一，HCV感染是導(dǎo)致慢性肝炎、肝癌、肝硬化的主要因素之一，嚴(yán)重影響人類健康。目前尚無有效的治療和預(yù)防性HCV疫苗。HCV的最終控制將取決于疫苗預(yù)防。在抵擋病毒的入侵過程和免疫抵抗HCV攻擊人體細(xì)胞中，特異性中和性抗體和細(xì)胞免疫起到了非常重要的作用。HCV包膜(envelope)糖蛋白(El和E2)能夠誘使機體產(chǎn)生中和抗體，阻斷病毒的入侵。包膜E2蛋白是誘導(dǎo)中和抗體的主要靶抗原，雖然E2蛋白的變異性較高，但近年在E2中鑒定出了一系列保守的中和抗體表位，這給HCV疫苗的開發(fā)帶來了新希望。DNA疫苗已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于こ型肝炎病毒，狂犬病毒和人類獲得免疫缺陷病毒的預(yù)防和治療中。它的基本原理是將編碼抗原的基因片斷直接通過肌肉注射或基因槍等方法直接導(dǎo)入宿主體內(nèi)，DNA體內(nèi)攝取后，抗原蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾及立體構(gòu)象和自然感染時所產(chǎn)生的抗原蛋白完全一祥，抗原性好，這些內(nèi)生(源)性蛋白抗原經(jīng)MHC I類途徑呈遞，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性淋巴反應(yīng)(CTL)效應(yīng)性⑶8+T細(xì)胞；可溶性抗原蛋白釋放到細(xì)胞外后，被專職抗原遞呈細(xì)胞(APC)攝取，然后經(jīng)MHC II類途徑呈遞，活化CD4+T細(xì)胞，及其隨后產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞活化，因此DNA免疫可全面誘導(dǎo)機體的免疫反應(yīng)。HCV病毒體基因編碼3011個氨基酸的長開放讀碼框。在病毒復(fù)制中，氨基端有三個蛋白(C、E1、E2 / NSl)，羧基端有四個蛋白(NS2、NS3、NS4、NS5) (Pwalotsky JM,Gastroenterology, 2002,122 (6) :1554—1568)。HCV E 區(qū)包膜糖蛋白是誘導(dǎo)中和抗體的主要抗原區(qū)，故HCV E區(qū)及其編碼的抗原是HCV疫苗研究的重點(Fournillier，etal. J. Virol, 2001; 75:12088)。HCV的包膜蛋白El和E2在病毒識別、粘附、侵入宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。E1E2含有T、B細(xì)胞表位，可以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)，是保護(hù)性抗原。糖基化是蛋白翻譯后的重要修飾加工環(huán)節(jié)，可以誘導(dǎo)蛋白空間構(gòu)象正確折疊，增加蛋白的酶親水性，穩(wěn)定性，并且可以調(diào)節(jié)蛋白的抗原性。El和E2上含有多個保守的N-糖基化位點，即在HCV的不同基因型中N-糖基化位點均是保守存在的。其中EI有5個N-糖基化位點，E2 上有 11 個(Goffard, A et al.，J. Virol, 2005，79:8400-8409 ；Slater-Handshyet al, Virology, 2004, 319(1):36-48)。盡管E1E2的功能和作用已經(jīng)比較清楚,然而E1E2的免疫保護(hù)性仍然較低。另外，HCV的基因編碼的El和E2蛋白的分子量大小分別是31KD和70KD，其原核表達(dá)蛋白不能形成蛋白質(zhì)的糖基化，且表達(dá)困難，而真核表達(dá)的產(chǎn)量較低且純化困難。因而E1E2在實際免疫保護(hù)中的應(yīng)用受到了限制，不利于推廣
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于針對上述不足，提供ー種具有更強免疫保護(hù)性的E1E2突變體。本發(fā)明的第二個目的在于提供能夠產(chǎn)生上述突變體的DNA疫苗。本發(fā)明的第三個目的在于提供上述DNA疫苗的制備方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供ー種HCV包膜 糖蛋白E1E2突變體，其為El蛋白和E2蛋白的融合蛋白，并且El蛋白的第2個糖基化位點由N突變?yōu)镈，E2蛋白的第8個糖基化位點由N突變?yōu)镈。即，該突變體是E1E2蛋白的N-糖基化位點突變，氨基酸由原來的天冬酰胺突變?yōu)樘於彼岬玫?，具體所述突變是E1E2蛋白的E1-N209SS突變?yōu)镋1-D209SS，E2-N430AS突變?yōu)镋2-D430AS。所述突變體的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。該突變體可誘導(dǎo)產(chǎn)生比野生型HCVE1E2更強的特異性細(xì)胞免疫(CTL)和中和性抗體(neutralizingantibody, NAb)。進(jìn)ー步本發(fā)明提供所述HCV包膜糖蛋白E1E2突變體的基因。為促進(jìn)構(gòu)建得到的DNA疫苗的激活功能，優(yōu)選對該基因序列進(jìn)行CpG修飾，連接上CpG序列，較佳的CpG序列為GACGTT。較佳的所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。本發(fā)明所述的核酸疫苗(DNA疫苗)即包含上述基因，其被構(gòu)建于表達(dá)載體上，例如病毒載體，優(yōu)選所述載體為pVAX-1 (美國FDA認(rèn)可用于人體的DNA疫苗的載體)。在HCV野生型E1E2基因(例如以HCV病毒基因型Ia的E1E2的真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3_ElE2 為模板，PCR 獲得的 E1E2 基因序列(Chen F，et al. , Antimicrobialagents and Chemotherapy, 2010，p3355_3364))兩端分別引入CpG序列以及酶切位點BamHI+EcoRI，將該片段構(gòu)建到質(zhì)粒載體上，再用定點突變PCR方法將E1E2上相應(yīng)的糖基化位點的天冬酰胺密碼子突變?yōu)樘於彼崦艽a子，BamHI+EcoRI雙酶切該質(zhì)粒載體及表達(dá)載體(例如pVAX-1 )，連接，篩選正確連接的重組載體即得。本發(fā)明構(gòu)建的N-糖基化位點突變的HCV的E1E2糖基化突變體能產(chǎn)生更強的免疫原性，能誘導(dǎo)比野生型更強的細(xì)胞免疫和中和性抗體產(chǎn)生，因而可以有效地清除病毒，在體外能有效地中和病毒感染。本發(fā)明DNA疫苗以真核表達(dá)質(zhì)粒DNA為免疫原，直接和CpG佐劑聯(lián)合免疫，克服了糖基化蛋白質(zhì)在原核和真核表達(dá)上的困難，有效地中和病毒進(jìn)ー步感染。


圖I顯示的是采用乳酸脫氫酶釋放實驗(LDH實驗)檢測小鼠細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)特異性殺傷活性的結(jié)果。CpG增強了小鼠的的特異性CD8+T殺傷活性即CTL，其中CpG-N2N8誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL活性最高，與WT - E1E2組相比*p < 0. 05。E:T代表效靶細(xì)胞的比例。圖2顯示的是定量RT-PCR檢測病毒感染Huh7. 5. I細(xì)胞的病毒RNA表達(dá)情況。結(jié)果CpG-N2N8免疫小鼠的血清抑制JHl(2a)HCVCC感染Huh7. 5. I細(xì)胞的中和能力最強。與對照和WT組相比*p〈0. 05。圖3顯示的是免疫印跡(Western Blot)檢測病毒感染Huh7. 5. I細(xì)胞的病毒蛋白表達(dá)情況。與野生型HCVE1E2組相比，CpG-N2N8免疫小鼠后獲得的血清對HCVcc感染有更明顯的中和作用。(A) WB檢測血清中和抑制HCV的NS3的表達(dá)(不同突變體免疫小鼠的的抗血清按照1:200的比例稀釋，C代表CpG) ; (B) WB檢測血清中和抑制HCV的E2的表達(dá)。
圖4顯示的是免疫后小鼠血清對HCVpp感染的抑制情況。結(jié)果CpG_N2N8免疫小鼠后獲得的血清均能有效抑制7個基因型的HCVpp感染Huh7. 5. I細(xì)胞，與WT-E1E2組相比*p < 0. 05。表I顯示的為各組突變體免疫小鼠后，小鼠的抗體水平，以及血清學(xué)轉(zhuǎn)換情況。
具體實施例方式以下實施例用于進(jìn)ー步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所 熟知的常規(guī)手段。實施例I一、構(gòu)建含有E1E2野生型及突變體的真核重組質(zhì)粒載體為pVAX_l,pcDNA3.1-E1E2質(zhì)粒載體(Chen F，et al. , Antimicrobial agentsand Chemotherapy, 2010, p3355_3364)含有完整la型HCV的E1E2的全長基因序列(基因序列號為AY958062),由BamHI+EcoRI酶切插入pVAX-1 (Invitrogen)載體。。再用定點突變PCR方法將E1E2上相應(yīng)的糖基化位點的天冬酰胺突變?yōu)樘於彼?。BamHI+EcoRI雙酶切pVAX-1，和E1E2及糖基化突變體片段，連接，獲得重組質(zhì)粒分別命名為平pVAX-CpG-N2N8，CpG-N8, CpG-Nl3, CpG_N2N4，CpG_N2N8，CpG_N2N14。構(gòu)建中所需引物如下E1E2-P1:5’ -CGGGATCCGCCACCATGGGTTCCTCTTTTTCTATE1E2-P2:5’ -CGGAATTCTACGCCTCCGCTTGGGATAE1E2-P3:5， -CAATACTCGAGTCAGGGCAATCATE1E2-P4:5’ -TGATTGCCCTGACTCGAGTATTGTE1E2-P5:5， -GTAGATAGAGCAGTCGCAGTCTTGCGTE1E2-P6:5’ -ACGCAAGACTGCGACTGCTCTATCTACE1E2-P7:5， -TGTCGAGGCTCGCATCACAGTTCAAGGCE1E2-P8:5’ -GCCTTGAACTGTGATGCGAGCCTCE1E2-P9: ATCCAGATGAGTCCATCCAGGTGCAACCGE1E2-P10:CACCTGGATGGACTCATCTGGATTTE1E2-P11:5’ -CAAGGTGTTGTCGCCCACTCCTCCE1E2-P12:
5， -GAGGAGTGGGCGACAACACCTTGE1E2-P13: 5’ -CGGGATCCGACGTTATGGGTTCCTCTTTTTCTATCTE1E2-P14:5’ -AATGAATTCGACGTTCTACGCCTCCGCTTGGGATAT其中，E1E2-P1和E1E2-P2用來構(gòu)建E1E2全長的質(zhì)粒，E1E2-P3和E1E2-P4引物用來突變N2位點，E1E2-P5和E1E2-P6用來突變N4位點，E1E2-P7和E1E2-P8用來突變N8位點，E1E2-P9和E1E2-P10用來突變N13位點，E1E2-P11和E1E2-P12用來突變N14位點，E1E2-P13和E1E2-P14用來引入CpG序列。下面以突變N2位點為例，反應(yīng)體系如下上游產(chǎn)物的獲取下游產(chǎn)物的獲取模板質(zhì)粒pcDNA3. 1/E1E2 :lu I 模板質(zhì)粒 pcDNA3. 1/E1E2 :lu IIOmm dNTP:2iilIOmm dNTP:2iilE1E2-Pl:lu IE1E2-P4:lu IE1E2-P3:lu IE1E2-P2:lu IIOXpfu buffer:5 U IIOXpfu buffer:5 U IPfu 酶I u IPfu 酶I u IddH20:39 u IddH20:39 U I全長PCR產(chǎn)物的獲取模板上游產(chǎn)物2 ill+下游產(chǎn)物2 U IIOmm dNTP:2lilE1E2-P1:1 U IE1E2-P2:1 U IIOXpfu buffer:5 U IPfu 酶2 U IddH20:35 U I反應(yīng)條件如下
940C，5min
94TJ, 30 s ヽ
55°C, 40 s > 30 循環(huán)
72'C , 4 min ン
72 C，IOminニ、DNA疫苗免疫小鼠抗血清抗體效價比較采用OMEGA Biotek公司的提取質(zhì)粒DNA試劑盒，將重組的E1E2野生型質(zhì)粒以及糖基化突變體質(zhì)粒提取，純化，去除內(nèi)毒素后，以20ii g的量和500U IL-2(免疫佐劑)，通過基因?qū)雰x將不同質(zhì)粒分別導(dǎo)入小鼠大腿肌肉內(nèi)，每周一次，共免疫三次，E2蛋白加強免疫一次，最后一次免疫后10天時取小鼠血清，酶聯(lián)免疫吸附法檢測針對E2蛋白的抗體效價(見表I)。表I.質(zhì)粒DNA免疫后小鼠總I gG抗體效價
E2蛋白
分血清轉(zhuǎn)換數(shù)效價 IgG2a:IgGl
權(quán)利要求
1.HCV包膜糖蛋白E1E2突變體，其為El蛋白和E2蛋白的融合蛋白，并且El蛋白的第2個糖基化位點由N突變?yōu)镈，E2蛋白的第8個糖基化位點由N突變?yōu)镈。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列如SEQIDNo. I所示。
3.編碼權(quán)利要求I或2所述HCV包膜糖蛋白E1E2突變體的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，該基因還連接有CpG序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQID No. 2所示。
6.—種核酸疫苗,其包括權(quán)利要求3、任一項所述的基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸疫苗，其特征在于，所述基因構(gòu)建于表達(dá)載體上。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的核酸疫苗，其特征在于，所述表達(dá)載體為pVAX-1。
9.ー種制備權(quán)利要求7或8所述核酸疫苗的方法，該方法包括如下步驟 在HCV野生型E1E2基因兩端引入CpG序列以及酶切位點及 HI+&ORI，將該片段構(gòu)建到質(zhì)粒載體上，再用定點突變PCR方法將E1E2上相應(yīng)的糖基化位點的天冬酰胺密碼子突變?yōu)樘於彼崦艽a子，Bamm+EcoRI雙酶切該質(zhì)粒載體及表達(dá)載體，連接，篩選正確連接的重組載體即得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種HCV的DNA疫苗及其制備方法，該疫苗具有CTL細(xì)胞免疫和中和病毒感染能力。其制備方法為首先構(gòu)建含有E1E2野生型基因的重組質(zhì)粒；其次是利用定點突變PCR突變E1E2上相應(yīng)的糖基化突變體(E1-N209SS突變?yōu)镋1-D209SS，E2-N430AS突變?yōu)镋2-D430AS)，并采用PCR方法偶聯(lián)CpG序列，該突變體命名為CpG-N2N8。該DNA疫苗免疫小鼠后可獲得中和HCVcc的抗血清。本發(fā)明方法簡便，成本低，DNA疫苗可表達(dá)病毒基因，免疫后可誘導(dǎo)比野生型E1E2更強的CTL細(xì)胞免疫及中和性抗體的體液免疫應(yīng)答，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號A61P31/14GK102746387SQ20121025825
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月24日
發(fā)明者任玉珊, 林苗, 章曉聯(lián) 申請人:武漢大學(xué)