專利名稱：環(huán)狀血管活性肽的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及環(huán)肽，該肽是血管活性肽(VIP)類似物，還涉及含有該環(huán)肽的藥物組合物。該藥物組合物可用于治療支氣管氣管縮窄病。
最初以豬腸中發(fā)現(xiàn)、分離并純化血管活性腸肽(VIP)(US3879371)。該肽有28個氨基酸，它與腸促胰液肽和胰增血糖素在很多方面相同(Carlquist等人，Horm.Metab.Res.，14，28-29(1982))。VIP的氨基酸順序如下His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2[(SEQ ID NO1)-NH2]已知VIP具有很寬的生物活性范圍，它遍及胃腸道和循環(huán)系統(tǒng)。由于它類似胃腸激素，已發(fā)現(xiàn)VIP能刺激胰腺和膽汁分泌，肝糖原分解，胰增血糖素和胰島素分泌，并能使胰碳酸氫鹽釋放[Kerrins，C.和Said，S.I.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，142，1014-1017(1972)，Domschke，S.等人.，Gastroenterology，73，478-480(1977)]。
已用免疫測定法確定了含VIP的神經(jīng)元在內(nèi)分泌和外分泌系統(tǒng)、腸和平滑肌細胞中的位置[Polak，J.M.等人.，Gut，15，720-724(1974)]。已發(fā)現(xiàn)VIP是導致幾種激素釋放的神經(jīng)效應器，這幾種激素包括促乳素[Frawley，L.S.，等人Neuroendocrinology，33，79-83(1981)]，甲狀腺素[Ahren，B.，等人.，Nature，287，343-345(1980)]，胰島素及胰增血糖素[Schebalin，M.，等人.，Am.J.Physiology E.，232，197-200(1977)]。也已發(fā)現(xiàn)VIP能在體內(nèi)和體外刺激腎中釋放血管緊張肽原酶[Porter，J.P.，等人.，Neuroendocrinology，36，404-408(1983)]。已發(fā)現(xiàn)VIP存在于各種動物和人的氣道神經(jīng)和神經(jīng)末端中[Dey，R.D.，和Said，S，I.，F(xiàn)ed.Proc.，39，1062(1980);Said，S.I.，等人.，Ann，N.Y.Acad.Sci.，221，103-114(1974)]。VIP對心血管和支氣管肺的影響值得注意，因為已發(fā)現(xiàn)VIP是有效的血管舒張藥和有效的平滑肌松弛藥，它作用于外周、肺和冠狀血管床[Said，S.I.，等人.，Clin.Res.，20，29(1972)]。已發(fā)現(xiàn)VIP對大腦血管具有血管舒張作用[Lee，T.J.and Berszin，I.，Science，224，898-900[(1984)]。體外研究證明血管活性腸肽可外用于腦動脈，導致血管舒張，認為VIP可能作腦血管舒張的介質(zhì)[Lee，T.and Saito，A.，Science，224，898-910(1984)]。也已證明是有效的眼血管舒張藥[Nilsson，S.F.E.和Bill，A.，Acta Physiol.Scand.，121，385-392(1894)]。
VIP對免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用。O′Dorisio等人已證明VIP能調(diào)節(jié)淋巴細胞的增生和遷移[J.Immunol.，135，792s-796s(1985)]。
由于已發(fā)現(xiàn)VIP能使平滑肌松弛，通常它存在于氣道組織中，如上所述，曾假定VIP為支氣管平滑肌松弛的內(nèi)生介質(zhì)[Dey，R.D.and Said，S.I.，F(xiàn)ed.Proc.，39，1962(1980)]?，F(xiàn)已證明，與來自正常病人的組織相比，來自哮喘病人的組織不含任何免疫活性VIP。這或許是與哮喘病有關(guān)的VIP或VIPergic神經(jīng)纖維損失的征兆[Ollerenshaw，S.等人.，New England J.Med.，320，1244-1248(1989)]。體外和體內(nèi)試驗表明VIP能使氣管平滑肌松弛，并對支氣管收縮劑的作用有保護功能，如組胺和前列腺素F2a[Wasserman，M.A.等人.，in Vasoactive Intestinal Peptide，S.I.Said，ed.，Raven Press，N.Y.，1982，PP177-184;Said，S.I.等人.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，221，103-114(1974)]。當靜脈內(nèi)給藥時，已發(fā)現(xiàn)VIP能保護支氣管收縮劑如組胺、前列腺F2a、白三烯(Leukotrienes)、血小板活性因子以及抗原誘導的支氣管收縮[上述Said，S.I，等人.，(1982)]。也已發(fā)現(xiàn)VIP能抑制在體外人的氣道組織中粘液分泌[Coles，S.J.等人.，Am.Rev.Respir.Dis.，124，531-536(1981)]。
對于人來說，已證明若哮喘病人由靜脈內(nèi)注入藥，VIP能使高峰呼氣流的速率增加，并保護組胺誘導的支氣管擴張[Morice，A.H.and Sever，P.S.，Peptides，7，279-280(1986);Morice，A.等人，The Lancet，Ⅱ 1225-1227(1983)]。然而，由這種VIP靜脈內(nèi)注入所觀測到的肺的效果伴隨有心血管副作用，非常明顯的是低血壓和心動過速，也會引起面頰潮紅。當靜脈內(nèi)給藥劑量沒有引起心血管副作用時，則VIP不會改變特定的氣道傳導性[Palmer，J.B.D.，等人.，Thorax，41，663-666(1986)]?；钚圆蛔憧山忉尀橛捎诮o藥劑量低，并且可能由于該化合物快速降解。
當以氣溶膠對人給藥時，天然的VIP在保護組胺誘導的支氣管收縮方面只在一定程度上有效[Altieri等人.，Pharmacologist，25，123(1983)]。發(fā)現(xiàn)VIP對基線氣道參數(shù)沒有明顯影響，但當用吸入法對人給藥時，對組胺誘導的支氣管收縮會有保護作用[Barnes，P.J.and Dixon C.M.S.，Am.Rev.Respir.Dis.，130，162-166(1984)]。據(jù)報道，當以氣溶膠給藥時，VIP未出現(xiàn)與支氣管擴張有關(guān)的心動過速或低血壓反應[Said，S，I.等人.，in Vasoactivs Intestinal Peptide，S.I.Said，ed.，Raven Press，N.Y.，1928 PP 185-191]。
由于VIP有意義的、潛在的臨床有效生物活性，該物質(zhì)已成為以提高這種分子的一種或多種特性為目的的已報道的一些合成方案的目標。Takeyama等人報道的一種VIP類似物，它在位置8具有取代天冬氨酸的谷氨酸。發(fā)現(xiàn)該化合物不比天然VIP有效[Chem.Pharm.Bull.，28，2265-2269(1980)]。Wendlberger等人已公開在位置17具有取代蛋氨酸的正亮氨酸的VIP類似物的制法[Peptide，Proc.16th Eur.Pept.Symp，290-295(1980)]。發(fā)現(xiàn)該肽在顯示來自肝膜制劑的放射碘化VIP的能力方面與天然VIP是相同的。Watts和Wooton已報道一系列線狀和環(huán)狀VIP片段，它們含有6-12個天然序列的殘基(EP184309和EP325044;US4737487和US4866039)。Turner等人已報道片段VIP(10-28)是VIP的拮抗物[Peptides，7，849-854(1986)]。也已報道該取代的類似物[4-Cl-D-Phe6，Leu17]-VIP能與VIP受體結(jié)合，并對抗VIP的活性[Pandol，S等人.，Gastrointest.Liver Physiol.，13，G 553-G 557(1986)]。Gozes等人報道該類似物[Lys1，Pro2，Arg3，Arg4，Pro5，Tyr6]-VIP是膠質(zhì)細胞上與其受體結(jié)合的VIP競爭抑制劑[Endocrinology，125，2945-2949(1989)]。Robberecht等人報道的幾種VIP類似物具有在天然VIP的N-末端中所取代的D-殘基[Peptides，9，339-345(1988)]。所有這些類似物與VIP受體結(jié)合均不太緊，在C-AMP活化方面，其活性比天然VIP低。Tachibana和Ito報道了幾種前體分子的VIP類似物[in Peptide Chem.，T.Shiba and S.Sakakibara，eds.，Prot.Res.Foundation，1988，PP481-486，JP1083012，US4822774]。已證明這些化合物是支氣管擴張藥，其藥效比VIP高1-3倍，并具有1-2倍高的低血壓活性。Musso等人也報道一些在位置6-7、9-13、15-17和19-28取代的VIP類似物[Biochemistry，27，8174-8181(1988);EP8271141;US4835252]發(fā)現(xiàn)這些化合物在與VIP受體結(jié)合及生物反應方面效能與天然VIP相等或更小。Bartfai等人報道了一系列多重取代的[Leu17]-VIP類似物[International Patent Application NO.WO 89/05857]。
本發(fā)明包括環(huán)狀血管活性肽類似物。環(huán)肽是一種肽，其特征為肽鏈中一個氨基酸的側(cè)鏈羧基端通過生成酰胺鍵與肽鏈中另一個氨基酸的側(cè)鏈氨基端共價連接。肽鏈中二個氨基酸殘基間的共價鍵生成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
與母體線性類性似物相比，環(huán)肽的生物活性實質(zhì)上是不同的。環(huán)肽構(gòu)象更剛硬，具有較好確定的結(jié)構(gòu)。這些變化反映在環(huán)肽的生物外形中。肽類似物的成環(huán)作用可延長肽的作用時間，這是由于剛性增加，使它不易發(fā)生化學和酶的降解。環(huán)肽的生物利用率增加，這是由于結(jié)構(gòu)剛性化導致該肽的物理能性改變。而且，環(huán)肽有很好確定的形狀，使它比線性肽對靶受體有更大的專一性，從而可降低與所要環(huán)肽同時存在的不希望有的生物活性的傾向。
本發(fā)明包括新型的環(huán)肽，其化學式如下
其中R8是Asp，Glu或Lys;R12是Arg，Lys，Orn或Asp;R17是Met或Nle;R26是Ile或Val;R26是Asn或Thr;X是氫或能水解的氨基保護基;Y是羥基或能水解的羧基保護基;或其在藥學上有效的鹽。
最好是化學式如下的肽
其中X、Y、R8和R12如同上面化學式Ⅰ。
本發(fā)明也包括化學式為Ⅱ的新型環(huán)肽
其中R8是Asp或Asn;R17是Met或Nle;R26是Ile或Val;R28是Asn或Thr;X是氫或能水解的氨基保護基;Y是羥基或能水解的羧基保護基;或其在藥學上有效的鹽。
最好是化學式如下的肽
其中X和Y如同上面化學式Ⅱ。
本發(fā)明也包括化學式為Ⅲ的新型環(huán)肽
其中R17是Met或Nle;R26是Ile或Val;R26是Asn或Thr;X是氫或能水解的氨基保護基;Y是羥基或能水解的羧基保護基;或其在藥學上有效的鹽。
最好是化學式如下的肽
其中X和Y如同上面化學式Ⅲ。
本發(fā)明也包括化學式為Ⅳ的新型環(huán)肽
其中R12是Arg或Lys;R17是Met或Nle;R26是Ile或Val;R28是Asn或Thr;X是氫或能水解的氨基保護基;Y是羥基或能水解的羧基保護基;或其在藥學上有效的鹽。
最好是化學式如下的肽
其中X和Y如同上面化學式Ⅳ。
本發(fā)明也包括化學式為Ⅴ的新型環(huán)肽
其中R1是His，N-CH3-Ala;R2是Ser或Ala;R6是
這里的Q是環(huán)己基低級烷基或芳基低級烷基;
R8是Asp，Glu或Ala;R10是Tyr或R6;R12是Arg或Lys;R16是Gln或Ala;R17是Met，Nle或Ala;R19是Val或Ala;R22是Tyr或R6;R24是Asn或Ala;R26是Ile、Val或Leu;R27是Leu或Lys;R28是Asn，Thr或Lys;X是氫或能水解的氨基保護基;Y是羥基、能水解的羧基保護基，或R29-R30-R31-Z;R29是Gly或Ala;R30是Gly或Ala;R31是Ala、Met、Cys(Acm)或Thr;Z是羥基或能水解的羧基保護基;或其在藥學上有效的鹽。
Q最好是
其中n＝1，2;X1和X2分別為氫、OH、OCH3、F、Cl、I、CH3、CF3、NO2、NH2、N(CH3)2、NHCOCH3、NHCOC6H5或C(CH3)3。
更優(yōu)選地，Q是芐基、P-氟代芐基、P-氨基芐基、P-羥基芐基、O-甲基、1-甲基萘基或2-甲基萘基。Q最好為芐基。
最好是化學式如下的肽
其中X、Y、R1、R2、R5、R6、R10、R12、R16、R17、R19、R22、R24和R27如同上面化學式Ⅴ。
最優(yōu)選的環(huán)肽是AC-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27 28，Gly29 30，Thy31]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[AC-(SEQ ID NO52)-NH2]。
本發(fā)明肽能產(chǎn)生持續(xù)的氣管支氣管平滑肌松弛作用而沒有心血管副作用，因此，可用于治療支氣管收縮病如哮喘。
本發(fā)明涉及新型的血管活性腸肽(VIP)類似物，它能持續(xù)增加支氣管擴張活性而沒有明顯副作用。
本文所用的術(shù)語“低級烷基”包括含有1-6個碳原子的直鏈和支鏈飽和脂族烴基。優(yōu)選的低級烷基是甲基。
本文所用術(shù)語“芳基”表示單環(huán)芳烴基，如苯基，其中一個或多個位置可由低級烷基、低級烷氧基、氨基、硝基、一或二-低級烷基氨基、低級烷基酰氨基或苯基酰氨基取代或不取代。“芳基”也表示多環(huán)芳基，如萘基，它可被上述一個或多個部分所取代。優(yōu)選的芳基是苯基，未由氟取代或由氟單取代，或未取代的萘基。
本文所用的X是在氨基末端氨基酸的氨基氮上的一個取代基，Y是在羧基末端氨基酸的羰基上的一個取代基。X可為氫或能水解的氨基保護基。Y可為羥基或能水解的羧基保護基。
關(guān)于術(shù)語“能水解的氨基保護基”和“能水解的羧基保護基”，任何能通過水解除去的一般保護基團均能用于本發(fā)明。該基團的例子如下所述，優(yōu)選的氨基保護基是
其中X3是低級烷基或鹵代低級烷基。這些保護基團中，X3為C1-3烷基或鹵代C1-3烷基是特別優(yōu)選的。
優(yōu)選的羧基保護基是低級烷基酯、NH2和低級烷基酰胺，含C1-3的烷基酯，NH2和C1-3烷基酰胺是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明包括化學式為Ⅰ的新型環(huán)肽
其中R8是Asp，Glu或Lys;R12是Arg，Lys，Orn或Asp;R17是Met或Nle;R26是Ile或Val;R28是Asn或Thr;X是氫或能水解的氨基保護基，Y是羥基或能水解的羧基保護基;或其在藥學上有效的鹽。
最好是化學式如下的肽
其中X、Y、R8和R12如同上面化學式Ⅰ。
本發(fā)明也包括化學式Ⅱ的新型環(huán)肽
其中R8是Asp或Asn;R17是Met或Nle;R26是Ile或Val;R26是Asn或Thr;X是氫或能水解的氨基保護基;Y是羥基或能水解的羧基保護基;或其在藥學上有效的鹽。
最好是化學式如下的肽
其中X和Y如同上面化學式Ⅱ。
本發(fā)明也包括化學式Ⅲ的新型環(huán)肽
其中R17是Met或Nle;R26是Ile或Val;R28是Asn或Thr;X是氫或能水解的氨基保護基;Y是羥基或能水解的羧基保護基;或其在藥學上有效的鹽。
最好是化學式如下的肽
其中X和Y如同上面化學式Ⅲ。
本發(fā)明也包括化學式Ⅳ的新型環(huán)肽
其中R12是Arg或Lys;R17是Met或Nle;R26是Ile或Val;R28是Asn或Thr;X是氫或能水解的氨基保護基;Y是羥基或能水解的羧基保護基;或其在藥學上有效的鹽。
最好是化學式如下的肽
其中X和Y如同上面化學式Ⅳ。
本發(fā)明也包括化學式Ⅴ的新型環(huán)肽
其中R1是His，N-CH3-Ala;R2是Ser或Ala;R6是
這里Q是環(huán)己基低級烷基或芳基低級烷基;R8是Asp，Glu或Ala;R10是Tyr或R6;R12是Arg或Lys;R16是Gln或Ala;R17是Met，Nle或Ala;R19是Val或Ala;R22是Tyr或R6;R24是Asn或Ala;R26是Ile，Val或Leu;R27是Leu或Lys;R28是Asn，Thr或Lys;X氫或能水解的氨基保護基;Y是羥基，能水解的羧基保護基，或R29-R30-R31-Z;R29是Gly或Ala;R30是Gly或Ala;R31是Ala，Met，Cys(Acm)或Thr;Z是羥基或能水解的羧基保護基;或其在藥學上有效的鹽。
Q優(yōu)選是
其中n＝1，2;X1和X2分別為氫、OH，OCH3，F(xiàn)，Cl，I，CH3，CF3，NO2，NH2，N(CH3)2，NHCOCH3，NHCOC6H5或C(CH3)3。
更優(yōu)選，Q是芐基，P-氟代芐基，P-氨基芐基，P-羥基芐基，O-甲基，1-甲基萘基或2-甲基萘基。Q最優(yōu)選為芐基。
最好為化學式如下的肽
其中X、Y、R1、R2、R6、R8、R10、R12、R16、R17、R19、R22、R24、和R27如同上面化學式Ⅴ。
本發(fā)明還涉及所述肽的制備方法，含有該肽的藥物組合物，以及用該肽和無毒惰性的、藥學上適用的載體物料治療支氣管氣管縮窄病的方法。所述環(huán)狀多肽的制備方法，其特征在于(a)使已保護和樹脂結(jié)合的相應氨基酸順序的肽選擇性去保護以生成自由側(cè)鏈氨基基團和自由側(cè)鏈羧基基團;
(b)使自由側(cè)鏈氨基基團和自由側(cè)鏈羧基基團經(jīng)合適的酰胺生成試劑作用共價連接;和(c)用合適的去保護和分裂試劑處理，從樹脂中去保護和分裂該環(huán)化肽，若需要，在有更合適的添加劑作陽離子凈化劑情況下，若需要，使環(huán)肽轉(zhuǎn)化成在藥學上有效的鹽。
本發(fā)明還涉及用該環(huán)肽制造藥物組合物以用于治療支氣管氣管縮窄病。
用于限定該肽的術(shù)語一般是現(xiàn)有技術(shù)使用的，其中N-端氨基基團位于左邊，C-端羧基基團位于右邊。所謂天然氨基酸意思是指在蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的一種天然存在的氨基酸，即，Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Lys、Arg、Asp、Asn、Glu、Gln、Cys、Met、Phe、Tyr、Pro、Trp和His。這里的氨基酸具有異構(gòu)形式，除非另外特別指明，它表示氨基酸的L形式。
下列縮寫或符號用于表示除上述以外的氨基酸、保護基、溶劑、試劑和類似物。
符號 表示Ac 乙?；鵒rn 鳥氨酸Nle 正亮氨酸Fmoc 9-芴基甲氧羰基Fm 9-芴基甲基Boc t-丁氧基羰基Bom 芐氧基甲基CH2Cl2二氯甲烷CH3CN 乙腈DMF 二甲基甲酰胺DIPEA N，N-二異丙基乙基胺TFA 三氟乙酸HOBT N-羥基苯并三唑DCC N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺DIC N，N′-二異丙基碳化二亞胺BOP 苯并三唑-1-基氧-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽N-Me-Ala
FAB-MS 快原子轟擊質(zhì)譜測定法在“VIP”前面括號是列出的取代氨基酸表示天然VIP肽順序的類似物，在括號取代基左邊的表示N-末端氨基的衍生，即如用X表示。VIP右邊園括號中出現(xiàn)的順序號表示氨基酸刪除并加到天然順序號中，即，例如，Ac-[Lys12，Nle17，Gly29]-VIP(1-29)-NH2表示一個多肽，它具有相應于人的天然VIP的氨基酸順序，其中乙?；讶〈鶱-末端中的氫，賴氨酸已取代位置12的精氨酸，并且正亮氨酸已取代位置17的蛋氨酸。另外，甘氨酸已偶聯(lián)在天冬酰胺28的羧基位點，稱為位置29。附在VIP后面的“-OH”和“-NH2”或園括號分別表示該多肽的游離酸和酰胺形式。若二者都不附帶時，則用該表達方式來包括如上所述，環(huán)肽(如本文所限定的)是一種肽，其特征為該肽中一個氨基酸的側(cè)鏈羧基末端通過生成酰胺鍵與該肽鏈中另一個氨基酸的側(cè)鏈氨基末端共價連接。用一些術(shù)語和符號表示環(huán)肽，其例子如下
Ac-[Lys12，Nle17，Val26，Thr28]-VIP 環(huán)(8→12) b.Ac-[Lys12，Nle17，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Asp8→Lys12) c.上述三種結(jié)構(gòu)(a-c)、附帶用SEQ ID NO表示及下列順序均表示和限定相同的多肽，該多肽具有相應于人的天然VIP的氨基酸順序，其中乙?；讶〈鶱-末端中的氫，賴氨酸已取代位置12的精氨酸，正亮氨酸已取代位置17的蛋氨酸。纈氨酸已取代位置26的異亮氨酸，蘇氨酸已取代位置28的天冬酰胺。另外，位置8中天冬氨酸的側(cè)鏈羧基和位置12中賴氨酸的側(cè)鏈氨基之間已形成一個酰胺鍵，從而形成環(huán)肽類似物。認為肽結(jié)構(gòu)的上述這種表示方法是等效的且可互換。
本文所用的術(shù)語“Rn”表示本文所示一種結(jié)構(gòu)中位置n的一個氨基酸，“Xaa”表示下列順序中相應順序的位置n中的一個氨基酸，當Xaa表示選自二個或多個氨基酸的情況下，二者是等效的，且可互換。
本發(fā)明的環(huán)肽可用下列構(gòu)型，除非另有說明。
鏈中氨基酸 結(jié)合生成環(huán)肽的氨基酸末端Lys ε氨基(ε＝epsilon)Orn δ氨基(δ＝delta)Asp β羧基(β＝beta)Glu γ羧基(γ＝gamma)本發(fā)明的代表性化合物包括具有下列氨基酸順序的肽
Ac-[Lys12，Nle17，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Asp8→Lys12)[Ac-(SEQ ID NO20)-NH2]Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Glu8→Lys12)[Ac-(SEQ ID NO21)-NH2]Ac-[Asn8，Asp9，Lys12，Nle17，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Asp9→Lys12)[Ac-(SEQ ID NO22)-NH2]Ac-[Orn12，Nle17，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Asp8→Orn12)[Ac-(SEQ ID NO23)-NH2]Ac-[Lys8，Asp12，Nle17，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Lys8→Asp12)[Ac-(SEQ ID NO24)-NH2]Ac-[Glu8，Orn12，Nle17，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Glu8→Orn12)[Ac-(SEQ ID NO25)-NH2]Ac-[Lys12，Glu16，Nle17，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Lys12→Glu16)[Ac-(SEQ ID NO26)-NH2]Ac-[Lys12，Nle17，Asp24，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Lys20→Asp24)[Ac-(SEQ ID NO27)-NH2]Ac-[Lys12，Nle17，Asp25，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO28)-NH2]Ac-[Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)Ac-[p-F-Phe6，2-Nal10，Lys12，Nle17，Asp25，Val26，Thr28，Gly29，30，Met31]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO30)-NH2]Ac-[Glu8，Orn12，Nle17，Asp25，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO31)-NH2]Ac-[p-F-Phe6，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28，Gly29，30，Cys(Acm)31]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO32)-NH2]Ac-[Ala2，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO33)-NH2]Ac-[N-Me-Ala1，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP cyclo-(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO34)-NH2]Ac-[2-Nal10，Leu12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO35)-NH2]Ac-[O-CH3-Tyr10，Leu12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO36)-NH2]Ac-[p-F-Phe6，p-NH2-Phe10，Leu12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO37)-NH2]
Ac-[Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO38)-NH2]Ac-[N-Me-Ala1，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO39)-NH2]Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO40)-NH2]Ac-[O-Me-Tyr10，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO41)-NH2]Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28，Ala29-31]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO42)-NH2]Ac-[Ala2，Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28，Ala29-31]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO43)-NH2]Ac-[N-Me-Ala1，Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO44)-NH2]Ac-[p-F-Phe6，Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO45)-NH2]Ac-[1-Nal6，Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)Ac-[Glu8，p-NH2-Phe10，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO47)-NH2]Ac-[Glu8，O-CH3-Tyr10，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO48)-NH2]Ac-[p-F-Phe6，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO49)-NH2]Ac-[1-Nal6，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO50)-NH2]Ac-[Ala2，Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28，Gly29，30，Thr31]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO51)-NH2]Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28，Gly29，30，Thr31]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO52)-NH2]Ac-[Ala2，Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO53)-NH2]Ac-[p-NH2-Phe10，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO54)-NH2]
Ac-[Lys12，Nle17，Ala19，m-OCH3-Tyr22，Asp25，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO55)-NH2]Ac-[Lys12，Nle17，Ala19，m-F-L-Tyr22，Asp25，Val26，Thr28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO56)-NH2]Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，m-OCH3-Tyr22，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO57)-NH2]Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，m-F-L-Tyr22，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO58)-NH2]Ac-[Ala8，Lys12，Nle17，Ala19，Ala24，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO59)-NH2]Ac-[Glu8，Lys12，Ala16，17，19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO60)-NH2]Ac-[Ala8，Lys12，Ala16，Nle17，Ala19，Ala24，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO61)-NH2]Ac-[Ala8，Lys12，Ala16，17，19，Ala24，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO62)-NH2]Ac-[Glu8，Lys12，Ala16，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)Ac-[Glu8，Lys12，Ala16，17，19，Ala24，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO64)-NH2]Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28，Gly29，30，Thr31]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO65)-NH2]Ac-[p-F-Phe6，Glu8，Lys12，Nle17，Asp25，Val26，Thr28，Gly29，30，Thr31]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO66)-NH2]Ac-[Ala2，Glu8，Lys12，Nle17，Asp25，Leu26，Lys27，28，Gly29，30，Thr31]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO67)-NH2]Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28，Gly29，30，Thr31]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO68)-NH2]Ac-[Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28，Ala29-31]-VIP cyclo(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO69)-NH2]
本發(fā)明化合物容易通過任何公知的常規(guī)方法在氨基酸之間形成肽鍵而合成。這些常規(guī)方法包括，如，能使一個氨基酸的自由α氨基基團或含有它的羧基或其它保護反應基團的殘基，與另一個氨基酸的自由伯羧基或含有它的氨基基團或其它保護反應基團的殘基之間發(fā)生縮合的任何溶液相方法。
本發(fā)明化合物的合成工序可按二種方法進行，一種方法是在一定時間內(nèi)將所要順序的各氨基酸連續(xù)地一個個加到一個氨基酸或其殘基上，或另一種方法是先用常規(guī)方法合成具有所要氨基酸順序的肽片段，然后縮合生成所要的肽。
合成本發(fā)明新化合物的這種常規(guī)方法包括，例如任何固相肽的合成方法。在這樣一種方法中，新化合物的合成可按固相方法的一般原則進行，依次將所要的氨基酸殘基在一定時間內(nèi)一個個加到生長的肽鏈中[Merrifield，R.B.，J.Amer.Chem.Soc.85，2149-2154(1963);Barany等人.，The Peptides，Analysis，Synthesis and Biology，Vol.2，Gross，E.和Meienhofer，J.，Eds.Academic Press 1-284(1980)]。
通常肽的化學合成是用合適保護基團保護不同氨基酸部分的反應側(cè)鏈基團以防止在該位點發(fā)生化學反應，直至最終除去保護基團。通常也是保護氨基酸或片段中的α氨基基團，而該本體在羧基基團反應，然后選擇性除去α氨基保護基團，以便在該位點發(fā)生后續(xù)反應。然而，已公開有關(guān)固相合成方法的特定保護基，值得注意的是每個氨基酸可用溶液合成中通常用于相應氨基酸的保護基團來保護。
α氨基基團可用選自芳族和脂族尿烷型保護基的合適保護基保護，芳族尿烷型保護基如芐氧基羰基(Z)和取代的芐氧基羰基，如P-氯芐氧基羰基，P-硝基芐氧基羰基，P-溴芐氧基羰基，P-二苯基-異丙氧基羰基，g-芴基甲氧基羰基(Fmoc)和P-甲氧基芐氧基-羰基(Moz);脂族聚氨酯型保護基，如t-丁氧基羰基(Boc)，二異丙基甲氧基-羰基，異丙氧基羰基，和烯丙氧基羰基。對于α氨基保護而言，Boc是最優(yōu)選的。
羧基可用選自芳族和脂族的合適保護基保護，芳族酯如芐基(OBZl)或用低級烷基，鹵素，硝基，硫代，或取代的硫代，即，低級烷基(1-7碳原子)硫代基取代的芐基;脂族酯如，低級烷基，t-丁基(ot-Bu)，環(huán)戊基，環(huán)己基(OCHX)，環(huán)庚基，及9-芴基甲基(OFm)。對谷氨酸(Glu)而言，OBZl和OFm是最優(yōu)選的。對天冬氨酸(Asp)而言，OChx、OBzl和OFm是最優(yōu)選的。
羥基可用選自醚的合適保護基保護，如芐基(Bzl)或用低級烷基、鹵素取代的芐基如2，6-二氯芐基(DCB)，硝基，或甲氧基;t-丁基(t-Bu)，四氫吡喃基，和三苯甲基(trityl)。對絲氨酸(Ser)和蘇氨酸(Thr)而言，Bzl上最優(yōu)選的。對于酪氨酸(Tyr)而言，Bzl和DCB是最優(yōu)選的。
側(cè)鏈氨基基團可用選自芳族和脂族尿烷型保護基的合適保護基保護，芳族尿烷型保護基如芐氧基羰基(Z)和取代的芐氧基羰基，如P-氯芐氧基羰基、2-氯芐氧基羰基(2-Cl-Z)、P-硝基-芐氧基羰基、P-溴芐氧基羰基、P-二苯基異丙氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)和P-甲氧基-芐氧基羰基(MOZ);脂族尿烷型保護基如，t-丁氧基羰基(BOC)、二異丙基甲氧基羰基、異丙氧基羰基及烯丙氧基羰基。對于鳥氨酸(orn)，Z是最好的。對于賴氨酸(Lys)，2-Cl-Z和Fmoc是最好的。
胍基可用選自于硝基，P-甲苯磺酰(TOS)，Z，金剛烷氧基羰基和BOC中的一種合適保護基保護。對于精氨酸(Arg)，TOS是最好的。
側(cè)鏈酰胺基可用呫噸基(xan)保護。對于天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)，不保護最好。
咪唑基團可用選自于P-甲苯磺酰(TOS)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、三苯甲基(trityl)、2，4-二硝基苯基(DNP)、BOC和芐氧基甲基(BOM)中的一種合適保護基保護。對組氨酸(His)，TOS和BOM是最好的。
除非另有說明，下面所給的百分比對于固體混合物中的固體，液體中的液體及液體中的固體分別以Wt/Wt，Vol/Vol和Wt/Vol計。而且，除非另有說明，下面提到的試劑和儀器供應地不是強制性的。本領域技術(shù)人員能從其它供應地選擇類似的試劑或儀器。
所有試劑，異丙醇(iproH)、二氯甲烷(CH2Cl2)、和二甲基甲酰胺(DMF)均由Fisher或Burdick & Jackson購買，使用時無需另外蒸餾。三氟乙酸由Halocarbon，購得，使用時不再純化。二異丙基乙胺(DIPEA)由Pfaltz和Bauer購得，使用前從CaO和茚三酮中蒸餾出來。二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)和二異丙基碳化二亞胺(DIC)從Fluka購得，使用時不再純化。羥基苯并三唑(HOBT)和1，2-乙二硫醇(EDT)從Sigma化學公司購得，使用時不再純化。保護的氨基酸通常為L構(gòu)形，可從Chemical Dynamics Corp或Bachem大批得到。使用前可通過薄層色譜、核磁共振和熔點確定這些試劑的純度。Boc-O-Me-Tyr、Boc-2-Nal和Boc-P-F-Phe按Bolin，D.R.，US專利申請374503號報道的方法制備。Boc-Asp(OFm)和Boc-Glu(OFm)按報道的方法制備[Bolin，D.R.，等人.，Org.Prep.Proc.Int.，21，67-74(1989)]。二苯甲基胺樹脂(BHA)是一種苯乙烯-1%二乙烯苯共聚物(100-200或200-400篩目)，它由Biomega、Bachem、Omni或Advanced Chemtech得到。這些樹脂總氮含量通常為0.3-1.2毫克當量/g。
薄層色譜(TLC)在玻璃襯底預涂硅膠60F254的板(Merck)上用合適的溶劑體系進行?；衔镉米贤饩€熒光淬滅(254nm吸收)，碘著色，或茚三酮噴霧(對于伯胺和仲胺)進行檢測。
關(guān)于氨基酸組成的分析，在密封的真空水解管中，其中含有1-4mg苯酚的6NHCl于115℃，使肽水解達22-24小時?？稍贐eckman 121M氨基酸分析器中，或在Waters HPLC基氨基酸分析體系中用Waters Cat Ex樹脂或Pierce AA511柱和茚三酮檢測進行分析。
高效液體色譜(HPLC)在LDC裝置中進行，該裝置由Constametric Ⅰ和Ⅲ泵，Gradient Master溶劑程序器和混合器，Spectromonitor Ⅲ可變波長UV檢測器構(gòu)成。分析HPLC用Waters μBondapak C18柱(0.4×30cm)以反相方式進行。制備HPLC分離在裝有Waters Guard-Pak C18 precolumn的Whatman Magnum 20 Partisil 10 ODS-3柱(2×25cm或2×50cm)中完成。用2×85cm柱，LKB Vario-Perpex Peristaltic泵和IBM可變波長UV檢測器進行凝膠色譜。
肽最好用固相合成，通常用Merrifield所述[J.Amer.Chem.Soc.，85，2149(1963)]方法制備，雖然也能用如上所述的現(xiàn)有技術(shù)中公知的其它化學合成方法。固相合成由肽的C-末端開始，將保護的α-氨基酸連接到合適的樹脂上。這種原料的制備可通過酯鍵將一個保護α-氨基的氨基酸連接到氯甲基化樹脂或羥甲基樹脂上;或通過酰胺鍵連接到二苯甲基胺(BHA)或?qū)?甲基二苯甲基胺(MBHA)樹脂上。羥甲基樹脂的制備在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的。氯甲基化樹脂可從市場上買到，其制法在現(xiàn)有技術(shù)中也是眾所周知的。BHA和MBHA樹脂載體可從市場上買到，通常，當所要合成的肽在C-末端具有未取代的酰胺時使用。
通常，待連接到BHA樹脂上的第一個氨基酸是以Boc-氨基酸的對稱酸酐加入的，其用量為每當量樹脂氮為2-10當量活化氨基酸。連接后，洗滌樹脂，并在真空條件下干燥。樹脂上負載的氨基酸可通過等分量的Boc-氨基酸樹脂的氨基酸分析而測定。負載范圍通常為0.2-0.4毫摩爾/克樹脂。任何未反應的氨基基團可通過該樹脂與乙酸酐和二異丙基乙胺在二氯甲烷中反應而封端。
加入Boc-氨基酸后，使樹脂依次經(jīng)過幾次反復加氨基酸的循環(huán)。在酸性條件下除去α氨基Boc保護。為此目的可用在二氯甲烷中的三氟乙酸(TFA)、在二噁烷或甲酸/乙酸混合物中的HCl。最好用二氯甲烷中的50%TFA(V/V)。它還含有1-5%體積的EDT或二甲基硫化物作t-丁基正碳離子的凈化劑。也能用現(xiàn)有技術(shù)中公知的其它標準分裂試劑。
去除α氨基保護基以后，按所要次序分步連接后面的已保護的氨基酸以得到一個中間產(chǎn)物，保護的肽-樹脂。在肽固相合成中用于連接氨基酸的活化劑在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的。例如，用于該合成的合適試劑是苯并三唑-1-基氧基-三-(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽(BOP)，二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)和二異丙基碳化二亞胺(DIC)。這里最好是DCC和DIC。也能用如Barany和Merrifield所述的其它活化劑[in the Peptides，Vol.2，J.Meienhofer，ed.，Academic Press，1979，pp 1-284]。可將各種試劑如1-羥基苯并三唑(HOBT)，N-羥基丁二酰亞胺(HOSu)和3，4-二氫-3-羥基-4-氧-1，2，3-苯并三嗪(HOOBT)加到連接混合物中，以使合成循環(huán)最佳化。這里最好是HOBT。
典型的合成循環(huán)方案如下方案1步驟 試劑 時間1 CH2Cl22×30秒2 50%TFA/CH2Cl21分3 50%TFA/CH2Cl215分4 CH2Cl22×30秒5 iPrOH 2×30秒6 CH2Cl24×30秒7 6%DIPEA/CH2Cl23×2分8 CH2Cl23×30秒9 coupling 10分-18小時10 CH2Cl22×30秒11 iPrOH 1×30秒
12 CH2Cl21×30秒13 DMF 2×30秒14 CH2Cl23×30秒所有用于洗滌和連接的溶劑其用量以體積計為10-40ml/g樹脂。用預先生成的Boc-氨基酸的對稱酸酐或O-酰基異脲衍生物進行連接。通常，每當量胺樹脂加入2-10當量活化Boc氨基酸，用二氯甲烷作溶劑。在20-25%DMF/CH2Cl2中連接Boc-Arg(Tos)，Boc-Gln，Boc-Asn，Boc-His(Tos)和Boc-His(Bom)。Boc-Asn，Boc-Gln和Boc-His(Bom)作為它們的HOBT活性酯連接，從而使公知的副反應減至最少。
通常用現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知的方法按下列方式使肽環(huán)化。在肽內(nèi)氨基酸位點中待連接的是側(cè)鏈，可用不同的保護基。對于氨基位點的氨基酸，Lys和Orn，可將Nε-和Nδ-Fmoc衍生物加到肽鏈中，對于羧基位點的氨基酸，Asp和Glu，可加入Oβ-和Oγ-Fm衍生物。當肽仍連接在樹脂上時，其肽可用20-40%哌啶(在DMF中)處理以選擇性除去Fmoc和Fm保護基。然后用合適的酰胺生成劑，如二苯磷?；B氮化物(DPPA)，DCC，DIC或BOP，處理使自由側(cè)鏈氨基和羧基基團在分子內(nèi)共價連接。這里最好是DCC和BOP。
典型的環(huán)合方案如下
方案2步驟 試劑 時間1 DMF 1×30秒2 20-40%哌啶/DMF 1分3 DMF 1×30秒4 20-40%哌啶/DMF 20分5 iPrOH 1×30秒6 DMF 1×30秒7 iPrOH 2×30秒8 DMF 2×30秒9 6%DIPEA/CH2Cl22×2分10 CH2Cl21×30秒11 DMF 1×30秒12 連接劑 1-24小時13 iPrOH 1×30秒14 CH2Cl21×30秒15 DMF 2×30秒16 CH2Cl23×30秒由開氏茚三酮試驗監(jiān)測整個合成過程中的連接反應以測定反應完成的程度[Kaiser等人.，Anal.Biochem.，34，595-598(1970)]。已觀測到Bos-Arg(Tos)、Boc-Asn和Boc-Gln的反應動力學很低。任何不完全的連接反應用新配制的活化氨基酸再連接，或用上述乙酸酐處理肽樹脂而封端。將完全連接好的肽-樹脂在真空中干燥幾小時。
對每個化合物，去除保護基團，并用下列方法從樹脂中分開肽。通常，在Teflon HF裝置(Peninsula)中，在0℃，用每克樹脂為25-100μl乙烷二硫醇，1ml苯甲醚和9ml液態(tài)氟化氫處理肽-樹脂達45-60分鐘?；蛘呖捎媒?jīng)改進的二步分裂方法[Tam等人.，Tetrahedron Letters，23，2939-2940(1982)]，其中在0℃，用3ml二甲硫和1ml氟化氫處理肽-樹脂2小時，并在用90%HF處理前進行蒸發(fā)。然后在真空、在冰浴溫度下除去揮發(fā)性試劑。用Et2O和EtOAc各20ml洗滌殘余物2或3次，并過濾。用20ml10%AcOH洗滌3-4次并過濾，從樹脂中提取出肽。使合并的含水濾液冷凍干燥得到粗產(chǎn)品。
開始用Sephadex G-25細介質(zhì)凝膠色譜純化粗肽，以便從低聚物中分離單體。將肽溶于極小體積的10%AcOH中，加到凝膠柱中。用10%AcOH以0.5-1.5ml/分流速淋洗該柱。在254nm監(jiān)測流出液，將含有所要色譜帶的餾份收集在一起，并冷凍干燥以得到半-純化品。
通常用制備HPLC進行半-純化肽的純化。以很小體積的1%AcOH或0.1%TFA將肽加到柱中。通常以8.0ml/分流速，開始用10%B緩沖液，10-25%B10分鐘，25-35%B3小時梯度洗提(緩沖液A0.1%TFA/H2O，緩沖液B0.1%TFA/CH3CN)。在220nm進行UV檢測。以1.5-2.5分鐘間隔收集餾份，用分析HPLC進行檢測。將鑒定為高純度的餾份集中在一起并進行冷凍干燥。
通過如上所述的反相柱分析HPLC檢驗最終產(chǎn)品的純度。通常以2.0ml/分流速，在15分鐘內(nèi)用20-40%B的梯度洗提(緩沖液A0.022%TFA/H2O，緩沖液B0.022%TFA/CH3CN)。在210nm檢測UV。經(jīng)鑒定所有產(chǎn)品純度約為97-99%。對各個肽進行了氨基酸分析，所得到的值是在可接受的限度內(nèi)。一般，所有最終產(chǎn)品還進行快原子轟擊質(zhì)譜測定(FAB-MS)。所有產(chǎn)品均產(chǎn)生在可接受限度內(nèi)的預期母體M+H離子。
本發(fā)明的新化合物具有有價值的藥物性能。它們具有氣管舒張活性，它們是有效的支氣管擴張藥。該化合物也沒有任何心血管副作用。由這些新型肽產(chǎn)生的支氣管擴張持續(xù)時間多于2小時。因此，由于是高活性支氣管擴張藥，所以該化合物是治療支氣管縮窄病，如哮喘的有用藥劑。
化學式Ⅰ-Ⅴ的新化合物能與各種常用的藥物載體，最好是一種無毒、惰性、治療上可接受的載體物料相混合，以提供適用于治療支氣管縮窄病如哮喘的組合物。以蓋侖制劑給藥形式這些化合物的劑量取決于各種因素，如所用的特定化合物和特定配方。本領域普通技術(shù)人員可根據(jù)本文公開的有效濃度(EC50)確定有效劑量。人常用的劑量是0.01-100μg/Kg。對于具有低ED50(如0.1μg)的化合物而言，人常用劑量約為0.02-20μg/Kg。
化學式Ⅰ-Ⅴ的新化合物可與下列各種無機和有機酸生成藥學上適用的酸加合鹽，該酸如硫酸、磷酸、鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、氨基磺酸、檸檬酸、乳酸、丙酮酸、草酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、肉桂酸、乙酸、三氟乙酸、苯甲酸、水楊酸、葡糖酸、抗壞血酸及有關(guān)的酸。
本發(fā)明化合物可通過非腸道如靜脈內(nèi)、皮下、肌肉、口內(nèi)或鼻內(nèi)途徑給予病人。最好是非腸道給藥途徑是用氣霧劑通過口或鼻給藥。
通過下列實施例進一步說明本發(fā)明。
實施例 1制備Boc-Thr(Bzl)-BHA樹脂二苯甲基胺共聚苯乙烯-1%二乙烯苯交聯(lián)樹脂(9.5g，3.6毫當量，200-400ASTM目，Vega，Biochem)在100ml二氯甲烷中溶脹，過濾并按方案1的步驟7-8洗滌，Boc-Thr(Bzl)(3.35g，10.8mmol)和二環(huán)己基碳化二亞胺(1.12g，5.42mmol)在50ml CH2Cl2中反應1小時，過濾并將50ml CH2Cl2加到溶脹過的樹脂中。該混合物于室溫下?lián)u動18小時。加入DIPEA(630ml，3.6mmol)后再搖動1小時，過濾后完成方案1的步驟10-14。Kaiser茚三酮分析結(jié)果為陰性。在50ml二氯甲烷中，用1ml乙酸酐和1ml DIPEA處理樹脂使任何未反應的胺基封端，過濾并按方案1步驟13-14洗滌，樹脂真空干燥過夜，可得9.8g Boc-Thr(Bzl)-BHA樹脂。部分該樹脂經(jīng)氨基酸分析表明負載量為0.17mmol Thr/g。
實施例 2制備Ac-[Lys12、Nle17、Val26、Thr28]-Vlp環(huán)(Asp8→Lys12)[Ac-(SEQ ID NO20)-NH2]采用上述方案1，使由實施例1制備的Boc-Thr(Bzl)-BHA樹脂(9.8g，1.7mmol)進行固相合成。所有的連接都是采用由Boc-氨基酸和二環(huán)己基碳化二亞胺制備的預先生成的對稱酐進行的。連接Boc-天冬酰胺、Boc-谷氨酰胺和Boc-組氨酸(芐氧基甲基)作為各自的HOBT活性酯。通常用于完成連接步驟的反應時間為1-18小時。進行五次連接循環(huán)，用Boc-Leu(1.5g，6.0mmol)，Boc-Val(1.3g，6.0mmol)，Boc-Ser(Bzl)(1.8g，6.0mmol)，Boc-Asn(773mg，3.3mmol)和Boc-Leu(1.5g，6.0mmol)各進行一次循環(huán)。該樹脂真空干燥后可得到12.2g Boc-六肽樹脂。
8.2g(1.13mmol)的該樹脂進行六次連接循環(huán)，用Boc-Tyr(2，6-DCB)(1.77g，4.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(1.67g，4.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(1.67g，4.0mmol)，Boc-Val(876mg，4.0mmol)，Boc-Ala(762mg，4.0mmol)，和Boc-Nle(932mg，4.0mmol)各進行一次循環(huán)，可得到10.2g Boc-十二肽樹脂。
使1.26g(0.139mmol)的該樹脂進行兩次連接循環(huán)，用Boc-Gln(205mg，0.93mmol)和Boc-Lys(2-Cl-Z)(627mg，1.5mmol)各進行一次循環(huán)。使該樹脂的一半(0.069mmol)進行十四次連接循環(huán)，用Boc-Arg(Toc)(324mg，0.76mmol)，Boc-Leu(188mg，0.76mmol)，Boc-Lys(Fmoc)(354mg，0.76mmol)，Boc-Thr(Bzl)(234mg，0.76mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(333mg，0.76mmol)，Boc-Asn(97mg，0.76mmol)，Boc-Asp(OFm)(311mg，0.76mmol)，Boc-Thr(Bzl)(234mg，0.76mmol)，Boc-Phe(201mg，0.76mmol)，Boc-Val(164mg，0.76mmol)，Boc-Ala(143mg，0.76mmol)，Boc-Asp(OcHx)(238mg，0.76mmol)，Boc-Ser(Bzl)(223mg，0.76mmol)和Boc-His(Bom)(156mg，0.41mmol)各進行一次循環(huán)。使該肽-樹脂完成方案1的步驟1-8，并在20ml二氯甲烷中，用1.0ml乙酸酐和66ml DIPEA(0.38mmol)處理30分鐘。該樹脂按步驟10-14洗滌。
然后用方案2的步驟1-11進行處理，使樹脂選擇性地被解封，并在20ml蒸餾過的DMF中，七次與DCC(49mg，0.24mmol)和HOBT(32mg，0.24mmol)反應24小時。Kaiser茚三酮分析是陰性。用方案2的步驟13-16洗滌樹脂后真空干燥可得0.72g樹脂。
所述樹脂在0℃下用6ml二甲硫和2ml液體HF處理2小時。蒸發(fā)其反應混合物后的殘渣在0℃下用0.7ml茴香醚和6ml液體HF處理45分鐘。反應混合物再經(jīng)蒸發(fā)，其殘渣用1×15ml Et2O和3×15ml EtOAc洗滌。樹脂用3×20ml10%AcOH提取。合并的含水濾液凍干后得到227mg白色固體。
這種粗物料通過制備HPLC Whatman Magnum-20 ODS-3柱(2×25cm)提純，并用10-40%B(緩沖液A0.1%TFA/H2O，緩沖液B0.1%TFA/CH3CN)線性梯度洗脫4小時。通過分析HPLC分析所收集的餾份切割主峰，匯集起來凍干可得到26.7mg半純產(chǎn)品。將這種物料再次加到Magnum-20 ODX-3柱上(2×50cm)，并用相同的梯度洗脫，切割的其主峰經(jīng)凍干得9.5mg白色無定形粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因而可得正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3277.8，實驗值3276.1。
實施例 3制備Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Glu8→Lys12)[Ac-(SEQID NO21)-NH2]二苯甲基胺共聚苯乙烯-1%二乙烯苯交聯(lián)樹脂(17.7g，2.6毫克當量，200-400ASTM目，Vega Biochem)在160ml二氯甲烷中溶脹后，過濾并按方案1的步驟7-8洗滌。將樹脂再懸浮于160ml二氯甲烷中，并向其中添加Boc-Thr(Bzl)(6.25g，20.2mmol)和二環(huán)己基碳化二亞胺(2.10g，10.1mmol)。該混合物在室溫下?lián)u動8小時，過濾后進行方案1的步驟10-14。Kaiser茚三酮分析結(jié)果呈陰性。用150ml二氯甲烷中有5ml乙酸酐和5mlDIPEA的溶液處理樹脂60分鐘，使未反應的胺基封端，過濾并按步驟13-14洗滌，樹脂真空干燥過夜后可得到18.0克Boc-Thr(Bzl)-BHA樹脂。部分這種樹脂經(jīng)氨基酸分析，表明負載量為0.17mmol Thr/g。
使Boc-Thr(Bzl)-BHA樹脂(18.0g，3.06mmol)采用上述方案1進行固相合成。采用由Boc-氨基酸和二環(huán)己基碳化二亞胺制備的予先生成的對稱酸酐來完成所有的連接。Boc-天冬酰胺、Boc-谷氨酰胺和Boc-組氨酸(芐氧基甲基)連接作為各自的HOBT活性酯，進行五次連接循環(huán)，用Boc-Leu(6.1g，24.5mmol)，Boc-Val(5.32g，24.5mmol)，Boc-Ser(Bzl)(7.23g，24.5mmol)，Boc-Asn(3.13g，13.5mmol)，和Boc-Leu(6.1g，24.5mmol)各進行一次循環(huán)，其樹脂在真空下干燥后得22.9g Boc-六肽樹脂。
讓7.48g(1.0mmol)這種樹脂進行十次連接循環(huán)，用Boc-Tyr(2，6-DCB)(1.76g，4.0mmol)，Boc-Lys(2-cl-z)(1.66g，4.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(1.66g，4.0mmol)，Boc-Val(869mg，4.0mmol)，Boc-Ala(1.5g，8.0mmol)，Boc-Nle(925mg，4.0mmol)，Boc-Gln(1.08g，4.4mmol)，Boc-Lys(2-cl-z)(1.66g，4.0mmol)，Boc-Arg(Tos)(1.71g，4.0mmol)和Boc-Leu(998mg，4.0mmol)各進行一次循環(huán)，從而得到9.6g Boc-十六肽樹脂。
使7.68g(0.8mmol)該樹脂進行一次連接循環(huán)，用Boc-Lys(Fmoc)(1.5g，3.2mmol)連接得到8.32g Boc十七肽樹脂。
使6.24g(0.6mmol)該樹脂進行兩次連接循環(huán)，用Boc-Thr(Bzl)(742mg，2.4mmol)和Boc-Tyr(2，6-DCB)(1.06g，2.4mmol)各進行一次循環(huán)，從而得到6.28g Boc-十九肽樹脂。
使2.09g(0.2mmol)這種樹脂進行九次連接循環(huán)，用Boc-Asn(204mg，0.88mmol)，Boc-Asp(OFm)(340mg，0.8mmol)，Boc-Thr(Bzl)(248mg，0.8mmol)，Boc-Phe(212mg，0.8mmol)，Boc-Val(174mg，0.8mmol)，Boc-Ala(151mg，0.8mmol)，Boc-Asp(OcHx)(258mg，0.8mmol)、Boc-Ser(Bzl)(236mg，0.8mmol)和Boc-His(Bom)(330mg，0.88mmol)各進行一次循環(huán)。其肽樹脂完成方案1的步驟1-8后，用20ml二氯甲烷中0.25ml乙酸酐和70mlDIPEA的溶液處理20分鐘。再按步驟10-14洗滌該樹脂。
該樹脂用方案2的步驟1-11處理后被選擇性地解封。四分之三的這樹脂(0.15mmol)與DCC(77mg，0.37mmol)和HOBT(51mg，0.37mmol)在20ml蒸餾過的DMF中反應72小時和在20ml甲苯中反應24小時。Kaiser茚三酮分析結(jié)果為陰性。該樹脂采用方案2的步驟13-16洗滌并于真空下干燥得到1.72g樹脂。
1.14g(0.099mmol)這種樹脂，按實施例2處理而被解封，除在第2步使用1ml茴香醚和9ml的HF外。其反應混合物蒸發(fā)。殘渣用1×15mlEt2O和3×15mlEtOAC洗滌。樹脂用3×20ml10%AcOH提取。將合并的含水濾液凍干得到535mg白色固體。
這種粗物料是用Sephadex G-25細料(2×100cm柱)凝膠過濾、10%AcOH洗脫純化的。通過分析HPLC分析所收集的餾份切割單體峰，匯合凍干后得到83.5mg半純品。這種物料通過如實施例2的制備HPLC進一步純化，除了線性梯度在20-40%下操作3小時之外。主峰由分析HPLC分析所收集的餾份切割，匯合和凍干，從而獲得18.9mg白色無定形粉末。這種化合物按HPLC是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3292.0，實驗值3291.8。
實施例 4制備Ac-[Asn8，Asp9，Lys12，Nle17，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Asp9→Lys12)[Ac-(SEQ ID NO22)-NH2]使1.55g(0.15mmol)實施例3制備的Boc-十九肽樹脂進行九次連接循環(huán)，用Boc-Asp(OFm)(247mg，0.6mmol)，Boc-Asn(153mg，0.66mmol)，Boc-Thr(Bzl)(248mg，0.8mmol)，Boc-Phe(159mg，0.6mmol)，Boc-Val(130mg，0.6mmol)，Boc-Ala(113mg，0.6mmol)，Boc-Asp(OcHx)(189mg，0.6mmol)，Boc-Ser(Bzl)(177mg，0.6mmol)，和Boc-His(Bom)(248mg，0.66mmol)各進行一次循環(huán)。其肽樹脂按方案1的步驟1-8進行，再用20ml二氯甲烷中0.25ml乙酸酐和70mlDIPEA處理30分鐘，按步驟10-14洗滌該樹脂。
采用方案2的步驟1-11處理使樹脂選擇性地被解封。與DCC(77mg，0.37mmol)和HOBT(51mg，0.37mmol)在20ml蒸餾過的DMF中反應兩次達24小時和72小時，并于20ml甲苯中反應兩次達24小時和48小時。Kaiser茚三酮分析是陰性的。樹脂按方案2的步驟13-15洗滌后真空干燥得1.54g。
采用如實施例3用HF處理使1.26g(0.122mmol)的這種樹脂解封。蒸發(fā)其反應混合物，殘渣用1×15ml Et2O和3×15ml EtOAc洗滌，樹脂用3×20ml10%AcOH提取，合并含水濾液，凍干后可得白色固體485mg。
這種粗物料通過如實施例3的Sephadex G-25細粒凝膠過濾純化，可獲得83.5mg半純品。這種物料可通過如實施例3的制備HPLC進一步純化，除了以20-45%線性梯度操作3小時外，通過分析HPLC分析所收集的餾份來切割主峰，匯集并凍干而得到11.5mg白色無定形粉末。這種化合物按HPLC是單一的，因而能得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3277.8，實驗值為3277.6。
實施例 5制備Ac-[Orn12，Nle17，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Asp8→Orn12)[Ac-(SEQ ID NO23)-NH2]1.92克(0.2mmol)實施例3的Boc-十六肽樹脂進行十二次連接循環(huán)，用Boc-Orn(Fmoc)(364mg，0.8mmol)，Boc-Thr(Bzl)(495mg，1.6mmol)，Boc-Tyr(2.6-DCB)(352mg，0.8mmol)，Boc-Asn(102mg，0.44mmol)，Boc-Asp(OFm)(329mg，0.8mmol)，Boc-Thr(Bzl)(495mg，1.6mmol)，Boc-Phe(212mg，0.8mmol)，Boc-Val(174mg，0.8mmol)，Boc-Ala(151mg，0.8mmol)，Boc-Asp(OcHx)(252mg，0.8mmol)，Boc-Ser(Bzl)(236mg，0.8mmol)，和Boc-His(Bom)(330mg，0.88mmol)各進行一次循環(huán)。肽樹脂在完成方案1的步驟1-8后，用0.25ml乙酸酐和70ml DIPEA在20ml二氯甲烷中處理30分鐘。其樹脂按步驟10-14洗滌后，干燥過夜得2.38g。
按方案2的步驟1-11處理使1.38g(0.11mmol)這種樹脂選擇性地被解封，再與DCC(55mg，0.27mmol)和HOBT(37mg，0.27mmol)在20ml蒸餾過的DMF中反應24小時，在20ml甲苯中反應24小時，并且五次在20ml蒸餾過的DMF中反應24小時。Kaiser茚三酮分析稍為陽性。其樹脂按方案2的步驟13-16洗滌并真空干燥。
按實施例3用HF處理0.8g(0.05mmol)這種樹脂使其解封。蒸發(fā)反應混合物后的殘渣用1×15ml Et2O和3×15ml EtOAc洗滌。該樹脂用3×20ml10%AcOH提取。合并的含水濾液凍干后可得到429mg膠質(zhì)固體。
這種粗物料按實施例3通過Sephadex G-25細粒凝膠過濾加以純化，得到107mg半純品。這種物料可通過如實施例3的制備HPLC進一步純化，除了在10-40%線性梯度下操作3小時外。通過分析HPLC分析所收集的餾份切割主峰，匯集并凍干，可得到17.5mg白色無定形粉末。這種化合物按HPLC是單一的，因而能得到正確的氨基酸分析結(jié)果，F(xiàn)AB-MSMH計算值3263.7，實驗值3264.1。
實施例 6制備Ac-[Lys8，Asp12，Nle17，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys8→Asp12)[Ac-(SEQ ID NO24)-NH2]使實施例3制備的1.0g(0.1mmol)Boc-十六肽樹脂進行十二次連接循環(huán)，用Boc-Asp(OFm)(165mg，0.4mmol)，Boc-Thr(Bzl)(124mg，0.4mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(176mg，0.4mmol)，Boc-Asn(102mg，0.44mmol)，Boc-Lys(Fmoc)(187mg，0.4mmol)，Boc-Thr(Bzl)(124mg，0.4mmol)，Boc-Phe(106mg，0.4mmol)，Boc-Val(87mg，0.4mmol)，Boc-Ala(76mg，0.4mmol)，Boc-Asp(OcHx)(126mg，0.4mmol)，Boc-Ser(Bzl)(118mg，0.4mmol)和Boc-His(Bom)(150mg，0.4mmol)各進行一次循環(huán)。肽樹脂完成方案步驟1-8后，用0.5ml乙酸酐和35ml DIPEA在20ml二氯甲烷中處理30分鐘。樹脂按步驟10-14洗滌，并干燥過夜可得1.2g。
按方案2的步驟1-11處理可使0.8g(0.066mmol)這種樹脂選擇性地被解封，再與BOP(58mg，0.13mmol)在20ml蒸餾過的DMF中反應24小時，Kaiser茚三酮分析為陰性。其樹脂按方案2的步驟13-16洗滌后真空干燥。
通過用HF按實施例3處理使這種樹脂被解封。反應混合物蒸發(fā)后殘渣用1×15ml Et2O和3×15ml EtOAc洗滌。樹脂用3×20ml10%AcOH提取。合并的含水濾液凍干后得膠質(zhì)固體。
這種粗物料通過如實施例3Sephadex G-25細粒凝膠過濾純化，得到43.8mg半純品。這種物料再通過制備HPLC，除10-40%線性梯度操作3小時外，均按實施例3進一步加以純化。通過分析HPLC分析所收集的餾份切割主峰，匯集并凍干得7.5mg白色無定形粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3277.8，實驗值3276.4。
實施例 7制備Ac-[Glu8，Orn12，Nle17，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Glu8→Orn12)[Ac-(SEQ ID NO25)-NH2]二苯甲基胺共聚苯乙烯-1%二乙烯苯交聯(lián)樹脂(25.0g，17.5毫克當量，200-400ASTM目，Bachem)在160ml二氯甲烷中溶脹，過濾和按表1中的方案步驟7-8洗滌。將樹脂再懸浮于160ml二氯甲烷中，再往其中加Boc-Thr(Bzl)(16.2g，52.5mmol)和二環(huán)己基碳化二亞胺(5.4g，26.2mmol)。這種混合物在室溫下?lián)u動6小時，過濾，然后完成方案1的步驟10-14。Kaiser茚三酮分析當陰性。通過用5ml乙酸酐和5ml DIPEA，在150ml二氯甲烷中處理樹脂60分鐘，使未反應的胺基封端，過濾并按方案步驟13-14洗滌。將樹脂在真空下干燥過夜可得29.6g Boc-Thr(Bzl)-BHA樹脂。部分這種樹脂經(jīng)氨基酸分析，表明負載量為0.21mmol Thr/g。
使用如同上述實施例2的方案，對14.0g(2.94mmol)這種樹脂進行固相合成。進行十一次連接循環(huán)，用Boc-Leu(5.9g，23.5mmol)，Boc-Val(5.1g，23.5mmol)，Boc-Ser(Bzl)(6.9g，23.5mmol)，Boc-Asn(3.0g，13.0mmol)，Boc-Leu(5.9g，23.5mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(10.3g，23.5mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(9.8g，23.5mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(9.8g，23.5mmol)，Boc-Val(5.1g，23.5mmol)，Boc-Ala(4.4g，23.5mmol)，和Boc-Nle(5.4g，23.5mmol)各進行一次循環(huán)，得到26g Boc-十肽樹脂。
5.5g(0.61mmol)這種樹脂進行四次連接循環(huán)，用Boc-Gln(655mg，2.7mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(2.0g，4.8mmol)，Boc-Arg(Tos)(2.1g，4.8mmol)和Boc-Leu(1.2g，4.8mmol)各進行一次循環(huán)。樹脂在真空下干燥后可得6.12g，Boc-十六肽樹脂。
使2.0g(0.2mmol)這種樹脂進行十二次連接循環(huán)，用Boc-Orn(Fmoc)(91mg，0.2mmol)，Boc-Thr(Bzl)(250mg，0.8mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(352mg，0.8mmol)，Boc-Asn(102mg，0.44mmol)，Boc-Glu(OFm)(340mg，0.8mmol)，Boc-Thr(Bzl)(248mg，0.8mmol)，Boc-Phe(212mg，0.8mmol)，Boc-Val(174mg，0.8mmol)，Boc-Ala(152mg，0.8mmol)，Boc-Asp(OcHx)(252mg，0.8mmol)，Boc-Ser(Bzl)(236mg，0.8mmol)和Boc-His(Bom)(150mg，0.4mmol)各進行一次循環(huán)。其肽樹脂按方案1的步驟1-8實施后，用0.5ml乙酸酐和38ml DIPEA在30ml二氯甲烷中處理180分鐘。樹脂按步驟10-14洗滌，并在真空下干燥得2.4g。
然后，通過按方案2的步驟1-11處理，使1.15g(0.1mmol)這種樹脂選擇性地被解封，再兩次與Bop(58mg，0.13mmol)和400ml DIPEA在20ml蒸餾DMF中反應24和6小時。Kaiser茚三酮分析為陰性。其樹脂按方案2的步驟13-16洗滌，并在真空下干燥得1.05g。
通過用9ml HF，1ml茴香醚和100ml1，2-乙二硫醇在0℃下處理1小時，使這種樹脂被解封。反應混合物蒸發(fā)后其殘渣用2×15ml Et2O和2×15ml EtOAc洗滌。樹脂用4×20ml10%AcOH提取。合并的含水濾液凍干后可得到385mg淡黃色固體。
這種粗物料按實施例3通過Sephadex G-25細柱凝膠過濾純化，可得到半純化產(chǎn)品134mg。這種物料通過制備HPLC，除了以線性梯度26-36%操作3小時外，均按實施例3進一步純化。用分析HPLC分析收集的餾份切割主峰，匯集和凍干，可得23.2mg白色無定形粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因而能得到正確的氨基酸分析。FAB-MSMH計算值3277.8。實驗值3276.3。
實施例 8制備Ac-[Lys12，Glu16，Nle17，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys12→Glu16)[Ac-(SEQ ID NO26)-NH2]二苯甲基胺共聚苯乙烯-1%二乙烯苯交聯(lián)樹脂(30g，21.4毫克當量，200-400ASTM目，Bachem)，除使用19.9g Boc-Thr(Bzl)(64.3mmol)和6.6g二環(huán)己基碳化二亞胺(32.1mmol)外，按實施例22處理。該混合物于室溫下?lián)u動18小時，過濾后再完成方案1的步驟10-14。Kaiser茚三酮分析為陰性。其樹脂通過用8ml乙酸酐和8ml DIPEA在200ml二氯甲烷中處理60分鐘，使未反應的胺基封端，過濾和按方案步驟13-14洗滌。樹脂真空干燥過夜后可得34.2g Boc-Thr(Bzl)-BHA樹脂。一部分這種樹脂經(jīng)氨基酸分析，表明負載量為0.47mmol Thr/g。
0.85g(0.4mmol)這種Boc-Thr(Bzl)-BHA樹脂在Applied Biosystem 430 A型肽合成器上進行固相合成。采用由Boc-氨基酸和二環(huán)己基碳化二亞胺制備的預先生成的對稱酸酐進行所有連接。Boc-天冬酰胺、Boc-谷氨酰胺和Boc-精氨酸(甲苯磺酰基)可按常規(guī)法連接作為各自的HOBT活性酯。進行十一次連接循環(huán)，用Boc-Leu(499mg，2.0mmol)，Boc-Val(435mg，2.0mmol)，Boc-Ser(Bzl)(590mg，2.0mmol)，Boc-Asn(464mg，2.0mmol)，Boc-Leu(499mg，2.0mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(880，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Val(435mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，和Boc-Nle(462mg，2.0mmol)各進行一次循環(huán)，可得Boc-十二肽樹脂。
然后，使該樹脂按實施例2進行五次連接循環(huán)，用Boc-Glu(OFm)(340mg，0.8mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(664mg，1.6mmol)，Boc-Arg(Tos)(685mg，1.6mmol)，Boc-Leu(398mg，1.6mmol)，和Boc-Lys(Fmoc)(375mg，0.8mmol)各進行一次循環(huán)。該樹脂真空干燥后可得2.12g Boc-十七肽樹脂。
1.06g(0.2mmol)這種樹脂，通過按方案2的步驟1-11處理，可選擇性地被解封，并且兩次用BOP(177mg，0.4mmol)和200ml DIPEA在20ml蒸餾DMF中反應2小時和8小時。Kaiser茚三酮分析微顯陽性。用0.5ml乙酸酐在20ml6%DIPEA/二氯甲烷中處理樹脂10分鐘，可使未反應的胺基封端，過濾后按方案2的步驟13-16洗滌。然后用Boc-Thr(Bzl)(495mg，1.6mmol)對這種樹脂進行一次連接循環(huán)，再如上述放回Applied Biosystems 430 A型肽合成器。進行十次連接循環(huán)，用Boc-Tyr(2，6-DCB)(880mg，2.0mmol)，Boc-Asn(464mg，2.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)，Boc-Phe(531mg，2.0mmol)，Boc-Val(435mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)，Boc-Ser(Bzl)(590mg，2.0mmol)和Boc-His(TOS)(819mg，2.0mmol)各進行一次循環(huán)。肽樹脂完成方案1的步驟1-8后，與0.5ml乙酸酐和100ml DIPEA在20ml二氯甲烷中反應30分鐘。樹脂按步驟10-14洗滌后真空下干燥。
肽樹脂按實施例7解封后可得340mg粗肽。該肽可按實施例3凝膠過濾純化之后得35mg半純品。這種物料按實施例3由制備HPLC進一步純化，除了按25-35%線性梯度操作外，可得15.6mg白色無定形粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3276.6，實驗值3278.0。
實施例 9制備Ac-[Lys12，Nle17，Asp24，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys20→Asp24)[Ac-(SEQ-ID NO27)-NH2]對實施例8制備的0.42g(0.2mmol)Boc-Thr(Bzl)樹脂進行九次連接循環(huán)，用Boc-Leu(200mg，0.8mmol)，Boc-Val(174mg，0.8mmol)，Boc-Ser(Bzl)(236mg，0.8mmol)，Boc-Asp(OFm)(329mg，0.8mmol)，Boc-Leu(200mg，0.8mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(352mg，0.8mmol)，Boc-Lys(2-Cl-z)(332mg，0.8mmol)，Boc-Lys(Fmoc)(375mg，0.8mmol)和Boc-Val(174mg，0.8mmol)各進行一次循環(huán)。
按方案2的步驟1-11處理，可使這種樹脂選擇性地被解封，再與BOP(177mg，0.4mmol)和200ml DIPEA在20ml已蒸餾的DMF中反應6小時。Kaiser茚三酮分析結(jié)果為陰性。
按實施例8讓這種樹脂在Applied Biosystems model 430 A肽合成器上進行固相合成。再進行十七次連接循環(huán)，用Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Nle(462mg，2.0mmol)，Boc-Gln(493mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Arg(TOS)(856mg，2.0mmol)，Boc-Leu(499mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(880mg，2.0mmol)，Boc-Asn(464mg，2.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)，Boc-Phe(531mg，2.0mmol)，Boc-Val(435mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)和Boc-Ser(Bzl)(590mg，2.0mmol)各進行一次循環(huán)。用Boc-His(Tos)(164mg，0.4mmol)對這種樹脂進行一次連接循環(huán)，再實施方案1的步驟1-8，并用1ml乙酸酐在20ml 6%DIPEA/二氯甲烷中處理30分鐘。其樹脂按方案1的步驟10-14洗滌并于真空下干燥，可得到1.94g。
按實施例7使0.97g(0.1mmol)這種肽樹脂解封可得265mg粗肽。該肽按實施例3的凝膠過濾進行純化，得到149mg的半純品。這種物料按實施例3的制備HPLC進一步純化，除了按25-35%線性梯度操作外，得到28.1mg白色無定形粉末。這種化合物按HPLC是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3278.6，實驗值3278.8。
實施例 10制備Ac-[Lys12，Nle17，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO28)-NH2]二苯甲基胺共聚苯乙烯-1%二乙烯苯交聯(lián)樹脂(5.0g，2.6毫克當量，200-400ASTM目，Vega Biochem)在50ml二氯甲烷中溶脹，過濾和按方案1的步驟7-8洗滌。將該樹脂再懸浮于60ml二氯甲烷后，往其中添加Boc-Thr(Bzl)(2.32g，7.5mmol)和二環(huán)己基碳化二亞胺(774mg，3.75mmol)。該混合物于室溫下?lián)u動4小時，過濾后實施方案1的步驟10-14。Kaiser茚三酮分析結(jié)果為陰性。該樹脂用5ml乙酸酐和5ml DIPEA于50ml二氯甲烷中處理60分鐘?？墒谷魏挝捶磻陌坊舛?，過濾并按方案步驟13-14洗滌。該樹脂真空下干燥過夜后可得5.8g Boc-Thr(Bzl)-BHA樹脂。一部分這種樹脂經(jīng)氨基酸分析后，表明負載量為0.276mmol Thr/g。
1.44g(0.4mmol)這種樹脂，使用上述實施例2方案1進行固相合成。進行二次連接循環(huán)，用Boc-Leu(399mg，1.6mmol)，Boc-Val(348mg，1.6mmol)和Boc-Asp(OFm)(329mg，0.8mmol)各進行一次循環(huán)。使這種樹脂的一半(0.2mmol)進行四次連接循環(huán)，用Boc-Asn(204mg，0.88mmol)，Boc-Leu(199mg，0.8mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(352mg，0.8mmol)和Boc-Lys(Fmoc)(375g，0.8mmol)各進行一次循環(huán)。
按方案2的步驟1-11處理可使這種樹脂選擇性地被解封，這種樹脂再與BOP(177mg，0.4mmol)在20ml1%DIPEA/DMF中反應2小時。Kaiser茚三酮分析結(jié)果為陰性。
用Boc-Lys(2-Cl-z)(332mg，0.8mmol)使樹脂進行一次連接循環(huán)，然后按實施例8在Applied Biosystems model 430A肽合成器上進行固相合成。再進行十九次連接循環(huán)，用Boc-Val(435mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Nle(462mg，2.0mmol)，Boc-Gln(493mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Arg(Tos)(856mg，2.0mmol)，Boc-Leu(499mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(880mg，2.0mmol)，Boc-Asn(464mg，2.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)，Boc-Phe(531mg，2.0mmol)，Boc-Val(435mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)，Boc-Ser(Bzl)(590mg，2.0mmol)，和Boc-His(Tos)(819mg，2.0mmol)各進行一次循環(huán)，然后進行方案1的步驟1-8，再用1ml乙酸酐在20ml6%DIPEA/二氯甲烷中處理30分鐘。所述樹脂按方案1的步驟10-14洗滌后真空下干燥。
這種肽樹脂按實施例7解封后可得210mg粗肽。該肽按實施例3凝膠過濾純化可得到93mg半純品。這種物料除了以線性梯度27-37%操作外均按實施例3用制備HPLC進一步純化，得到26.2mg白色無定形粉末。按HPLC該化合物是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果，F(xiàn)AB-MSMH計算值3305.8，實驗值3305.8。
實施例 11制備Ac-[Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO29)-NH2]0.4g(0.1mmol)二苯甲基胺樹脂(100-200ASTM日，Bachem)，采用上述方案進行固相合成。所有連接都是采用等摩爾量的Boc-氨基酸和二異丙基碳化二亞胺進行的，通過往連接混合物添加1.5摩爾過量的HOBT，使Boc-天冬酰胺和Boc-谷氨酰胺結(jié)合起來作為各自的活性酯。連接步驟完成的反應時間一般為2-18小時。進行九次連接循環(huán)，用Boc-Thr(Bzl)(309mg，1.0mmol)，Boc-Leu(249mg，1.0mmol)，Boc-Val(217mg，1.0mmol)，Boc-Asp(OFm)(206mg，0.5mmol)，Boc-Asn(232mg，1.0mmol)，Boc-Leu(249mg，1.0mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(440mg，1.0mmol)，Boc-Lys(Fmoc)(234mg，0.5mmol)和Boc-Lys(2-Cl-Z)(415mg，1.0mmol)各進行一次循環(huán)。
這種樹脂按方案2的步驟1-11處理可被選擇性地解封，再與BOP(88mg，0.2mmol)在20ml1%DIPEA/DMF中反應2小時。Kaiser茚三酮分析結(jié)果為陰性。
進行十九次連接循環(huán)，用Boc-Ala(189mg，1.0mmol)，Boc-Ala(189mg，1.0mmol)，Boc-Nle(231mg，1.0mmol)，Boc-Gln(246mg，1.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(415mg，1.0mmol)，Boc-Arg(Tos)(428mg，1.0mmol)，Boc-Leu(249mg，1.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(415mg，1.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(309mg，1.0mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(440mg，1.0mmol)，Boc-Asn(232mg，1.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(315mg，1.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(309mg，1.0mmol)，Boc-Phe(265mg，1.0mmol)，Boc-Val(217mg，1.0mmol)，Boc-Ala(189mg，1.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(315mg，1.0mmol)，Boc-Ser(Bzl)(295mg，1.0mmol)和Boc-His(Tos)(409mg，1.0mmol)各進行一次循環(huán)。肽樹脂完成方案1的步驟1-8后，用0.5ml乙酸酐在10ml6%DIPEA/二氯甲烷中處理30分鐘。樹脂按步驟10-14洗滌后真空下干燥。
這種肽樹脂按實施例7解封，可得到304mg粗肽。其肽按實施例3用凝膠過濾純化，得215mg半純品。這種物料通過實施例3的制備HPLC進一步純化，除了按線性梯度26-36%操作外，可得到20.1mg白色無定形粉末。按HPLC該化合物中是單一的，因此可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3277.6，實驗值3277.7。
實施例 12制備Ac-[P-F-Phe6、2-Nal10、Lys12、Nle17、Asp25、Val26、Thr28、Gly29 30、Met31]-VIP(1-31)-NH2環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO30)-NH2]0.4g(0.1mmol)二苯甲基胺樹脂(100-200ASTM目，Bachem)按實施例11進行固相合成。進行三次連接循環(huán)，用Boc-Met(249mg，1.0mmol)、Boc-Gly(175mg，1.0mmol)和Boc-Gly(175mg，1.0mmol)各進行一次循環(huán)。按實施例11完成九次連接循環(huán)和環(huán)化作用。按實施例11完成十九次連接循環(huán)，第十次循環(huán)中的Boc-Ala由Boc-Val(217mg，1.0mmol)取代，第十九次循環(huán)中的Boc-Tyr(2，6-DCB)由Boc-2-Nal(158mg，0.5mmol)取代和第二十三次循環(huán)中的Boc-Phe由Boc-P-F-Phe(142mg，0.5mmol)取代除外。
這種肽樹脂按實施例7解封后可得345mg粗肽。按實施例3的凝膠過濾可純化這種肽而得到215mg半純品。這種物料經(jīng)實施例3的制備HPLC，除以線性梯度30-40%操作外，可進一步被純化，得到16.4mg白色無定形粉末。按HPLC該化合物是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3574.7，實驗值3575.1。
實施例 13制備Ac-[Glu8、Orn12、Nle17、Asp25、Val26、Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO31)-NH2]0.4g(0.1mmol)二苯甲基胺樹脂(100-200ASTM目，Bachem)按實施例11進行固體合成。按實施例11完成9次連接循環(huán)和環(huán)化作用。按實施例11完成十九次連接循環(huán)，除了第十次循環(huán)中的Boc-Ala由Boc-Val(217mg，1.0mmol)取代，第十七次循環(huán)中的Boc-Lys(2-Cl-z)由Boc-Orn(z)(366mg，1.0mmol)取代和第二十一次循環(huán)中的Boc-Asp(OcHx)由Boc-Glu(Bzl)(337mg，1.0mmol)取代外。
這種肽樹脂按實施例7解封后可得到255mg粗肽。經(jīng)實施例3的凝膠過濾可使肽純化而得到200mg半純品，這種物料除了按28-38%線性梯度操作外，可通過制備HPLC進一步純化，得到30.7mg白色無定形粉末。按HPLC該化合物是單一的，因此可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3305.8，實驗值3305.5。
實施例 14制備Ac-[P-F-Phe6，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28Gly29，30，Cys(Acm)31]-VIP(1-31)-NH2環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO32)-NH2]按實施例11使二苯甲基胺樹脂(0.4g，0.1mmol，100-200ASTM目，Bachem)進行固相合成。進行三次連接循環(huán)，用Boc-Cys(Acm)(292mg，1.0mmol)，Boc-Gly(175mg，1.0mmol)和Boc-Gly(175mg，1.0mmol)各進行一次循環(huán)。按實施例11完成九次連接循環(huán)和環(huán)化作用。按實施例11完成十九次連接循環(huán)，除了第二十三次循環(huán)中Boc-Phe由Boc-P-F-Phe(142mg，0.5mmol)取代外。
這種肽樹脂按實施例7解封后可得268mg粗肽，經(jīng)實施例3的凝膠過濾可純化肽，得到165mg半純品。這種物料除了按25-35%線性梯度操作外，可通過如實施例3的制備HPLC進一步純化，得到28.1mg白色無定形粉末。按HPLC該化合物是單一的，因而能得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3584.1，實驗值為3584.0。
實施例 15制備Ac-[Ala2、Lys12、Nle17、Ala19、Asp25、Val26、Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO33)-NH2]二苯甲基胺樹脂(1.5g，0.4mmol，100-200ASTM日，Bachcm)按實施例11在Applied Biosystcms model 430 A肽合成器上進行固相合成。進行八次連接循環(huán)，用Boc-Thr(Bzl)(619mg，2.0mmol)，Boc-Leu(499mg，2.0mmol)，Boc-Val(435mg，2.0mmol)，Boc-Asp(OFm)(822mg，2.0mmol)，Boc-Asn(464mg，2.0mmol)，Boc-Leu(499mg，2.0mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(880mg，2.0mmol)，和Boc-Lys(Fmoc)(938mg，2.0mmol)各進行一次循環(huán)。
經(jīng)方案2的步驟1-11處理可使這種樹脂選擇性地被解封，并與Boc(356mg，0.8mmol)在20ml1%DIPEA/DMF中反應2小時。Kaiser茚三酮分析結(jié)果為陰性。該樹脂按方案2的步驟13-16洗滌，再于真空下干燥。可得1.9g Boc-八肽樹脂。
0.95g(0.2mmol)這種樹脂按實施例11在Applied Biosystems model 430 A肽合成器上再次進行固相合成。進行十八次連接循環(huán)，用Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Nle(462mg，2.0mmol)，Boc-Gln(493mg，2.0mmol)，Boc-lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Arg(Tos)(856mg，2.0mmol)，Boc-Leu(499mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(880mg，2.0mmol)，Boc-Asn(464mg，2.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)，Boc-Phe(531mg，2.0mmol)，Boc-Val(435mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)和Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)各進行一次循環(huán)，可得到1.54g Boc-廿六肽樹脂。
0.77g(0.1mmol)這種樹脂，采用上述如實施例2的方案進行固相合成。進行二次連接循環(huán)，用Boc-Ala(76mg，0.4mmol)和Boc-His(Tos)(328mg，0.8mmol)各進行一次循環(huán)。在肽樹脂完成方案1的步驟1-8后，用0.5ml乙酸酐在20ml6%DIPEA/二氯甲烷中處理60分鐘。其樹脂按步驟10-14洗滌，并在真空下干燥可得到0.74g。
按實施例7使這種肽樹脂解封，得到172mg粗肽。經(jīng)如實施例3的凝膠過濾使肽純化得到110mg半純品。這種物料，除了按22-37%線性梯度操作外，可由如實施例3的制備HPLC進一步純化，得到40.0mg白色無定形粉末。這種化合物按HPLC是單一的，因而可獲得正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3261.7，實驗值3261.8。
實施例 16制備Ac-[N-Me-Ala1、Lys12、Nle17、Ala19、Asp25、Val26、Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO34)-NH2]0.77g(0.1mmol)，實施例15制備的Boc-廿六肽樹脂，采用上述如實施例2的方案進行固相合成。進行兩次連接循環(huán)，用Boc-Ser(Bzl)(118mg，0.4mmol)，和Boc-N-Me-Ala(81mg，0.4mmol)各進行一次循環(huán)。在對肽樹脂完成方案1的步驟1-8后，用BOP(442mg，1.0mmol)，乙酸(57ml，1.0mmol)和DIPEA(523ml，3.0mmol)在20mlDMF中處理6小時，然后用0.5ml乙酸酐在20ml6%DIPEA二氯甲烷中處理60分鐘。樹脂按步驟10-14洗滌并在真空下干燥可得0.73g。
這種肽樹脂按實施例7解封可得到191mg粗肽，其肽經(jīng)如實施例3的凝膠過濾可得138mg半純品。這種物料除了按22-37%線性梯度操作外，可用如實施例3的制備HPLC進一步純化，得到28.0mg，白色無定形粉末。按HPLC其化合物是單一的，因而可獲得正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3225.4，實驗值3225.8。
實施例 17制備Ac-[2-Nal10、Leu12、Nle17Ala19Asp25、Val26、Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO35)-NH2]采用如實施例2的方案1使二苯甲基胺樹脂(4.0g，1.08mmol，100-200ASTM目，Bachem)進行固相合成。進行八次連接循環(huán)，用Boc-Thr(Bzl)(1.34g，4.3mmol)，Boc-Leu(925mg，4.3mmol)，Boc-Val(938mg，4.3mmol)，Boc-Asp(OFm)(889mg，2.1mmol)，Boc-Asn(557mg，2.4mmol)，Boc-Leu(925mg，4.3mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(1.9g，4.3mmol)，和Boc-Lys(Fmoc)(1.1g，4.3mmol)各進行一次循環(huán)。
經(jīng)方案2的步驟1-11處理可使這種樹脂選擇性地被解封，其后與BOP(885mg，2.0mmol)在20ml1%DIPEA/DMF中反應2小時。Kaiser茚三酮分析結(jié)果為陰性。按方案2的步驟13-16洗滌樹脂。
用Boc-Lys(2-Cl-z)(1.79g，4.3mmol)使這種樹脂進行一次連接循環(huán)，再于真空下干燥，可得6.3g Boc-九肽樹脂。
使1.89g(0.3mmol)這種樹脂進行九次連接循環(huán)，用Boc-Ala(227mg，1.2mmol)，Boc-Ala(227mg，1.2mmol)，Boc-Nle(278mg，1.2mmol)，Boc-Gln(325mg，1.32mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(498mg，1.2mmol)，Boc-Arg(Tos)(514mg，1.2mmol)，Boc-Leu(299mg，1.2mmol)，Boc-Leu(498mg，2.0mmol)，和Boc-Thr(Bzl)(371mg，1.2mmol)各進行一次循環(huán)，得到2.06g Boc-十八肽樹脂。
使0.68g(0.1mmol)這種樹脂進行十次連接循環(huán)，用Boc-2-Nal(126mg，0.4mmol)，Boc-Asn(102mg，0.44mmol)，Boc-Asp(OcHx)(126mg，0.4mmol)，Boc-Thr(Bzl)(124mg，0.4mmol)，Boc-Phe(106mg，0.4mmol)，Boc-Val(87mg，0.4mmol)，Boc-Ala(76mg，0.4mmol)，Boc-Asp(OcHx)(126mg，0.4mmol)，Boc-Ser(Bzl)(118mg，0.4mmol)和Boc-His(Tos)(164mg，0.4mmol)各進行一次循環(huán)。肽樹脂完成方案1的步驟1-8后，用0.5ml乙酸酐在20ml6%DIPEA/二氯甲烷中處理60分鐘。樹脂按步驟10-14洗滌后在真空下干燥，可獲得0.82g。
按實施例7解封這種肽樹脂可得261mg粗肽。經(jīng)如實施例3的凝膠過濾純化肽可得186mg半純品。這種物料除了按30-40%線性梯度操作外，用如實施例3的制備HPLC可進一步純化，得到60.1mg白色無定形粉末。按HPLC該化合物是單一的，因而能得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3296.8，實驗值3295.6。
實施例 18制備Ac-[O-Me-Tyr10，Leu12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO36)-NH2]使0.68g(0.1mmol)由實施例17制備的Boc-十八肽樹脂按實施例17進行十次連接循環(huán)，而第十九次循環(huán)中的Boc-2-Nal為Boc-Tyr(O-Me)(59mg，0.2mmol)所取代除外，得到0.61克肽樹脂。
該肽樹脂按實施例7解封后可得175mg粗肽。由如實施例3的凝膠過濾可使肽純化而得到半純品136mg。這種物料除了按28-38%線性梯度操作外，可通過如實施例3的制備HPLC進一步得到純化，獲得42.4mg白色無定形粉末。按HPLC該化合物是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3276.7，實驗值3276.0。
實施例 19制備Ac-[P-F-Phe6，P-NH2-Phe10，Leu12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO37)NH2]0.625g(0.09mmol)Boc-十八肽樹脂按實施例17完成十次連接循環(huán)，第十九次循環(huán)中Boc-2-Nal為Boc-P-NH(z)-Phe(166mg，0.4mmol)所取代和第二十三次循環(huán)中Boc-Phe為Boc-P-F-Phe(113mg，0.4mmol)所取代除外，可得0.84g肽樹脂。
這種肽樹脂按實施例7解封后可得粗肽182mg。該肽通過如實施例3的凝膠過濾可被純化，得到160mg半純品。這種物料按25-35%線性梯度操作外，通過如實施例3的制備HPLC可進一步得到純化，得到47.2mg白色無定形粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因而能得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3279.7，實驗值3279.8。
實施例 20制備Ac-[Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO38)-NH2]使用如實施例2的方案1的二苯甲基胺樹脂(1.25g，1.0mmol，100-200ASTM目，Bachem)進行固相合成。進行八次連接循環(huán)，用Boc-Lys(2-Cl-Z)(1.66g，4.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(1.66g，4.0mmol)，Boc-Leu(925mg，4.0mmol)，Boc-Asp(OFm)(823mg，2.0mmol)，Boc-Asn(511mg，2.2mmol)，Boc-Leu(925mg，4.0mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(1.76g，4.0mmol)，和Boc-Lys(Fmoc)(937mg，2.0mmol)各進行一次循環(huán)。
這種樹脂通過用方案2的步驟1-11處理可被選擇性地解封，再與BOP(885mg，2.0mmol)在20ml1%DIPEA/DMF中反應2小時。Kaiser茚三酮分析結(jié)果為陰性。樹脂按方案2的步驟13-16洗滌。
用Boc-Lys(2-Cl-z)(1.66g，4.0mmol)使這種樹脂進行一次連接循環(huán)并在真空下干燥，可得2.7g Boc-九肽樹脂。
0.54g(0.2mmol)這種樹脂按實施例8在Applied Biosystems model 430 A的肽合成器上進行固相合成。進行十八次連接循環(huán)，用Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Nle(462mg，2.0mmol)，Boc-Gln(493mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Arg(Tos)(856mg，2.0mmol)，Boc-Leu(499mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(880mg，2.0mmol)，Boc-Asn(464mg，2.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)，Boc-Phe(531mg，2.0mmol)，Boc-Val(435mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)和Boc-Ser(Bzl)(590mg，2.0mmol)各進行一次循環(huán)，可得到1.16g Boc-廿七肽樹脂。
使0.54g(0.1mmol)這種樹脂用Boc-His(Tos)(819mg，2.0mmol)進行一次連接循環(huán)，再完成方案1的步驟1-8，用0.5ml乙酸酐在20ml6%DIPEA/二氯甲烷中處理60分鐘。其樹脂按方案1的步驟10-14洗滌后于真空下干燥，可得0.5g肽樹脂。
這種肽樹脂按實施例7解封，除了使用5ml HF和0.5ml茴香醚外，可得到127mg粗肽。通過如實施例3的凝膠過濾可使肽純化，得到74.6mg半純品。這種物料除按24-34%線性梯度操作外，可通過如實施例3的制備HPLC進一步得到純化，從而得到17.1mg白色無定形粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3333.8，實驗值3333.4。
實施例 21制備Ac-[N-Me-Ala1，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO39)-NH2]使0.58g(0.1mmol)實施例20制備的Boc-廿七肽樹脂用Boc-N-Me-Ala(81mg，0.4mmol)進行一次連接循環(huán)，然后完成方案1的步驟1-8，并用BOP(443mg，1.0mmol)、乙酸(57ml，1.0mmol)和DIPEA(523ml，3.0mmol)在20ml DMF中處理6小時，和用0.5ml乙酸酐在20ml 6%DIPEA/二氯甲烷中處理60分鐘，樹脂按方案1的步驟10-14洗滌，并真空干燥可得到0.4g肽樹脂。
這種肽樹脂按實施例20解封后可得到165mg粗肽。該肽在用如實施例3的凝膠過濾法提純后，可得到101mg半純品。這種物料除了按24-34%線性梯度操作外，經(jīng)如實施例3的制備HPLC可進一步得到純化，結(jié)果得到19.8mg白色無定形粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3281.8，實驗值3281.9。
實施例 22制備Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO40)-NH2]
使由實施例20制備的0.54g(0.2mmol)Boc-九肽樹脂，在如實施例8的Applid Biosystems modal 430 A肽合成器上進行固相合成。進行十八次連接循環(huán)，用Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Nle(462mg，2.0mmol)，Boc-Gln(493mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Arg(Tos)(856mg，2.0mmol)，Boc-Leu(499mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(880mg，2.0mmol)，Boc-Asn(464mg，2.0mmol)，Boc-Glu(OBZl)(675mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)，Boc-Phe(531mg，2.0mmol)，Boc-Val(435mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)和Boc-Ser(Bzl)(590mg，2.0mmol)各進行一次循環(huán)，可得到0.58g的Boc-廿七肽樹脂。
使這種樹脂用Boc-His(Tos)(164mg，0.4mmol)進行一次連接循環(huán)，然后完成方案1的步驟1-8，再于20ml6%DIPEA/二氯甲烷內(nèi)用0.5ml乙酸酐處理60分鐘。其樹脂按方案1的步驟10-14洗滌，并于真空下干燥可獲得0.53g肽樹脂。
這種肽樹脂按實施例7解封，除了使用5ml HF和0.5ml茴香醚外，可得到151mg粗肽。該肽用如實施例3的凝膠過濾法純化，可得到110mg半純品。這種物料除按23.5-33.5%線性梯度操作外，均按實施例3的制備HPLC可進一步得到純化，得到22.8mg白色無定形粉末。按HPLC該化合物是單一的，因而能得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3347.9，實驗值3347.0。
實施例 23制備Ac-[O-Me-Tyr10，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO41)-NH2]由實施例17制備的1.84g(0.3mmol)Boc-九肽樹脂，在如實施例8的Applied Biosystems model 430 A肽合成器上進行固相合成。進行九次連接循環(huán)，用Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Nle(462mg，2.0mmol)，Boc-Gln(493mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Arg(Tos)(856mg，2.0mmol)，Boc-Leu(499mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，和Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)各進行一次循環(huán)，可得到2.2g Boc-十八肽樹脂。
使0.73g(0.1mmol)的這種樹脂進行十次連接循環(huán)，用Boc-Tyr(O-Me)(59mg，0.2mmol)，Boc-Asn(102mg，0.44mmol)，Boc-Asp(OcHx)(126mg，0.4mmol)，Boc-Thr(Bzl)(124mg，0.4mmol)，Boc-Phe(106mg，0.4mmol)，Boc-Val(87mg，0.4mmol)，Boc-Ala(76mg，0.4mmol)，Boc-Asp(OcHx)(126mg，0.4mmol)，Boc-Ser(Bzl)(118mg，0.4mmol)和Boc-His(Tos)(164mg，0.4mmol)各進行一次循環(huán)。這種肽樹脂在完成方案1的步驟1-8后，于20ml6%DIPEA/二氯甲烷中用0.5ml乙酸酐處理60分鐘。其樹脂按步驟10-14洗滌，并于真空下干燥可獲得0.77g肽樹脂。
這種肽樹脂按實施例7解封后可得187mg粗肽。該肽通過如實施例3的凝膠過濾可被純化而得到131mg半純品。這種物料除按26-36%線性梯度操作外，通過如實施例3的制備HPLC可進一步得到純化，得到5.3mg白色無定形粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3291.8，實驗值3291.7。
實施例 24制備Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28，Ala29-31]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO42)-NH2]采用如實施例2的方案1使二苯甲基胺樹脂(1.1g，0.5mmol，200-400ASTM目，Biomega)進行固相合成。進行十三次連接循環(huán)，用Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Leu(499mg，2.0mmol)，Boc-Asp(OFm)(823mg，2.0mmol)，Boc-Asn(511mg，2.2mmol)，Boc-Leu(499mg，2.0mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(881mg，2.0mmol)，Boc-Lys(Fmoc)(936mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，和Boc-Ala(378mg，2.0mmol)各進行一次循環(huán)。
這種樹脂通過用方案2的步驟1-11處理可被選擇性地解封并與BOP(443mg，1.0mmol)在20ml1%DIPEA/DMF中反應1小時。Kaiser茚三酮分析結(jié)果為陰性。其樹脂按方案2的步驟13-16洗滌，并在真空下干燥，可得到2.02g Boc-十三肽樹脂。
0.8g(0.2mmol)這種樹脂在如實施例8Applied Biosystems model 430 A肽合成器上進行固相合成，進行十六次連接循環(huán)，用Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Nle(462mg，2.0mmol)，Boc-Gln(493mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Arg(Tos)(856mg，2.0mmol)，Boc-Leu(499mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(880mg，2.0mmol)，Boc-Asn(464mg，2.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)，Boc-Phe(531mg，2.0mmol)，Boc-Val(435mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，和Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)各進行一次循環(huán)，可得到1.2g Boc-廿九肽樹脂。
如上述用Boc-Ser(Bzl)(590mg，2.0mmol)和Boc-His(Tos)(819mg，2.0mmol)使0.6g(0.1mmol)的這種樹脂進行兩次連接循環(huán)，從而得到0.72g。這種樹脂在完成方案1的步驟1-8后，用0.5ml乙酸酐在20ml 6%DIPEA/二氯甲烷中處理60分鐘。該樹脂按方案1的步驟10-14洗滌后于真空下干燥得到0.645g肽樹脂。
這種肽樹脂按實施例7解封可得到280mg粗肽。該粗肽通過如實施例3的凝膠過濾可被純化而得到160mg半純品。這種物料除按22-32%線性梯度操作外，可通過如實施例3的制備HPLC進一步得到純化，得到23.1mg白色無定形粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因此可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3561.1，實驗值3560.8。
實施例 25制備Ac-[Ala2，Gln8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28，Ala29-31]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO43)-NH2]按照上述的用Boc-Ser(Bzl)(590mg，2.0mmol)和Boc-His(Tos)(819mg，2.0mmol)對實施例24的0.6g(0.1mmol)Boc-廿九肽樹脂進行兩次連接循環(huán)，得到0.68g樹脂。這種樹脂在完成方案1的步驟1-8后，在20ml6%DIPEA/二氯甲烷中用0.5ml乙酸酐處理60分鐘。其樹脂在按方案1的步驟10-14洗滌后，在真空下干燥可得到0.56g肽樹脂。
這種肽樹脂按實施例7解封后可得160mg粗肽。該肽通過如實施例3的凝膠過濾被純化而得到70mg半純品。這種物料除按25-35%線性梯度操作外，通過如實施例3的制備HPLC可進一步被純化，得到21.8mg白色無定形的粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因而能得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3545.1，實驗值3545.3。
實施例 26制備Ac-[N-Me-Ala1，Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO44)-NH2]1.1g(0.4mmol)實施例20的Boc-九肽樹脂，在如實施例8的Applied Biosytems model 430 A肽合成器上進行固相合成。進行十七連接循環(huán)，用Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Nle(462mg，2.0mmol)，Boc-Gln(493mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Arg(Tos)(856mg，2.0mmol)，Boc-Leu(499mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(880mg，2.0mmol)，Boc-Asn(464mg，2.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)，Boc-Phe(531mg，2.0mmol)，Boc-Val(435mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，和Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)各進行一次循環(huán)，可獲得2.24g Boc-廿六肽樹脂。
用Boc-Ser(Bzl)(238mg，0.8mmol)和Boc-N-Me-Ala(163mg，0.8mmol)，使1.1g(0.2mmol)這種樹脂進行兩次連接循環(huán)，然后完成方案1的步驟1-8，并于20ml DMF中用Boc-Cl(100mg，0.2mmol)，乙酸(23ml，0.2mmol)和DIPEA(140ml，0.4mmol)處理1小時。其樹脂按方案1的步驟10-14洗滌后，于真空下干燥可獲得0.95g肽樹脂。
按實施例7解封這種肽樹脂，可得到245mg粗肽。該肽經(jīng)如實施例3的凝膠過濾純化后可獲得165mg半純品。其物料除按25-35%線性梯度操作外，通過如實施例3的制備HPLC可得到進一步純化，得到33.7mg白色無定形粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3295.8，實驗值3294.5。
實施例 27制備Ac-[P-F-Phe6，Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO45)-NH2]使用如實施例2的方案1，對二苯甲基胺樹脂(2.49g，2.0mmol，100-200ASTM目，Bachem)進行固相合成。進行六次連接循環(huán)，用Boc-Lys(2-Cl-Z)(3.32g，8.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(3.32g，8.0mmol)，Boc-Leu(1.85g，8.0mmol)，Boc-Asp(OFm)(823mg，2.0mmol)，Boc-Asn(1.02g，4.4mmol)和Boc-Leu(1.05g，8.0mmol)各進行一次循環(huán)。樹脂干燥后移去0.4mmol。進行三次連接循環(huán)，用Boc-Tyr(2，6-DCB)(2.52g，6.4mmol)，Boc-Lys(Fmoc)(1.87g，6.4mmol)和Boc-Lys(2-Cl-Z)(2.65g，6.4mmol)各進行一次循環(huán)。
這種樹脂通過用方案2的步驟1-11處理，可選擇性地被解封，再與BOP(1.42g，3.2mmol)在20ml1%DIPEA/DMF中反應4.5小時。Kaiser茚三酮分析結(jié)果為陰性。樹脂按方案2步驟13-16洗滌后干燥，可得6.56g Boc-九肽樹脂。
1.64g(0.4mmol)這種樹脂，在如實施例8的Applied Biosystems model 430 A肽合成器上進行固相合成。進行十三次連接循環(huán)，用Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Nle(462mg，2.0mmol)，Boc-Gln(493mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Arg(Tos)(856mg，2.0mmol)，Boc-Leu(499mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(880mg，2.0mmol)，Boc-Asn(464ng，2.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)，和Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)各進行一次循環(huán)，可獲得2.56g的Boc-廿二肽樹脂。
使0.64g(0.1mmol)這種樹脂進行六次連接循環(huán)，用Boc-P-F-Phe(283mg，1.0mmol)，Boc-Val(218mg，1.0mmol)，Boc-Ala(189mg，1.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(315mg，1.0mmol)，Boc-Ser(Bzl)(295mg，1.0mmol)，和Boc-His(Tos)(818mg，2.0mmol)各進行一次循環(huán)。肽樹脂完成方案1的步驟1-8后，在20ml6%DIPEA/二氯甲烷中用0.5ml乙酸酐處理60分鐘，樹脂用步驟10-14洗滌并在真空下干燥，可得0.69g肽樹脂。
按實施例7解封這種肽樹脂，可得到224mg粗肽。該肽通過如實施例3的凝膠過濾可純化，得到213mg的半純品。這種物料除按27-37%線性梯度操作外，可通過如實施例3的制備HPLC得到進一步純化，得到70.5mg白色無定形粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3365.9，實驗值3365.6。
實施例 28制備Ac-[1-Nal6，Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO46)-NH2]使1.28g(0.2mmol)實施例27的Boc-廿二肽樹脂進行如實施例27的六次連接循環(huán)，而第一次循環(huán)的Boc-P-F-Phe被Boc-1-Nal(315mg，1.0mmol)取代除外。該肽樹脂完成方案1的步驟1-8后，用0.5ml乙酸酐在20ml6%DIPEA/二氯甲烷中處理60分鐘。樹脂按步驟10-14洗滌并于真空下干燥，可得1.41g肽樹脂。
按實施例7解封這種肽樹脂，可得到420mg粗肽。該肽按實施例3用凝膠過濾純化可得305mg半純品。這種物料除了按25-35%線性梯度操作外，通過制備HPLC可進一步得到純化，得到66.9mg白色無定形粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3398.0，實驗值3398.8。
實施例 29制備Ac-[Glu8，p-NH2-Phe10，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO47)-NH2]
1.64g(0.4mmol)實施例27的Boc-九肽樹脂，在如實施例8的Applied Biosystems model 430 A肽合成器上進行固相合成。進行九次連接循環(huán)，用Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Nle(462mg，2.0mmol)，Boc-Gln(493mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Arg(Tos)(856mg，2.0mmol)，Boc-Leu(499mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，和Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)各進行一次循環(huán)，得到2.2g Boc-十八肽樹脂。
1.1g(0.2mmol)這種樹脂進行十次連接循環(huán)，用Boc-P-NH(CBZ)-Phe(415mg，1.0mmol)，Boc-Asn(512mg，2.2mmol)，Boc-Glu(Bzl)(675mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(620ng，2.0mmol)，Boc-Phe(532mg，2.0mmol)，Boc-Val(436mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)，Boc-Ser(Bzl)(590mg，2.0mmol)和Boc-His(Tos)(1.64g，4.0mmol)各進行一次循環(huán)。肽樹脂完成方案1的步驟1-8后，在20ml6%DIPEA/二氯甲烷中用0.5ml乙酸酐處理60分鐘。按步驟10-14洗滌樹脂，并于真空下干燥，可得到1.45g的肽樹脂。
用實施例7解封該肽樹脂可得580mg粗肽，該肽按實施例3凝膠過濾可純化，得到400mg半純品。這種物料除了按22-32%線性梯度操作外，通過制備HPLC可被進一步純化，得到60.9mg白色無定形粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3346.9，實驗值3346.8。
實施例 30制備Ac-[Glu8，O-Me-Tyr10，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO48)-NH2]使1.1g(0.2mmol)實施例29的Boc-十八肽樹脂按實施例29進行十次連接循環(huán)，除了第一環(huán)中的Boc-P-NH(CBZ)-Phe被Boc-O-Me-Tyr(148mg，0.5mmol)取代外。肽樹脂完成方案1的步驟1-8后，在20ml6%DIPEA/二氯甲烷中用0.5ml乙酸酐處理60分鐘。樹脂按步驟10-14洗滌并于真空下干燥，可得到1.45g肽樹脂。
按實施例7解封這種肽樹脂，可得555mg粗肽。該肽如實施例3用凝膠過濾可得到純化，得到460mg半純品。這種物料除按25-35%線性梯度操作外，按實施例3用制備HPLC可進一步純化，得到152.9mg白色無定形粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因此能得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3361.9，實驗值3361.7。
實施例 31制備Ac-[P-F-Phe6，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO49)-NH2]1.2g(0.2mmol)實施例17的Boc-九肽樹脂，在如實施例8的Applied Biosystems model 430 A肽合成器上進行固相合成。進行十三次連接循環(huán)，用Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Nle(462mg，2.0mmol)，Boc-Gln(493mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Arg(Tos)(856mg，2.0mmol)，Boc-Leu(499mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(880mg，2.0mmol)，Boc-Asn(464mg，2.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)，和Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)各進行一次循環(huán)，得到1.3g Boc-廿二肽樹脂。
按實施例27使0.65g(0.1mmol)這種樹脂進行六次連接循環(huán)。該肽樹脂在完成方案1的步驟1-8后，在20ml的6%DIPEA/二氯甲烷中用0.5ml乙酸酐處理60分鐘。樹脂按步驟10-14洗滌后，再于真空下干燥，可得到0.856g肽樹脂。
按實施例7解封這種肽樹脂可獲得550mg粗肽。該肽按實施例3用凝膠過濾純化，得到225mg的半純品。這種物料除按27-37%線性梯度操作外，按實施例3用制備HPLC可進一步純化，得到80.9mg白色無定形粉末。按HPLC該化合物是單一的，因此可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3295.7，實驗值3296.2。
實施例 32制備Ac-[1-Nal6，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO50)-NH2]按實施例27對0.65g(0.1mmol)實施例31的Boc-廿二肽樹脂進行六次連接循環(huán)，除了第一循環(huán)中的Boc-P-F-Phe為Boc-1-Nal(315mg，1.0mmol)所取代外。肽樹脂在完成方案1的步驟1-8后，在20ml6%DIPEA/二氯甲烷中用0.5ml乙酸酐處理60分鐘。其樹脂按步驟10-14洗滌并于真空下干燥可得0.801g肽樹脂。
按實施例7解封這種肽樹脂得到250mg粗肽。該肽按實施例3用凝膠過濾純化，得到188mg半純品。這種物料除按27-37%線性梯度操作外，按實施例3用制備HPLC可進一步純化，得到28.0mg白色無定形粉末。按HPLC該化合物是單一的，因而能得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3327.8，實驗值3328.5。
實施例 33制備Ac-[Ala2，Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28，Gly29，30，Thr31]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO51)NH2]采用如實施例2的方案1，使二苯甲基胺樹脂(1.1g，0.5mmol，200-400目，Biomega)進行固相合成。按實施例24進行十三次連接循環(huán)，除了第一次循環(huán)中的Boc-Ala被Boc-Thr(Bzl)(619mg，2.0mmol)所取代，第二次循環(huán)中的Boc-Ala被Boc-Gly(350mg，2.0mmol)所取代以及第三次循環(huán)中的Boc-Ala被Boc-Gly(350mg，2.2mmol)所取代外，得到2.03g Boc-十三肽樹脂。
1.22g(0.3mmol)的這種樹脂，按實施例8在AppliedBiosystems model 430 A肽合成器上進行固相合成。按實施例24進行十六次連接循環(huán)，除了第十一次循環(huán)的Boc-Asp(OcHx)被Boc-Glu(Bzl)(675mg，2.0mmol)取代外，得到1.95g Boc-廿九肽樹脂。
按上述用Boc-Ala(378mg，2.0mmol)和Boc-His(Tos)(819mg，2.0mmol)對0.975g(0.15mmol)這種樹脂進行二次連接循環(huán)，得到1.05g樹脂。這種樹脂在完成方案1的步驟1-8后，在20ml6%DIPEA/二氯甲烷中用0.5ml乙酸酐處理60分鐘。樹脂按方案1的步驟10-14洗滌，并于真空下干燥得到0.897g肽樹脂。
按實施例7解封這種肽樹脂，可得到270mg粗肽。該肽按實施例3用凝膠過濾純化，得到150mg半純品。這種物料除按24-34%線性梯度操作外，可按實施例3用制備HPLC進一步純化，獲得28.7mg白色無定形粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3547.1，實驗值3546.9。
實施例 34制備Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28，Gly29，30，Thr31]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO52)NH2]按實施例33對0.975g(0.15mmol)實施例33Boc-廿九肽樹脂進行二次連接循環(huán)，除了第一次環(huán)中的Boc-Ala被Boc-Ser(Bzl)(590mg，2.0mmol)取代，得到0.915g肽樹脂。
按實施例7解封這種肽樹脂得到303mg粗肽。該肽按實施例3用凝膠過濾純化，得到180mg半純品。這種物料除按25-35%線性梯度操作外，按實施例3用制備HPLC可進一步純化，得到42.8mg白色無定形粉末。按HPLC這一化合物是單一的，因而能得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3563.1，實驗值3562.6。
實施例 35制備Ac-[Ala2，Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28，]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO53)-NH2]按實施例8使0.27g(0.1mmol)實施例20的Boc-九肽樹脂在Applied Biosystems model 430 A肽合成器上進行固相合成。進行十九次連接循環(huán)，用Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Nle(462mg，2.0mmol)，Boc-Gln(493mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Arg(Tos)(856mg，2.0mmol)，Boc-Leu(499mg，2.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(830mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(880mg，2.0mmol)，Boc-Asn(464mg，2.0mmol)，Boc-Glu(Bzl)(675mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)，Boc-Phe(531mg，2.0mmol)，Boc-Val(435mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)，Boc-Ser(Bzl)(590mg，2.0mmol)和Boc-His(Tos)(818mg，2.0mmol)各進行一次循環(huán)，可得到0.57g Boc-廿八肽樹脂。
這種樹脂在完成方案1的步驟1-8后，在20ml6%DIPEA/二氯甲烷中用0.5ml乙酸酐處理60分鐘。其樹脂按方案1的步驟10-14洗滌并于真空下干燥。可得到0.506g肽樹脂。
按實施例7解封這種肽樹脂可得160mg粗肽。該肽按實施例3用凝膠過濾純化，得到100mg半純品。這種物料除按25-35%線性梯度操作外，可按實施例3用制備HPLC進一步純化，得到17.1mg白色無定形粉末。按HPLC這一化合物是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3331.9，實驗值3332.0。
實施例 36制備Ac-[P-NH2-Phe10，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO54)-NH2]由實施例17制備的0.6g(0.1mmol)Boc-九肽樹脂，按實施例8在Applied Biosystems model 430 A肽合成器上進行固相合成。按實施例23進行九次連接循環(huán)，可得0.72g Boc-十八肽樹脂。用Boc-P-NH(CBZ)-Phe(166mg，0.4mmol)使這種樹脂進行一次連接循環(huán)，獲得0.79g Boc-十九肽樹脂。該樹脂按實施例8在Applied Biosystems model 430 A肽合成器上進行固相合成。按實施例23進行九次連接循環(huán)，獲得0.72g Boc-十八肽樹脂。讓這種樹脂按實施例8在Applied Biosystems model 430 A肽合成器上進行固相合成。進行九次連接循環(huán)，用Boc-Asn(464mg，2.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(618mg，2.0mmol)，Boc-Phe(531mg，2.0mmol)，Boc-Val(435mg，2.0mmol)，Boc-Ala(378mg，2.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(630mg，2.0mmol)，Boc-Ser(Bzl)(590mg，2.0mmol)，和Boc-His(Tos)(819mg，2.0mmol)各進行一次循環(huán)得到0.91g。這種樹脂在完成方案1的步驟1-8后在20ml6%DIPEA/二氯甲烷中用0.5ml乙酸酐處理60分鐘。其樹脂用方案1的步驟10-14洗滌并在真空下干燥，可得到0.85g肽樹脂。
按實施例7解封該肽樹脂可得到350mg粗肽。該肽按實施例3用凝膠過濾純化，獲得138mg半純品。這種物料除按25-35%線性梯度操作外，按實施例3用制備HPLC可進一步純化，得到25.2mg白色無定形粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3276.8，實驗值3276.2。
實施例 37制備Ac-[Lys12，Nle17，Ala19，m-OCH3-Tyr22，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO55)-NH2]采用如實施例2的方案1，使二苯甲基胺樹脂(0.125g，0.1mmol，200-400ASTM目，Bachem)進行固相合成。進行九次連接循環(huán)，用Boc-Thr(Bzl)(310mg，1.0mmol)，Boc-Leu(267mg，1.0mmol)，Boc-Val(217mg，1.0mmol)，Boc-Asp(OFm)(212mg，0.5mmol)，Boc-Asn(255mg，1.1mmol)，Boc-Leu(249mg，1.0mmol)，Boc-m-OCH3-Tyr(Bzl)(80mg，0.2mmol)，Boc-Lys(Fmoc)(234mg，0.5mmol)，和Boc-Lys(2-Cl-Z)(415mg，1.0mmol)各進行一次循環(huán)。
通過使用方案2的步驟1-11的處理，該樹脂可被選擇性地解封，在10ml1%DIPEA/DMF中與BOP(132mg，0.3mmol)反應3.5小時。Kaiser茚三酮分析結(jié)果為陰性。按方案2的步驟13-16洗滌樹脂。
進行十九次連接循環(huán)，用Boc-Ala(189mg，1.0mmol)，Boc-Ala(189mg，1.0mmol)，Boc-Nle(231mg，1.0mmol)，Boc-Gln(270mg，1.1mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(415mg，1.0mmol)，Boc-Arg(Tos)(428mg，1.0mmol)，Boc-Leu(267mg，1.0mmol)，Boc-Lys(2-Cl-Z)(415mg，1.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(310mg，1.0mmol)，Boc-Tyr(2，6-DCB)(220mg，0.5mmol)，Boc-Asn(256mg，1.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(315mg，1.0mmol)，Boc-Thr(Bzl)(310mg，1.0mmol)，Boc-Phe(265mg，1.0mmol)，Boc-Val(217mg，1.0mmol)，Boc-Ala(189mg，1.0mmol)，Boc-Asp(OcHx)(315mg，1.0mmol)，Boc-Ser(Bzl)(295mg，1.0mmol)，和Boc-His(Tos)(409mg，1.0mmol)各進行一次循環(huán)。
這種樹脂在完成方案1步驟1-8后，在10ml6%DIPEA/二氯甲烷中用0.5ml乙酸酐處理60分鐘。樹脂按方案1的步驟10-14洗滌并在真空下干燥，可得0.814g。
按實施例7解封這種肽樹脂，得到265mg粗肽。按實施例3用凝膠過濾純化肽，可得150mg半純品。這種物料除以23-33%線性梯度操作外，按實施例3用制備HPLC可進一步純化，得到8.1mg白色無定形粉末。按HPLC這一化合物是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3307.8，實驗值3306.8。
實施例 38制備Ac-[Lys12，Nle17，Ala19，m-F-L-Tyr22，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO56)-NH2]采用如實施例2的方案1使二苯甲基胺樹脂(0.125g，0.1mmol，100-200ASTM目，Bachem)進行固相合成。按實施例37進行二十八次連接循環(huán)，除了第七次循環(huán)中的Boc-m-OCH3-Tyr(Bzl)由Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl)(78mg，0.2mmol)取代外，可獲得0.754g肽樹脂。
按實施例7解封這種肽樹脂，可得到254mg粗肽。按實施例3用凝膠過濾純化肽，得到114mg半純品。這種物料除了按27-37%線性梯度操作外，如實施例3用制備HPLC可進一步純化，得到15.1mg白色無定形粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3295.7，實驗值3295.5。
實施例 39制備Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，m-OCH3-Tyr22，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO57)-NH2]
采用如實施例2的方案1，使二苯甲基胺樹脂(0.125g，0.1mmol，100-200ASTM目，Bachem)進行固相合成。按實施例37進行二十八次連接循環(huán)，除第一次循環(huán)中的Boc-Thr(Bzl)被Boc-Lys(2-Cl-z)(415mg，1.0mmol)所取代，第二次循環(huán)中的Boc-Leu被Boc-Lys(2-Cl-z)(415mg，1.0mmol)所取代，第三次循環(huán)中的Boc-Val被Boc-Leu(268mg，1.0mmol)取代和第二十一次循環(huán)中的Boc-Asp(OcHx)被Boc-Glu(O-Bzl)(337mg，1.0mmol)取代，得到0.90g肽樹脂。
按實施例7解封這種肽樹脂，可得到270mg粗肽。按實施例3用凝膠過濾使肽純化，可得到155mg半純品。這種物料除了以25-35%線性梯度操作外，按實施例3用制備HPLC可進一步純化，得到29.6mg白色無定形粉末。按HPLC該化合物是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3377.9，實驗值3377.9。
實施例 40制備Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，m-F-L-Tyr22，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO58)-NH2]采用如實施例2的方案1，使二苯甲基胺樹脂(0.125g，0.1mmol，100-200ASTM目，Bachem)進行固相合成。按實施例39進行二十八次連接循環(huán)，除第七次循環(huán)中的Boc-m-OCH3-Tyr(Bzl)為Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl)(78mg，0.2mmol)取代外，得到0.83g肽樹脂。
按實施例7解封這種肽樹脂，可得到240mg粗肽。按實施例3用凝膠過濾純化其肽，得到100mg半純品。這種物料除按25-35%線性梯度操作外，按實施例3用制備HPLC進一步純化，得到37.2mg白色無定形粉末。按HPLC該化合物是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3365.9，實驗值3365.8。
實施例 41制備Ac-[Ala8，Lys12，Nle17，Ala19，Ala24，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO59)-NH2]采用如實施例2的方案1，使二苯甲基胺樹脂(0.125g，0.1mmol，100-200ASTM目，Bachem)進行固相合成。按實施例39進行二十八次連接循環(huán)，而第五次循環(huán)中的Boc-Asn被Boc-Ala(189mg，1.0mmol)取代，第七次循環(huán)中的Boc-m-OCH3-Tyr(Bzl)被Boc-Tyr(2，6-DCB)(440mg，1.0mmol)取代和第二十一次循環(huán)中的Boc-Glu(OBzl)被Boc-Ala(189mg，1.0mmol)取代除外，可得0.85g。
按實施例7解封這種肽樹脂，可得255mg粗肽。按實施例3用凝膠過濾純化肽可得到112mg半純品。這種物料除以25-35%線性梯度操作外，按實施例3用制備HPLC可進一步被純化，得到12.0mg白色無定形粉末。按HPLC該化合物是單一的，因而能得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3246.8，實驗值3246.7。
實施例 42制備Ac-[Glu8，Lys12，Ala16，17，19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO60)-NH2]采用如實施例2的方案1，使二苯甲基胺樹脂(0.125g，0.1mmol，100-200ASTM目，Bachem)進行固相合成。按實施例41進行二十八次連接循環(huán)，而第五次循環(huán)中的Boc-Ala為Boc-Asn(256mg，1.1mmol)取代，第十二次循環(huán)中的Boc-Nle為Boc-Ala(189mg，1.0mmol)取代，第十三次循環(huán)中的Boc-Gln為Boc-Ala(189mg，1.0mmol)取代，和第二十一次循環(huán)中的Boc-Ala為Boc-Glu(OBzl)(337mg，1.0mmol)取代除外，可得到0.80g肽樹脂。
按實施例7解封這種肽樹脂，可得到254mg粗肽。按實施例3用凝膠過濾純化肽，可獲得115mg半純品。這種物料除以20-30%線性梯度操作外，按實施例3用制備HPLC可進一步純化，得到32.1mg白色無定形粉末。按HPLC該化合物是單一的，因此可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3248.7，實驗值3248.3。
實施例 43制備Ac-[Ala8，Lys12，Ala16，Ale17，Ala19，Ala24，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO61)-NH2]
采用如實施例2的方案1，使二苯甲基胺樹脂(0.125g，0.1mmol，100-200ASTM目，Bachem)進行固相合成。按實施例41進行二十八連接循環(huán)，而第十三次循環(huán)中的Boc-Gln被Boc-Ala(189mg，1.0mmol)取代除外，可得到0.93克。
按實施例7解封這種肽樹脂，可獲得250mg粗肽。該肽按實施例3用凝膠過濾純化，可得到100mg半純品。這種物料除按27-37%線性梯度操作外，按實施例3用制備HPLC進一步純化，得到23.6mg的白色無定形粉末。按HPLC該化合物是單一的，因而得正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3189.8，實驗值3189.9。
實施例 44制備Ac-[Ala8，Lys12，Ala16，17，19，Ala24，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO62)-NH2]采用實施例2的方案1，使二苯甲基胺樹脂(0.125g，0.1mmol，100-200ASTM目，Bachem)進行固相合成。按實施例43進行二十八次連接循環(huán)，而第十二次循環(huán)中的Boc-Nle被Boc-Ala(189mg，1.0mmol)取代除外，得到0.762g。
按實施例7解封這種肽樹脂，可得240mg粗肽。按實施例3使用凝膠過濾純化肽，可得到150mg半純品。這種物料除了按22-32%線性梯度操作外，按實施例3用制備HPLC可進一步純化，得到55.3mg白色無定形粉末。按HPLC該化合物是單一的，因此能得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3147.7，實驗值3148.0。
實施例 45制備Ac-[Glu8，Lys12，Ala16，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO63)-NH2]采用如實施例2的方案1，使二苯甲基胺樹脂(0.125g，0.1mmol，100-200ASTM目，Bachem)進行固相合成。按實施例42進行二十八次連接循環(huán)，而第十二次循環(huán)中的Boc-Ala被Boc-Nle(231mg，1.0mmol)取代除外，得到0.775g。
按實施例7解封這種肽樹脂，得203mg粗肽。按實施例3用凝膠過濾純化肽，可得100mg半純品。這種物料除按27-37%線性梯度操作外，按實施例3用制備HPLC可進一步純化，得到40.0mg白色無定形粉末。按HPLC化合物是單一的，因而可得正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3290.8，實驗值3290.5。
實施例 46制備Ac-[Glu8，Lys12，Ala16，17，19，Ala24，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO64)-NH2]采用如實施例2的方案1，使二苯甲基胺樹脂(0.125g，0.1mmol，100-200ASTM目，Bachem)進行固相合成。按實施例43進行二十八次連接循環(huán)，而第二十一次循環(huán)中的Boc-Ala為Boc-Glu(OBzl)(337mg，1.0mmol)取代除外，得到0.837g。
按實施例7解封這種肽樹脂，得到178mg粗肽。按實施例3用凝膠過濾純化肽，可得到126mg半純品。這種物料除了按20-30%線性梯度操作外，按實施例3用制備HPLC可進一步純化，得到24.9mg白色無定形粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因此能得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值計算值3205.7，實驗值3205.2。
實施例 47制備Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28，Gly29，30，Thr31]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO65)-NH2]采用如實施例2的方案1，使二苯甲基胺樹脂(0.125g，0.1mmol，100-200ASTM目，Bachem)進行固相合成。進行三次連接循環(huán)，用Boc-Thr(Bzl)(310mg，1.0mmol)，Boc-Gly(175mg，1.0mmol)，和Boc-Gly(175mg，1.0mmol)，各進行一次循環(huán)。按實施例37進行二十八次循環(huán)，而第七次循環(huán)中的Boc-m-OCH3-Tyr(Bzl)為Boc-Tyc(2，6-DCB)(440mg，1.0mmol)取代，第二十一次循環(huán)中的Boc-Asp(OcHx)為Boc-Glu(O-Bzl)(337mg，1.0mmol)取代除外，得到0.895g，肽樹脂。
按實施例7解封這種肽樹脂，得到440mg粗肽。按實施例3用凝膠過濾純化肽，可得到120mg半純品。這種物料除按25-35%線性梯度操作外，按實施例3用制備HPLC進一步純化，得到27.7mg白色無定形粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因而能獲得正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3506.9，實驗值3205.8。
實施例 48制備Ac-[p-F-Phe6，Glu8，Lys12，Nle17，Asp25，Val26，Thr28，Gly29，30，Thr31]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO66)-NH2]采用如實施例2方案1，使二苯甲基胺樹脂(0.125g，0.1mmol，100-200目，Bachem)進行固相合成。按實施例47進行三十一次連接循環(huán)，而第十三次循環(huán)中的Boc-Ala為Boc-Val(217mg，1.0mmol)所取代，第二十六次循環(huán)中的Boc-Phe為Boc-p-F-Phe(142mg，0.5mmol)所取代除外，得到0.754g，肽樹脂。
這種肽樹脂按實施例7解封后可得到280mg粗肽。該肽按實施例3用凝膠過濾法純化，得到152mg半純品。這種物料除按27-38%線性梯度操作外，按實施例3用制備HPLC進一步純化，得到53.4mg白色無定形粉末。按HPLC這種化合物是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3553.0，實驗值3552.2。
實施例 49制備Ac-[Ala2，Glu8，Lys12，Nle17，Asp25，Leu26，Lys27，28，Gly29，30，Thr31]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO67)-NH2]采用如實施例2的方案1，使二苯甲基胺樹脂(0.125mg，0.1mmol，100-200ASTM目，Bachem)進行固相合成。按實施例47進行三十一次連接循環(huán)，而第四次循環(huán)中的Boc-Thr(Bzl)為Boc-Lys(2-Cl-Z)(414mg，1.0mmol)所取代，第五次循環(huán)中的Boc-Leu為Boc-Lys(2-Cl-Z)(414mg，1.0mmol)所取代，第六次循環(huán)中的Boc-Val為Boc-Leu(249mg，1.0mmol)所取代，第十三次循環(huán)中的Boc-Ala為Boc-Val(217mg，1.0mmol)所取代和第三十次循環(huán)中的Boc-Ser(Bzl)為Boc-Ala(189mg，1.0mmol)所取代除外，得到0.838g肽樹脂。
這種肽樹脂按實施例7被解封后，可得到370mg粗肽。該肽按實施例3用凝膠過濾純化，得到196mg半純品。這種物料除23-33%線性梯度操作外，按實施例3用制備HPLC可進一步純化，得到48.4mg白色無定形粉末。這種化合物按HPLC是單一的，因此可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3575.1，實驗值3574.0。
實施例 50制備Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Asp25，Leu26，Lys27，28，Gly29，30，Thr31]-VIP(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO68)-NH2]
采用實施例2的方案1，使二苯甲基胺樹脂(0.125g，0.1mmol，100-200ASTM目，Bachem)進行固相合成。按實施例49進行三十一次連接循環(huán)，而第三十次循環(huán)中的Boc-Ala被Boc-Ser(Bzl)(295mg，1.0mmol)取代除外，得到0.913g肽樹脂。
這種肽樹脂按實施例7解封后，得到378mg粗肽。該肽按實施例3用凝膠過濾純化后，可得到240mg半純品。這種物料除按25-35%線性梯度操作外，按實施例3用制備HPLC可進一步純化，得到28.8mg白色無定形粉末。這種化合物按HPLC是單一的，因而可得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3591.1，實驗值3590.3。
實施例 51制備Ac-[Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28，Ala29-31]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO69)-NH2]采用實施例2的方案1，使二苯甲基胺樹脂(0.125g，0.1mmol，100-200ASYM目，Bachem)進行固相合成。按實施例47進行三十一次連接循環(huán)，而第一次循環(huán)中的Boc-Thr(Bzl)被Boc-Ala(189mg，1.0mmol)取代，第二次循環(huán)中的Boc-Gly被Boc-Ala(189mg，1.0mmol)取代，第三次循環(huán)中的Boc-Gly被Boc-Ala(189mg，1.0mmol)取代，第四次循環(huán)中的Boc-Thr(Bzl)被Boc-Lys(2-Cl-z)(414mg，1.0mmol)取代，第五次循環(huán)中的Boc-Leu被Boc-Lys(2-Cl-z)(414mg，1.0mmol)取代，第六次循環(huán)中的Boc-Val被Boc-Leu(249mg，1.0mmol)取代，和第二十四次循環(huán)中的Boc-Glu(OBzl)被Boc-Asp(OcHx)(315mg，1.0mmol)取代除外，得到0.844g肽樹脂。
這種肽樹脂按實施例7解封后，可得到360mg的粗肽。該肽按實施例3用凝膠過濾純化后，可得115mg半純品。這種物料除按24-34%線性梯度操作外，按實施例3用制備HPLC可進一步純化，獲得34.7mg白色無定形粉末。這種化合物按HPLC是單一的，因而能得到正確的氨基酸分析結(jié)果。FAB-MSMH計算值3547.1，實驗值3546.0。
實施例 52VIP類似物的氣管擴張活性以利用豚鼠氣管的模型研究過VIP類似物的擴張活性[Wasserman，M.A.等人.，in Vasoactivl Intestinal Peptide，S.I.Said，ed.，Raven Press，N.Y.1982，PP 177-184]。所有組織皆取自用尿烷(2g/Kg，i.p.)麻醉的雄性白變種豚鼠，其重量為400-600g。血管擴張后，取出氣管并分成4個環(huán)狀段(3mm長)。用30號標準不銹鋼絲將每段環(huán)懸掛在10ml有夾套的組織浴中，并通過4-0絲線與Grass壓力位移傳感器(FTO3C型，Grass Instruments co.，Quimcy，MA)連接，以便等距離記錄拉力。將平滑肌浸泡于改性的Kreb溶液中，該溶液的組成如下NaCl，120mM;Kcl，4.7mM;CaCl2，2.5mM;MgSO4·7H2O，1.2mM;NaHCO3，25mM;K2HPO4單基，1.2mM;和右旋糖，10mM。組織浴保溫于37℃下，并不斷地鼓入95%O2和5%CO2的氣泡。在8通道和4通道Hewlett-Packard(型號各為7702B和7754A)記錄儀上(Hewlett-Packard，Paramus，NJ)記錄響應。氣管環(huán)狀物置于1.5g的靜拉力下，在初步試驗中已確定該靜拉力是最佳的或接近最佳的。在隨后60分鐘穩(wěn)定期間內(nèi)，必須經(jīng)常再調(diào)節(jié)拉力。組織每隔15分鐘漂洗一次。
按照Vanrossum(Arch.Int.Pharmacodyn.，143，299-330(1963))法，通過VIP或VIP類似物浴濃度的μl連續(xù)增加，得到了每個組織的累積濃度響應曲線?；趩我唤M織，只能獲得一種累積劑量響應曲線。為了減小組織之間易變性，擴張響應以每一濃度響應試驗結(jié)束時所加入的VIP(10-6M＝100%)所獲得最大響應的百分比表示。匯集由三種組織所得到的響應并按照線性回歸法確定EC50值。
表Ⅰ中所匯集的結(jié)果顯示了VIP類似物的氣管擴張活性與天然VIP的對比。
表 ⅠVIP類似物對豚鼠氣管平滑肌的擴張活性化合物 EC50(nM)VIP[(Seq ID NO:1)-NH2] 10
Ac-[Lys12,Nle17,Val26,Thr28]-VIP cyclo(Asp8→Lys12)[Ac-(SEQ ID NO:20)-NH2] 14
Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Val26,Thr28]-VIP cyclo(Glu8→Lys12) [Ac-(SEQ ID NO:21)-NH2] 34
Ac-[Asn8,Asp9,Lys12,Nle17,Val26,Thr28]-VIP cyclo(Asp9→Lys12) [Ac-(SEQ ID NO:22)-NH2] 17
Ac-[Orn12,Nle17,Val26,Thr28]-VIP cyclo(Asp8→Orn12) [Ac-(SEQ ID NO:23)-NH2] 40
Ac-[Lys8,Asp12,Nle17,Val26,Thr28]-VIP cyclo(Lys8→Asp12) [Ac-(SEQ ID NO:24)-NH2] 38
Ac-[Glu8,Orn12,Nle17,Val26,Thr28]-VIP cyclo(Glu8→Orn12) [Ac-(SEQ ID NO:25)-NH2] 16
Ac-[Lys12,Glu16,Nle17,Val26,Thr28]-VIP cyclo(Lys12→Glu16) [Ac-(SEQ ID NO:26)-NH2] 37
Ac-[Lys12,Nle17,Asp24,Val26,Thr28]-VIP cyclo(Lys20→Asp24) [Ac-(SEQ ID NO:27)-NH2] 5.3
Ac-[Lys12,Nle17,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:28)-NH2] 3.1
Ac-[Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:29)-NH2] 0.70
Ac-[p-F-Phe6,2-Nal10,Lys12,Nle17,Asp25,Val26,Thr28,Gly29,30,Met31]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:30)-NH2] 1.3
Ac-[Glu8,Orn12,Nle17,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:31)-NH2] 2.2
Ac-[p-F-Phe6,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Val26,Thr28,Gly29,30,Cys(Acm)31]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:32)-NH2] 0.44
Ac-[Ala2,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Val26,Thr28]-VIPcyclo (Lys21→Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:33)-NH2] 1.2
Ac-[N-Me-Ala1,Lys12,Nle17;Ala19,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:34)-NH2] 0.71
Ac-[2-Nal10,Leu12,Nle17,Ala19,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:35)-NH2] 4.2
Ac-[O-CH3-Tyr10,Leu12,Nle17,Ala19,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:36)-NH2] 0.84
Ac-[p-F-Phe6,p-NH2-Phe10,Leu12,Nle17,Ala19,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:37)-NH2] 4.4
Ac-[Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIPcyclo (Lys21→Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH2] 0.13
Ac-[N-Me-Ala1,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:39)-NH2] 0.95
Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:40)-NH2] 0.45
Ac-[O-Me-Tyr10,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:41)-NH2] 2.6
Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28,Ala29-31]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:42)-NH2] 0.61
Ac-[Ala2,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28,Ala29-31]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:43)-NH2] 0.55
Ac-[N-Me-Ala1,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:44)-NH2] 0.36
Ac-[p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:45)-NH2] 0.47
Ac-[1-Nal6,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:46)-NH2] 0.26
Ac-[Glu8,p-NH2-Phe10,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:47)-NH2] 0.32
Ac-[Glu8,O-CH3-Tyr10,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:48)-NH2] 0.41
Ac-[p-F-Phe6,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:49)-NH2] 0.39
Ac-[1-Nal6,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:50)-NH2] 2.9
Ac-[Ala2,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28,Gly29,30,Thr31]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:51)-NH2] 0.92
Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28,Gly29,30,Thr31]-VIP cyclo Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:52)-NH2] 0.35
Ac-[Ala2,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:53)-NH2] 0.78
Ac-[p-NH2-Phe10,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:54)-NH2] 0.96
Ac-[Lys12,Nle17,Ala19,m-OCH3-Tyr22,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:55)-NH2] 0.31
Ac-[Lys12,Nle17,Ala19,m-F-L-Tyr22,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:56)-NH2] 0.52
Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,m-OCH3-Tyr22,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:57)-NH2] 0.29
Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,m-F-L-Tyr22,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:58)-NH2] 0.31
Ac-[Ala8,Lys12,Nle17,Ala19,Ala24,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:59)-NH2] 1.1
Ac-[Glu8,Lys12,Ala16,17,19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NH2] 0.26
Ac-[Ala8,Lys12,Ala16,Nle17,Ala19,Ala24,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:61)-NH2] 2.4
Ac-Ala8,Lys12,Ala16,17,19,Ala24,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:62)-NH2] 0.1
Ac-[Glu8,Lys12,Ala16,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:63)-NH2] 0.9
Ac-[Glu8,Lys12,Ala16,17,19,Ala24,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:64)-NH2] 0.22
Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Ala19Asp25,Val26,Thr28,Gly29,30,Thr31]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:65)-NH2] 0.88
Ac-[p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nle17,Asp25,Val26,Thr28,Gly29,30,Thr31]-VIP cyclo Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:66)-NH2] 0.57
Ac-[Ala2,Glu8,Lys12,Nle17,Asp25,Leu26,Lys27,28,Gly29,30,Thr31]-VIP cyclo Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:67)-NH2] 0.19
Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Asp25,Leu26,Lys27,28,Gly29,30,Thr31]-VIP cyclo Lys21→Asp25)Ac-(SEQ ID NO:68)-NH2] 0.43
Ac-[Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28,Ala29-31]-VIP cyclo (Lys→Asp25)Ac-(SEQ ID NO:69)-NH2] 0.42
實施例 53VIP類似物的支氣管擴張活性通過氣管滴注給藥檢測VIP和VIP類似物在豚鼠體內(nèi)的支氣管擴張活性。該項技術(shù)利用重量為400-600g的雄性豚鼠(Hartley Strain，Charles River)。在腹膜內(nèi)用尿烷(2g/Kg)麻醉動物，并且為了靜脈給藥，將聚乙烯插管插入頸靜脈中。
切開動物的氣管后，用吸移管將蒸餾水的藥液或溶于蒸餾水的試驗化合物在大約距隆凸四分之三處滴入氣管中。為了輸入恒定的體積100ml，應調(diào)節(jié)藥液的濃度。動物仰臥放置1分鐘，以助于藥品輸入肺部。1分鐘后，隨著靜脈注射氯化琥珀酰膽堿(1.2mg/Kg)而自發(fā)呼吸停止，用Harvard 680型小型動物呼吸器給動物換氣，該呼吸器定于每分鐘呼吸40次，心博排血量4.0cm3，以最大的組胺收縮劑量刺激其動物(50mg/Kg，i.v.)，并根據(jù)Statham壓力傳感器(P 32 AA)記錄氣管壓力(厘米水柱)。
對至少3個對照和3個藥品處理動物的氣管壓力變化取平均值，再計算抑制百分比。由服用各種劑量的試驗化合物和計算中值有效劑量(ED50值)確定滴注法服用化合物的相對效力。根據(jù)由引起10%-90%抑制效果的至少3種劑量得到的劑量一響應記錄曲線來確定ED50，每種化合物的回歸線校正系數(shù)大于0.95。
為了測定各種化合物的抑制時間過程，化合物投入和組胺激發(fā)之間的時間是改變的。當抑制降至40%時，按此時間計算活性的時間過程。
表Ⅱ中匯集的結(jié)果表明VIP類似物體內(nèi)支氣管擴張活性與天然VIP的對比。
表 ⅡVIP類似物對豚鼠的支氣管擴張活性ED50化合物 (μg)VIP[(Seq ID NO:1)-NH2] 7.3
Ac-[Lys12,Glu16,Nle17,Val26,Thr28]-VIP cyclo(Lys12→Glu16) [Ac-(SEQ ID NO:26)-NH2] 39
Ac-[Lys12,Nle17,Asp24,Val26,Thr28]-VIP cyclo(Lys20→Asp24) [Ac-(SEQ ID NO:27)-NH2] 2.3
Ac-[Lys12,Nle17,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:28)-NH2] 1.2
Ac-[Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:29)-NH2] 0.34
Ac-[p-F-Phe6,2-Nal10,Lys12,Nle17,Asp25,Val26,Thr28,Gly29,30,Met31]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:30)-NH2] 0.90
Ac-[Glu8,Orn12,Nle17,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo(Lys21→Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:31)-NH2] 0.19
Ac-[p-F-Phe6,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Val26,Thr28,Gly29,30,Cys(Acm)31]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:32)-NH2] 0.19
Ac-[Ala2,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Val26,Thr28]-VIPcyclo (Lys21→Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:33)-NH2] 0.6
Ac-[N-Me-Ala1,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:34)-NH2] 1.0
Ac-[Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIPcyclo (Lys21→Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH2] 0.09
Ac-[N-Me-Ala1,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:39)-NH2] 0.06
Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:40)-NH2] 0.022
Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28,Ala29-31]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:42)-NH2] 0.072
Ac-[Ala2,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28,Ala29-31]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:43)-NH2] 0.14
Ac-[N-Me-Ala1,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:44)-NH2] 0.097
Ac-[p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:45)-NH2] 0.026
Ac-[1-Nal6,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:46)-NH2] 0.036
Ac-[Glu8,p-NH2-Phe10,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:47)-NH2] 0.075
Ac-[Glu8,O-CH3-Tyr10,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:48)-NH2] 0.094
Ac-[p-F-Phe6,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:49)-NH2] 0.26
Ac-[Ala2,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28,Gly29,30,Thr31]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:51)-NH2] 0.1
Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28,Gly29,30,Thr31]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:52)-NH2] 0.1
Ac-[Ala2,Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:53)-NH2] 0.14
Ac-[p-NH2-Phe10,Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:54)-NH2] 0.35
Ac-[Lys12,Nle17,Ala19,m-OCH3-Tyr22,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:55)-NH2] 0.14
Ac-[Lys12,Nle17,Ala19,m-F-L-Tyr22,Asp25,Val26,Thr28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:56)-NH2] 7.2
Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,m-OCH3-Tyr22,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:57)-NH2] 0.019
Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,m-F-L-Tyr22,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:58)-NH2] 0.03
Ac-[Ala8,Lys12,Nle17,Ala19,Ala24,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:59)-NH2] 0.17
Ac-[Glu8,Lys12,Ala16,17,19,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NH2] 0.17
Ac-[Ala8,Lys12,Ala16,Nle17,Ala19,Ala24,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:61)-NH2] 0.045
Ac-Ala8,Lys12,Ala16,17,19,Ala24,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:62)-NH2] 0.24
Ac-[Glu8,Lys12,Ala16,17,19,Ala24,Asp25,Leu26,Lys27,28]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:64)-NH2] 0.13
Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Ala19Asp25,Val26,Thr28,Gly29,30,Thr31]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:65)-NH2] 0.84
Ac-[p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nle17,Asp25,Val26,Thr28,Gly29,30,Thr31]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:66)-NH2] 0.12
Ac-[Ala2,Glu8,Lys12,Nle17,Asp25,Leu26,Lys27,28,Gly29,30,Thr31]-VIP cyclo (Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO:67)-NH2] 0.077
Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Asp25,Leu26,Lys27,28,Gly29,30,Thr31]-VIP cyclo Lys21→Asp25)Ac-(SEQ ID NO:68)-NH2] 0.04
Ac-[Lys12,Nle17,Ala19,Asp25,Leu26,Lys27,28,Ala29-31]-VIP cyclo (Lys→Asp25)Ac-(SEQ ID NO:69)-NH2] 0.0權(quán)利要求
1.一種化學式為Ⅰ的環(huán)肽的制備方法
其中R8是Asp，Glu或Lys；R12是Arg，Lys，Orn或Asp；R17是Met或Nle；R26是Ile或Val；R28是Asn或Thr；X是氫或能水解的氨基保護基；Y是羥基或能水解的羧基保護基；或其在藥學上有效的鹽，其特征在于(a)使保護的和樹脂結(jié)合的相應氨基酸順序肽選擇性去保護，以生成自由側(cè)鏈氨基基團和自由側(cè)鏈羧基基團；(b)用合適的酰胺生成劑使自由側(cè)鏈氨基基團和自由側(cè)鏈羧基基團共價連接；和c)用合適去保護和分裂劑處理，若需要在有更合適添加劑如陽離子凈化劑的情況下去保護并從樹脂中分裂環(huán)肽，若需要，使該環(huán)肽轉(zhuǎn)化成在藥學上有效的鹽。
2.按權(quán)利要求1的方法，其特征在于環(huán)肽中R17是Nle，R26是Val，R28是Thr。
3.按權(quán)利要求2的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[Lys12，Nle17，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Asp8→Lys12)[Ac-(SEQ ID NO20)-NH2]。
4.按權(quán)利要求2的方法，其特征在于環(huán)肽為Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Glu8→Lys12)[Ac-(SEQ ID NO21)-NH2]。
5.按權(quán)利要求2的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[Orn12，Nle17，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Asp8→Orn12)[Ac-(SEQ ID NO23)-NH2]。
6.按權(quán)利要求2的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[Lys8，Asp12，Nle17，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys8→Asp12)[Ac-(SEQ ID NO24)-NH2]。
7.按權(quán)利要求2的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[Glu8，Orn12，Nle17，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Glu8→Orn12)[Ac-(SEQ ID NO25)-NH2]。
8.一種化學式為Ⅱ的環(huán)肽的制備方法
其中R8是Asp或Asn;R17是Met或Nle;R26是Ile或Val;R28是Asn或Thr;X是氫或能水解的氨基保護基;Y是羥基或能水解的羧基保護基;或在藥學上有效的鹽。其特征在于(a)使保護的和樹脂結(jié)合的相應氨基酸順序肽選擇去保護，以生成自由側(cè)鏈氨基基團和自由側(cè)鏈羧基基團;(b)用合適的酰胺生成劑使自由側(cè)鏈氨基基團和自由側(cè)鏈羧基基團共價連接;和(c)用合適去保護和分裂劑處理，若需要在有更合適添加劑如陽離子凈化劑情況下去保護并從樹脂中分裂環(huán)肽，若需要，使環(huán)肽轉(zhuǎn)化成在藥學上有效的鹽。
9.按權(quán)利要求8的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[Asn8，Asp9，Lys12，Nle17，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Asp9→Lys12)[Ac-(SEQ ID NO22)-NH2]。
10.一種化學式為Ⅲ的環(huán)肽的制備方法
其中R17是Met或Nle;R26是Ile或Val;R28是Asn或Thr;X是氫或能水解的氨基保護基;Y是羥基或能水解的羧基保護基;或其在藥學上有效的鹽，其特征在于(a)使保護的和樹脂結(jié)合的相應氨基酸順序肽選擇性去保護以生成自由側(cè)鏈氨基基團和自由側(cè)鏈羧基基團;(b)用合適酰胺生成劑使自由側(cè)鏈氨基基團和自由側(cè)鏈羧基基團共價連接;和(c)用合適去保護和分裂劑處理，若需要在有更合適添加劑如陽離子凈化劑存在情況下去保護并從樹脂中分裂環(huán)肽，若需要，使環(huán)肽轉(zhuǎn)化成在藥學上有效的鹽。
11.按權(quán)利要求10的方法。其特征為該環(huán)肽是Ac-[Lys12，Glu16，Nle17，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys12→Glu16)[Ac-(SEQ ID NO26)-NH2]。
12.一種化學式為Ⅳ的環(huán)肽的制備方法
其中R12是Arg或Lys;R17是Met或Nle;R26是Ile或Val;R28是Asn或Thr;X是氫或能水解的氨基保護基;Y是羥基或能水解的羧基保護基;或其在藥學上有效的鹽，其特征在于(a)使保護的和樹脂結(jié)合的相應氨基酸順序肽選擇性去保護以生成自由側(cè)鏈氨基基團和自由側(cè)鏈羧基基團;(b)用合適的酰胺生成劑使自由側(cè)鏈氨基基團和自由側(cè)鏈羧基基團共價連接;和(c)用合適的去保護和分裂劑，若需要在有更合適添加劑如陽離子凈化劑情況下去保護并從樹脂中分裂環(huán)肽，若需要，使環(huán)肽轉(zhuǎn)化成在藥學上有效的鹽。
13.按權(quán)利要求12的方法。其特征在于環(huán)肽是Ac-[Lys12，Nle17，Asp24，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys20→Asp24)[Ac-(SEQ ID NO27)-NH2]。
14.一種化學式為Ⅴ的環(huán)肽的制備方法
其中R1是His，N-CH3-Ala;R2是Ser或Ala;R6是
其中Q是低級烷基環(huán)己基或低級烷基芳基;R8是Asp，Glu或Ala;R10是Tyr或R6;R12是Arg或Lys;R16是Gln或Ala;R17是Met，Nle或Ala;R19是Val或Ala;R22是Tyr或R6;R24是Asn或Ala;R26是Ile，Val或Leu;R27是Leu或Lys;R28是Asn，Thr或Lys;X是氫或能水解的氨基保護基;Y是羥基，能水解的羧基保護基，或R29-R30-R31-Z;R29是Gly或Ala;R30是Gly或Ala;R31是Ala，Met，Cys(Acm)或Thr;Z是羥基或能水解的羧基保護基;或其在藥學上有效的鹽，其特征在于(a)使保護的和樹脂結(jié)合的相應氨基酸順序肽選擇性去保護，以生成自由側(cè)鏈氨基基團和自由側(cè)鏈羧基基團;(b)用合適的酰胺生成劑使自由側(cè)鏈氨基基團和自由側(cè)鏈羧基基團共價連接;和(c)用合適的去保護和分裂劑處理，若需要在有更合適添加劑如陽離子凈化劑情況下去保護并從樹脂中分裂環(huán)肽，若需要的話，使環(huán)肽轉(zhuǎn)化成在藥學上有效的鹽。
15.按權(quán)利要求14的方法，其特征在于環(huán)肽的Q是甲基環(huán)己基。
16.按權(quán)利要求14的方法，其特征在于環(huán)肽的Q是C1-2烷基芳基。
17.按權(quán)利要求16的方法，其特征在于環(huán)肽的Q是C1-2烷基苯基，其中苯環(huán)未取代或用一個或多個選自下列基團的取代基取代OH，OCH3，F(xiàn)，Cl，I，CH3，CF3，NO2，NH2，N(CH3)2，NHCOCH3，NHCOC6H5，或C(CH3)3。
18.按權(quán)利要求16的方法，其特征在于環(huán)肽的Q是C1-2烷基萘基，其中萘環(huán)未取代或用一個或多個選自OH，OCH3，F(xiàn)，Cl，I，CH3，CF3，NO2，NH2，N(CH3)2，NHCOCH3，NHCOC6H5，或C(CH3)3的取代基取代。
19.按權(quán)利要求14的方法，其特征在于環(huán)肽中R26是Val，R28是Thr[X-(SEQ ID NO11)-T]。
20.按權(quán)利要求14的方法，其特征在于環(huán)肽中R17是Nle，R26是Val，和R28是Thr[X-(SEQ ID NO12)-Y]。
21.按權(quán)利要求20的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[Glu8，Orn12，Nle17，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO31)-NH2]。
22.按權(quán)利要求20的方法，其特征在于環(huán)肽中R12是Leu，R17是Nle，R19是Ala，R26是Val，R28是Thr[X-(SEQ ID NO13)-Y]。
23.按權(quán)利要求22的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[2-Nal10，Leu12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO35)-NH2]。
24.按權(quán)利要求22的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[O-Me-Tyr10，Leu12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)[Ac-(SEQ ID NO36)-NH2]。
25.按權(quán)利要求22的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[P-F-Phe6，p-NH2-Phe10，Leu12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO37)-NH2]。
26.按權(quán)利要求20的方法，其特征在于環(huán)肽的R12是Lys，R17是Nle，R26是Val，R28是Thr[X-(SEQ ID NO14)Y]。
27.按權(quán)利要求26的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[Lys12，Nle17，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO28)-NH2]。
28.按權(quán)利要求26的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[P-F-Phe6，2-Nal10，Lys12，Nle17，Asp25，Val26，Thr28，Gly29，30，Met31]-VIP(1-31)-NH2環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO30)-NH2]。
29.按權(quán)利要求26的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[P-F-Phe6，Glu8，Lys12，Nle17，Asp25，Val26，Thr28，Gly29，30，Thr31]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO66)-NH2]。
30.按權(quán)利要求20的方法，其特征在于環(huán)肽中R12是Lys，R17是Nle，R19是Ala，R26是Val，和R28是Thr[X-(SEQ ID NO15)-Y]。
31.按權(quán)利要求30的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO29)-NH2]。
32.按權(quán)利要求30的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[p-F-Phe6，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28，Gly29，30，Cys(Acm)31]-VIP-(1-31)-NH2環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO32)-NH2]。
33.按權(quán)利要求30的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[Ala2，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO33)-NH2]。
34.按權(quán)利要求30的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[N-Me-Ala1，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO34)-NH2]。
35.按權(quán)利要求30的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[O-Me-Tyr10，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO41)-NH2]。
36.按權(quán)利要求30的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[p-F-Phe6，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO49)-NH2]。
37.按權(quán)利要求30的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[1-Nal6，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO50)-NH2]。
38.按權(quán)利要求30的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[p-NH2-Phe10，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO54)-NH2]。
39.按權(quán)利要求30的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[Lys12，Nle17，Ala19，m-OCH3-Tyr22，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO55)-NH2]。
40.按權(quán)利要求30的方法，其特征在于環(huán)肽是Ac-[Lys12，Nle17，Ala19，m-F-L-Tyr22，Asp25，Val26，Thr28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO56)-NH2]。
41.按權(quán)利要求30的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Val26，Thr28，Gly29，30，Thr31]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO65)-NH2]。
42.按權(quán)利要求14的方法，其特征為環(huán)肽中R26是Leu，R27和R28均是Lys[X-(SEQ ID NO16)-Y]。
43.按權(quán)利要求42的方法，其特征為環(huán)肽中R12是Lys，R17是Ala，R19是Ala，R26是Leu，R27和R28均是Lys[X-(SEQ ID NO17)-Y]。
44.按權(quán)利要求43的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[Glu8，Lys12，Ala16，17，19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO60)-NH2]。
45.按權(quán)利要求43的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[Ala8，Lys12，Ala16，17，19，Ala24，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO62)-NH2]。
46.按權(quán)利要求43的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[Glu8，Lys12，Ala16，17，19，Ala24，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO64)-NH2]。
47.按權(quán)利要求42的方法，其特征為環(huán)肽中R12是Lys，R17是Nle，R26是Leu，R27和R28均為Lys[X-(SEQ ID NO18)-Y]。
48.按權(quán)利要求47的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[Ala2，Glu8，Lys12，Nle17，Asp25，Leu26，Lys27，28，Gly29，30，Thy31]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO67)-NH2]。
49.按權(quán)利要求47的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Asp25，Leu26，Lys27，28，Gly29，30，Thr31]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO68)-NH2]。
50.按權(quán)利要求47的方法，其特征為環(huán)肽中R12是Lys，R17是Nle，R19是Ala，R26是Leu，R27和R28均為Lys[X-(SEQ ID NO19)-Y]。
51.按權(quán)利要求50的方法，其特征為環(huán)肽中R12是Lys，R16是Gln，R17是Nle，R19是Ala，R26是Leu，R27和R28均為Lys[X-(SEQ ID NO70)-Y]。
52.按權(quán)利要求51的方法，其特征為環(huán)肽中R2是Ser，R12是Lys，R16是Gln，R17是Nle，R19是Ala，R26是Leu，R27和R28均為Lys[X-(SEQ ID NO71)-Y]。
53.按權(quán)利要求52的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO38)-NH2]。
54.按權(quán)利要求52的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[N-Me-Ala1，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO39)-NH2]。
55.按權(quán)利要求52的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO40)-NH2]。
56.按權(quán)利要求52的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28，Ala29-31]-VIP環(huán)[Ac-(SEQ ID NO42)-NH2]。
57.按權(quán)利要求52的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[N-Me-Ala1，Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO44)-NH2]。
58.按權(quán)利要求52的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[p-F-Phe6，Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO45)-NH2]。
59.按權(quán)利要求52的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[1-Nal6，Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO46)-NH2]。
60.按權(quán)利要求52的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[Glu8，p-NH2-Phe10，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO47)-NH2]。
61.按權(quán)利要求52的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[Glu8，o-Me-Tyr10，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO48)-NH2]。
62.按權(quán)利要求52的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28，Gly29，30，Thr31]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO52)-NH2]。
63.按權(quán)利要求52的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，m-OCH3-Tyr22，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO57)-NH2]。
64.按權(quán)利要求52的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，m-F-L-Tyr22，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO58)-NH2]。
65.按權(quán)利要求52的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[Ala8，Lys12，Nle17，Ala19，Ala24，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO59)-NH2]。
66.按權(quán)利要求52的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28，Ala29-31]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO69)-NH2]。
67.按權(quán)利要求51的方法，其特征為環(huán)肽中R2是Ala，R12是Lys，R16是Gln，R17是Nle，R19Ala，R26是Leu，R27和R28均為Lys[X-(SEQ ID NO72)-Y]。
68.按權(quán)利要求67的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[Ala2，Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28，Ala29-31]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO43)-NH2]。
69.按權(quán)利要求67的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[Ala2，Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28，Gly29，30，Thr31]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO51)-NH2]。
70.按權(quán)利要求67的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[Ala2，Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28，]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO53)-NH2]。
71.按權(quán)利要求50的方法，其特征為環(huán)肽中R12是Lys，R16是Ala，R17是Nle，R19是Ala，R26是Leu，R27和R28均為Lys[X-(SEQ ID NO73)-Y]。
72.按權(quán)利要求71的方法，其特征為環(huán)肽是Ac-[Ala8，Lys12，Ala16，Nle17，Ala19，Ala24，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO61)-NH2]。
73.按權(quán)利要求71的方法，其特征為環(huán)肽Ac-[Glu8，Lys12，Ala16，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO63)-NH2]。
74.一種藥物組合物的制備方法，該方法包括使按權(quán)利要求1-73之任一項方法制得的環(huán)肽和若需要，一種或多種其它治療活性物質(zhì)與一種治療上惰性載體材料混合，使該混合物制成蓋侖給藥形式。
75.一種藥物組合物，它含有按權(quán)利要求1-73之任一項方法制得的環(huán)肽和一種無毒、惰性、治療上適用的載體材料。
76.一種用于治療支氣管縮窄病的藥物組合物，該組合物含有按權(quán)利要求1-73之任一項方法制得的有效量的環(huán)肽和一種無毒的在藥學上適用液體或固體載體。
77.按權(quán)利要求1-73之任一項方法制得的環(huán)肽在制造按權(quán)利要求75或76的藥物組合物的應用。
78.一種按權(quán)利要求1的方法制備的化學式為Ⅰ的環(huán)肽
其中R8是Asp，Glu或Lys;R12是Arg，Lys，Orn或Asp;R17是Met或Nle;R26是Ile或Val;R28是Asn或Thr;X是氫或能水解的氨基保護基;Y是羥基或能水解的羧基保護基;或其在藥學上有效的鹽。
79.一種按權(quán)利要求8的方法制備的化學式為Ⅱ的環(huán)肽
其中R8是Asp或Asn;R17是Met或Nle;R26是Ile或Val;R28是Asn或Thr;X是氫或能水解的氨基保護基;Y是羥基或能水解的羧基保護基;或其在藥學有效的鹽。
80.一種按照權(quán)利要求10的方法制備的化學式為Ⅲ的環(huán)肽
其中R17是Met或Nle;R26是Ile或Val;R28是Asn或Thr;X是氫或能水解的氨基保護基;Y是羥基或能水解的羧基保護基;或其在藥學上有效的鹽。
81.一種按照權(quán)利要求12的方法制備的化學式為Ⅳ的環(huán)肽
其中R12是Arg或Lys;R17是Met或Nle;R26是Ile或Val;R28是Asn或Thr;X是氫或能水解的氨基保護基;Y是羥基或能水解的羧基保護基;或其在藥學有效的鹽。
82.一種按照權(quán)利要求14的方法制備的化學式為Ⅴ的環(huán)肽
其中R1是His，N-CH3-Ala;R2是Ser或Ala;R6是
其中Q是低級烷基環(huán)己基或低級烷基芳基;R8是Asp，Glu或Ala;R10是Tyr或R6;R12是Arg或Lys;R16是Gln或Ala;R17是Met、Nle或Ala;R19是Val或Ala;R22是Tyr或R6;R24是Asn或Ala;R26是Ile，Val或Leu;R27是Leu或Lys;R28是Asn，Thr或Lys;X是氫或能水解的氨基保護基;Y是羥基，能水解的羧基保護基，或R29-R30-R31-Z;R29是Gly或Ala;R30是Gly或Ala;R31是Ala;Met，Cys(Acm)或Thr;Z是羥基或能水解的羧基保護基;或其藥學上有效的鹽。
83.按照權(quán)利要求62的方法制備的權(quán)利要求52的肽，其特征為該肽是Ac-[Glu8，Lys12，Nle17，Ala19，Asp25，Leu26，Lys27，28，Gly29，30，Thr31]-VIP環(huán)(Lys21→Asp25)[Ac-(SEQ ID NO52)-NH2]。
84.本發(fā)明如上所述。
全文摘要
本發(fā)明涉及血管活性肽(VIP)類似物，其中肽鏈中一個氨基酸的側(cè)鏈羧基端與肽鏈中另一個氨基酸的側(cè)鏈氨基端通過生成酰胺鏈而共價連接。肽鏈中二個氨基酸殘基間共價鍵合形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。本發(fā)明提供環(huán)狀血管活性肽及用于治療支氣管氣管縮窄病的含有這種環(huán)狀血管活性肽的藥物組合物。
文檔編號A61P11/08GK1072415SQ92113069
公開日1993年5月26日 申請日期1992年10月10日 優(yōu)先權(quán)日1991年10月11日
發(fā)明者D·R·波林, M·奧唐奈 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司