專(zhuān)利名稱(chēng)：microRNA-139的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種小分子RNA-micr0RNA-139(以下簡(jiǎn) 稱(chēng)為miR-139)在制備轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療藥物和診斷試劑中的用途。
背景技術(shù)：
一、microRNAOiiiRNA)在腫瘤細(xì)胞惡性表型中的作用及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制miRNA作為近年來(lái)逐漸被研究者們重視的非編碼小核酸，通過(guò)結(jié)合蛋白編碼基因 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3’ UTR的作用方式抑制特定靶分子的翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平抑制了基因表達(dá)， 進(jìn)而影響其下游調(diào)控分子發(fā)揮正常的生物學(xué)功能。與腫瘤相關(guān)的miRNA大致可分為兩類(lèi)， 即腫瘤HiiRNA(Oncomir)和腫瘤抑制相關(guān)miRNA，其界定標(biāo)準(zhǔn)主要是依靠腫瘤組織中表達(dá)的 豐度和生物學(xué)功能。前者在腫瘤組織中的表達(dá)豐度較正?；虬┡越M織為高，實(shí)驗(yàn)證明受其 直接調(diào)控的靶基因多為抑制腫瘤細(xì)胞生存、增殖、運(yùn)動(dòng)的分子。例如miRNA-17-92簇被確認(rèn) 為重要的腫瘤相關(guān)miRNA ；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)miRNA-17-92簇過(guò)量表達(dá)可導(dǎo)致小鼠體內(nèi) 淋巴細(xì)胞的異常增生，出現(xiàn)惡變傾向，其發(fā)生機(jī)制可能與直接沉默促凋亡分子Bim和抑癌 基因PTEN密切相關(guān)；而miRNA-21被確認(rèn)為包括神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌等在 內(nèi)多種腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的Oncomir，受其直接調(diào)節(jié)的下游靶點(diǎn)包括PTEN、PDCD4、 Maspin等重要抑癌分子。而腫瘤抑制相關(guān)miRNA多數(shù)在腫瘤組織中表達(dá)缺失或啟動(dòng)子發(fā)生 甲基化，不能高水平表達(dá)。例如miRNA-34a，作為公認(rèn)的腫瘤抑制相關(guān)miRNA，就存在啟動(dòng)子 高甲基化的現(xiàn)象，導(dǎo)致其下游調(diào)控分子Bcl-2等的過(guò)量表達(dá)，將外源miRNA-34a重新導(dǎo)入腫 瘤細(xì)胞可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)外增殖能力。第一個(gè)被臨床證實(shí)的腫瘤抑制相關(guān)miRNA 是miR-15a-16-l，該分子最早報(bào)道是在B細(xì)胞淋巴瘤中缺失的一個(gè)miRNA，研究者證明其 作用的靶點(diǎn)為抗凋亡分子Bcl-2，外源導(dǎo)入miRNA-15a-16-l可明顯逆轉(zhuǎn)慢性淋巴細(xì)胞白血 病(CLL)細(xì)胞MEG-Ol的惡性表型。而最新研究證明miRNA-15a-16-l的作用靶點(diǎn)遠(yuǎn)不止 Bcl-2 一個(gè)分子，在關(guān)于前列腺癌的最新研究中發(fā)現(xiàn)該分子可同時(shí)抑制Bcl-2、CyClinDl和 Wnt-3a等三個(gè)腫瘤相關(guān)分子，這更加體現(xiàn)了 miRNA分子在生物特性上的多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)模式。二、HER2介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及其靶向治療表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)家族也稱(chēng)為HER或ErbB家族，該家族分子成員在細(xì) 胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及存活的重要調(diào)節(jié)者。HER2/neU是該家族 的第二位成員，人HER2/neU基因定位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂，表達(dá)產(chǎn)物為分子量為185kD的 單鏈跨膜糖蛋白，即P185，含有1255個(gè)氨基酸殘基，其細(xì)胞內(nèi)段具有酪氨酸蛋白激酶活 性。HER2/neU通過(guò)多種細(xì)胞內(nèi)分子參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，已知其調(diào)控的主要下游信號(hào)分子包括 絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇_3激酶 (phosphoinositide-3 kinase, PI3K)、C_src、She 及 Grb2 等。HER2 通過(guò)同源分子二聚體 化或借助與同一家族的其他成員發(fā)生異二聚體化催化其胞內(nèi)段的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化 修飾，進(jìn)而發(fā)生構(gòu)象改變并作用于胞漿中的信號(hào)接頭蛋白Shc和Grb2，引起Ras-Raf-MAPK 級(jí)聯(lián)途徑的活化，增強(qiáng)早期反應(yīng)基因C-f0S，C-jim和c-myc等的轉(zhuǎn)錄活性。另一方面，缺乏
3PI3K結(jié)合基序的HER2通過(guò)誘導(dǎo)與其結(jié)合的異源分子HER3的磷酸化，借助HER3結(jié)合PI3K 的生物學(xué)特性級(jí)聯(lián)激活PI3K/AKT信號(hào)通路。磷酸化并活化的AKT抑制糖原合酶激酶3，使 細(xì)胞周期蛋白DKcyclin Dl)水平升高，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期。AKT直接或間接作用的靶 分子還包括Forkhead轉(zhuǎn)錄因子超家族及Raf。Hung MC研究組發(fā)現(xiàn)HER2分子可以轉(zhuǎn)位入核，通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制直接激活腫瘤相 關(guān)分子C0X-2的表達(dá)，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控的角度部分揭示了 HER2陽(yáng)性腫瘤血管生成的分子機(jī)制； HER2通過(guò)減緩CXCR4的蛋白質(zhì)降解促進(jìn)由其介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，然而更為具體的分子機(jī) 制尚未闡明。盡管由HER2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已經(jīng)逐漸清晰，但是這些已有的研究結(jié)果并 不能完全解釋HER2分子活化后所產(chǎn)生的各種生物學(xué)效應(yīng)。例如有研究表明，HER2高表達(dá) 與腫瘤組織中多種抑癌基因的啟動(dòng)子甲基化修飾密切相關(guān)，提示基因表觀遺傳學(xué)修飾可能 是HER2信號(hào)對(duì)下游分子發(fā)揮調(diào)控作用的重要模式。最新研究結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞HER2信號(hào)上調(diào)會(huì)引起miRNA-21的表達(dá)增高，該 miRNA通過(guò)靶向抑制抑癌分子PDCD4的表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功能，而其自身表 達(dá)的升高與HER2分子活化的ERK激酶信號(hào)通路密切相關(guān)。但是該研究依舊未能揭示HER2 通過(guò)miRNA調(diào)控下游效應(yīng)分子表達(dá)的完整信號(hào)通路。HER2信號(hào)調(diào)控的miRNA分子存在兩類(lèi)， 包括表達(dá)上調(diào)的miRNA分子，如miRNA-21，和表達(dá)下調(diào)的miRNA分子，因此僅從單個(gè)miRNA 入手尚不足以解釋與HER2信號(hào)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA分子的全部生物學(xué)效應(yīng)。由于HER2在介導(dǎo)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移中的重要作用，以HER2為靶點(diǎn)的腫瘤治療策略 和藥物倍受關(guān)注，其中應(yīng)用最為成功的是HER2單克隆抗體赫賽汀(Here印tin)，自1998年 獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市以來(lái)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于乳腺癌等HER2陽(yáng)性腫瘤的治療，效果良好。研 究表明，赫賽汀單用治療乳腺癌的有效率為12-34%，同時(shí)許多化療藥物(如順鉬、卡鉬、紫 杉醇等)與赫賽汀(Herceptin)之間存在著增強(qiáng)和/或協(xié)同的治療作用。赫賽汀的作用機(jī) 理可能包括1)下調(diào)HER2表達(dá)；2)抑制HER2與人表皮生長(zhǎng)因子家族其它成員的二聚化和 下游信號(hào)傳遞；3)抑制HER2下游PI3K和MAPK信號(hào)傳遞，從而抑制腫瘤血管形成；4)誘導(dǎo) 抑癌蛋白P27表達(dá)和細(xì)胞周期發(fā)生Gl期阻滯；5)誘導(dǎo)抗體依賴(lài)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，但具 體的分子機(jī)制尚不明確。臨床研究中發(fā)現(xiàn)，接受赫賽汀治療的部分患者出現(xiàn)明顯的心臟毒 性，同時(shí)大部分治療有效的患者在一年內(nèi)產(chǎn)生耐藥，這些都限制了它的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供miR-139在制備轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療藥物和診斷試劑中的用途。本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)上述目的，分析了 miR-139與人表皮生長(zhǎng)因子家族受體 HER2(neu/erbB2)陽(yáng)性腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的關(guān)系，在體外培養(yǎng)細(xì)胞、荷瘤動(dòng)物和臨床腫瘤標(biāo)本 中發(fā)現(xiàn)miR-139的低表達(dá)或不表達(dá)與HER2陽(yáng)性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。在以上工作基礎(chǔ)上，本發(fā)明深入探討了 miR-139表達(dá)不足促進(jìn)腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移的 分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)miR-139可以通過(guò)抑制其靶基因-趨化因子受體CXCR4的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì) 胞侵襲；HER2和⑶44相互作用，通過(guò)表觀遺傳學(xué)修飾抑制miR-139的表達(dá)，從而解除其對(duì) CXCR4的抑制作用，因此恢復(fù)miR-139的表達(dá)可以拮抗上游HER2信號(hào)，阻斷腫瘤細(xì)胞的侵襲 和轉(zhuǎn)移(圖3e)。
基于以上研究結(jié)果，本發(fā)明提出了 miR-139在制備轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療藥物和診斷 試劑中的用途。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中miR-139的表達(dá)下調(diào)，并結(jié)合HER2和CXCR4的表達(dá)水平， 對(duì)腫瘤進(jìn)行早期診斷，對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移能力和預(yù)后進(jìn)行評(píng)價(jià)；通過(guò)表達(dá)miR-139或其類(lèi)似物， 或通過(guò)干涉miR-139上游信號(hào)促進(jìn)miR-139的表達(dá)，從而抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果1、本發(fā)明首次闡明了小分子RNA-miR-139在腫瘤轉(zhuǎn)移中的抑制作用。目前HER2信 號(hào)與腫瘤轉(zhuǎn)移的密切關(guān)系已成共識(shí)，但其具體分子機(jī)制尚不清楚。本發(fā)明證實(shí)HER2與CD44 相互作用，通過(guò)誘導(dǎo)miR-139基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白去乙?；种苖iR-139的表達(dá)，從而解 除了其對(duì)靶基因CXCR4表達(dá)的抑制作用，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，由此形成了一個(gè)完整的HER2信號(hào) 通路。而恢復(fù)miR-139的表達(dá)，可以有效地抑制HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。2、本發(fā)明提出了 miR-139的多種應(yīng)用途徑。除了應(yīng)用于腫瘤診斷和轉(zhuǎn)移能力評(píng)價(jià) 外，圍繞受HER2信號(hào)調(diào)控的miR-139可以設(shè)計(jì)腫瘤干預(yù)策略，如通過(guò)直接表達(dá)miR-139拮 抗HER2信號(hào)，以及通過(guò)同時(shí)沉默HER2和⑶44的表達(dá)，從而更有效地封閉介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷 移和侵襲的信號(hào)通路等。因此，與現(xiàn)有的以HER2為單一靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物(如Here印tin) 相比具有明顯優(yōu)勢(shì)，并有望克服由于HER2本身或下游信號(hào)分子突變或表達(dá)水平改變導(dǎo)致 的耐藥。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而 不是限定。圖1為HER2和CD44通過(guò)抑制miR-139表達(dá)上調(diào)CXCR4實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。(a)為miR-139和miR_146a均以CXCR4的mRNA為靶點(diǎn)的結(jié)合序列對(duì)照?qǐng)D。(b)為熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)miR-139對(duì)CXCR4的轉(zhuǎn)錄后抑制作用實(shí)驗(yàn) 結(jié)果示意圖。其中Relative luciferase activity (fold)為相對(duì)熒光素酶活性(倍 數(shù))，control指pGL3_CMV熒光素酶對(duì)照載體，CXCR4指克隆了 miR-139的3’非翻譯區(qū) 的pGL3-CMV熒光素酶對(duì)照載體，左圖和中圖為將它們分別與miR-139或?qū)φ誱iRNA(圖中 的mock)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后相對(duì)熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果，右圖為將它們分別與miR-139、對(duì)照 miRNA(mock)和/或miR-139的反義寡核苷酸(Antisense oligo)或?qū)φ展押塑账?mock oligo)共轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞后相對(duì)熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果。(*P < 0. 001，η = 5)(c)為RT-PCR和Western blot檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞中HER2的表達(dá)實(shí)驗(yàn) 結(jié)果示意圖。通過(guò)設(shè)計(jì)合成發(fā)夾狀小干擾RNA(SiRNA)的編碼序列并克隆入pSuperior. puro載體，獲得表達(dá)載體pshl和psh2，它們所針對(duì)的HER2mRNA的靶序列分別為 tgatagacaccaaccgctc 和 tgaaacctgacctctccta。 轉(zhuǎn)染SGC-7901 (簡(jiǎn)寫(xiě)為SGC或S)和 MKN-45(簡(jiǎn)寫(xiě)為MKN或M)細(xì)胞后進(jìn)行穩(wěn)定篩選。ctrl#l為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染靶向綠色熒光蛋白 (GFP)的siRNA表達(dá)載體的對(duì)照細(xì)胞，ctrl#2為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照細(xì)胞，ctrl#3為未 轉(zhuǎn)染細(xì)胞。pool為篩選獲得的混合克隆，#1_#3為單克隆。3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH) 和tubulin分別作為RT-PCR和Western blot檢測(cè)的內(nèi)參照。以上克隆中SGC/pshl#3(簡(jiǎn)寫(xiě)為S-3)和MKN/pshl#2 (簡(jiǎn)寫(xiě)為M_2)克隆HER2表 達(dá)抑制最徹底，因此作為后續(xù)研究主要使用的細(xì)胞，同時(shí)SGC/ctrl#l (簡(jiǎn)寫(xiě)為S-ctrll)和MKN/ctrl#l (簡(jiǎn)寫(xiě)為M-ctrll)作為上述細(xì)胞的對(duì)照用于后續(xù)研究。(d)中左圖為HER2表達(dá)抑制的細(xì)胞(S_3和M_2)和對(duì)照細(xì)胞(S_ctrl 1和 M-ctrll)中miR-139及其加工前體pre-miR-139表達(dá)的Northern blot檢測(cè)結(jié)果示意圖。 U6 RNA作為檢測(cè)的內(nèi)參照。右圖為不同侵襲能力的胃癌和正常胃粘膜細(xì)胞中miR-139表達(dá)的Northern blot 檢測(cè)結(jié)果示意圖。其中SGC和MKN分別為高侵襲能力的胃癌SGC-7901和MKN-45細(xì)胞，AGS 為低侵襲能力的胃癌細(xì)胞系，GES為永生化的正常胃粘膜細(xì)胞系GES-1。(e)和(f)為RT-PCR(上圖)和Western blot (下圖)檢測(cè)反義核酸抑制miR-139 表達(dá)(e)或異位表達(dá)miR-139 (f)后對(duì)CXCR4表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。其中HER2或 ⑶44分別指通過(guò)轉(zhuǎn)染相應(yīng)表達(dá)載體在細(xì)胞中表達(dá)HER2或⑶44。GAPDH作為檢測(cè)的內(nèi)參照。(g)為Northern blot檢測(cè)HER2和/或CD44表達(dá)沉默后對(duì)miR-139表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。siRNA-⑶44為通過(guò)載體在細(xì)胞中表達(dá)針對(duì)⑶44的siRNA以抑制其表達(dá)。 U6 RNA作為內(nèi)參照。(h)為Northern blot檢測(cè)HER2和/或CD44異位表達(dá)后miR-139的表達(dá)情況實(shí) 驗(yàn)結(jié)果示意圖。U6RNA作為內(nèi)參照。圖2為HER2和⑶44通過(guò)促進(jìn)miR-139基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白去乙?；种破浔磉_(dá)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。(a)為應(yīng)用克隆了 miR-139啟動(dòng)子區(qū)域(-1500 +200bp)的熒光素酶報(bào)告基因載 體，在MKN-45細(xì)胞中檢測(cè)HER2和⑶44表達(dá)沉默對(duì)miR-139轉(zhuǎn)錄活性的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意 圖。siRNA-HER2和siRNA-⑶44分別為通過(guò)載體表達(dá)針對(duì)HER2和⑶44的siRNA以抑制其 表達(dá)，而control為相應(yīng)空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。數(shù)據(jù)表述為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值士標(biāo)準(zhǔn)差。(b)為3mM組蛋白去乙?；敢种苿㏄BA和5 μ M DNA甲基化酶抑制劑5-Aza-CdR 處理不同時(shí)間后，Northern blot檢測(cè)細(xì)胞中miR-139的表達(dá)⑴6作為內(nèi)參照)，以及 Western blot檢測(cè)CXCR4的表達(dá)情況(Tubulin作為內(nèi)參照)實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。(c)為定量RT-PCR檢測(cè)未處理細(xì)胞(NC)、5 μ M 5-Aza-CdR(Aza)和200 μ M組蛋白 去乙酰化酶抑制劑TSA處理24小時(shí)后細(xì)胞中miR-139和另一個(gè)已知以CXCR4為靶基因的 miRNA-miR-146a的表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。Induction fold為誘導(dǎo)倍數(shù)。*，與NC組比 較 P < 0. 05。(d)為3mM PBA處理不同時(shí)間后細(xì)胞的Western blot檢測(cè)結(jié)果示意圖，(d)指天數(shù)。(e)為染色質(zhì)免疫沉淀檢測(cè)miR-139啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3K9的乙酰化水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果 示意圖。Acetylated H3指應(yīng)用乙?；M蛋白H3的抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后對(duì)沉淀獲得的 染色體DNA序列進(jìn)行PCR分析，特異地?cái)U(kuò)增miR-139啟動(dòng)子區(qū)域片段獲得的結(jié)果。NAC表示 非特異性抗體對(duì)照，untreated為未處理組，DKD表示CD44和HER2共沉默細(xì)胞。(f)為染色質(zhì)免疫沉淀檢測(cè)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白復(fù)合物MTAl和組蛋白去乙酰化酶 2 (HDAC2)與miR-139啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。分別用MTAl和HDAC2抗體進(jìn)行免 疫沉淀，然后對(duì)沉淀獲得的染色體DNA序列進(jìn)行PCR分析，特異地?cái)U(kuò)增miR-139啟動(dòng)子區(qū)域 片段。No antibody為未加抗體的對(duì)照組。(g)為 Northern blot 和 Western blot 檢測(cè) HER2 和 / 或 CD44 表達(dá)沉默后 MKN-45細(xì)胞中miR-139和MTAl的表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。U6 RNA和tubulin蛋白作為檢測(cè)的 內(nèi)參照。MTAl和si-MTAl分別指通過(guò)載體在細(xì)胞中表達(dá)MTAl和抑制MTAl的siRNA。(h)左圖為轉(zhuǎn)染和/或5 μ M酪氨酸激酶抑制劑gefitinib處理后GES-1細(xì)胞的 Western blot檢測(cè)結(jié)果示意圖，P-HER2即磷酸化的HER2，Δ為⑶44的顯性負(fù)突變體。右 圖為Western blot檢測(cè)50ng/ml HER2信號(hào)途徑的激活劑Heregulin(HRG)處理不同時(shí)間 后MKN-45細(xì)胞中MTAl的表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。(i)為 MKN-45 細(xì)胞 50ng/ml HRG 處理和 / 或 MTAl 表達(dá)沉默后，Northernblot 檢 測(cè)miR-139和Western blot檢測(cè)CXCR4、MTAl的表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。(j)左圖為3mM PBA處理和/或MTAl表達(dá)沉默后細(xì)胞的Northern blot檢測(cè)結(jié) 果示意圖。右圖為50ng/ml HRG和/或3mM PBA處理MKN-45細(xì)胞后，Northern blot檢測(cè) miR-139和Western blot檢測(cè)CXCR4、MTA1的表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。圖3為HER2和⑶44基因共沉默對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，以及HER2、⑶44和 CXCR4在臨床胃癌樣本中表達(dá)的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。(a-c)通過(guò)BALB/c裸鼠右后肢皮下注射對(duì)照或穩(wěn)定表達(dá)HER2和/或⑶44siRNA 的SGC-7901和MKN-45細(xì)胞，建立裸鼠移植瘤模型，連續(xù)測(cè)量腫瘤體積(tumor volume, a)， 數(shù)據(jù)表述為三次獨(dú)立測(cè)定的均值士標(biāo)準(zhǔn)差，與對(duì)照組比較P < 0. 01 ；待瘤體達(dá)500m3時(shí)剝 瘤稱(chēng)重，計(jì)算其與體重的比值(tumorweight/mouse weight, b)，與對(duì)照組比較P < 0. 01 ； Northern blot檢測(cè)腫瘤組織中miR-139表達(dá)(U6為內(nèi)參照)，Western blot檢測(cè)HER2、 ⑶44和CXCR4的表達(dá)情況(β -actin為內(nèi)參照)(c)實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。(d)為免疫組化檢測(cè)臨床胃癌組織中HER2、⑶44和CXCR4表達(dá)的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 示意圖。Specimenl為轉(zhuǎn)移性胃癌，Specimen2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，Specimen3為非轉(zhuǎn)移性胃癌。(e)為HER2與⑶44相互作用通過(guò)表觀遺傳學(xué)機(jī)制抑制miR-139表達(dá)，從而促進(jìn) CXCR4表達(dá)的總示意圖。圖4為miR-139基因的表觀遺傳學(xué)修飾和表達(dá)抑制是HER2陽(yáng)性腫瘤的普遍機(jī)制 實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。通過(guò)定量RT-PCR檢測(cè)5 μ M 5-Aza-CdR和200 μ M TSA處理24小時(shí)后不同細(xì)胞系 中miR-139表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。Induction fold，誘導(dǎo)倍數(shù)。其中H印G2是肝癌細(xì)胞 系，SK-BR-3、MDA-MB-231和MCF-7為乳腺癌細(xì)胞系，A549為非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，SK0V-3 是卵巢癌細(xì)胞系，ECC-I是子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系。*，與未處理細(xì)胞(NC)比較P<0.05。
具體實(shí)施例方式1.腫瘤細(xì)胞中miR-139被HER2抑制后CXCR4表達(dá)發(fā)生上調(diào)。腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的表皮生長(zhǎng)因子家族受體分子HER2與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)， 而趨化因子受體CXCR4則是公認(rèn)的介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的重要分子。HER2信號(hào)是否 通過(guò)包括miRNA在內(nèi)的機(jī)制上調(diào)CXCR4的表達(dá)還不清楚。我們以轉(zhuǎn)移性HER2陽(yáng)性胃癌 SGC-7901細(xì)胞系為研究對(duì)象，抑制HER2表達(dá)后，應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)，篩選獲得了多個(gè)表達(dá) 上調(diào)的miRNA。除了已經(jīng)報(bào)道的能夠抑制CXCR4表達(dá)的miR-146a外，我們應(yīng)用miRNA Viewer 生物信息學(xué)軟件，預(yù)測(cè)人 miR-139 (Gene ID 406931 ；MI0000261, microrna. sanger. ac. uk) 也可能作為CXCR4的調(diào)控miRNA(如圖Ia所示)。為了驗(yàn)證miR-139對(duì)CXCR4的調(diào)控作用，
7我們構(gòu)建了 CXCR43’非翻譯區(qū)的熒光素酶報(bào)告基因載體，并轉(zhuǎn)染進(jìn)入SGC-7901和MKN-45 細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中的相對(duì)熒光素酶活性，我們發(fā)現(xiàn)miR-139可以明顯降低帶有CXCR4的 3’非翻譯區(qū)的mRNA的穩(wěn)定性(如圖Ib左、中所示)，進(jìn)一步導(dǎo)入針對(duì)miR-139的反義核酸， 則能夠逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)(如圖Ib右所示)，從而證實(shí)了 miR-139對(duì)CXCR4在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水 平的抑制作用。同時(shí)，HER2信號(hào)對(duì)miR-139的調(diào)控作用也得到證實(shí)。如圖Ic所示，通過(guò)RNA干 擾技術(shù)抑制胃癌SGC7901和MKN-45細(xì)胞中HER2的表達(dá)，分別篩選獲得穩(wěn)定單克隆。通過(guò) 設(shè)計(jì)合成發(fā)夾狀小干擾RNA(SiRNA)的編碼序列并克隆入pSuperior. puro載體，獲得表 達(dá)載體pshl和psh2，它們所針對(duì)的HER2mRNA的靶序列分別為tgatagacaccaaccgctc和 tgaaacctgacctctccta。轉(zhuǎn)染 SGC-7901 (簡(jiǎn)寫(xiě)為 SGC 或 S)和 MKN-45 (簡(jiǎn)寫(xiě)為 MKN 或 M)細(xì) 胞后進(jìn)行穩(wěn)定篩選。Northern blot檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，miR-139的表達(dá)顯著上調(diào)，表 明腫瘤細(xì)胞中HER2信號(hào)對(duì)miR-139的表達(dá)發(fā)揮重要的抑制作用(如圖Id左所示)。同時(shí)， HER2中度表達(dá)的、低侵襲能力的胃癌AGS細(xì)胞系，和HER2陰性的正常胃粘膜細(xì)胞系GES-I 中miR-139的表達(dá)水平明顯高于高侵襲能力的SGC7901和MKN-45細(xì)胞(如圖Id右所示)， 表明HER2通過(guò)抑制miR-139的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲。為了進(jìn)一步闡明HER2、miR-139和CXCR4之間的調(diào)控關(guān)系，我們?cè)贖ER2表達(dá)沉 默的SGC-7901和MKN-45細(xì)胞中直接導(dǎo)入miR-139的反義核酸，發(fā)現(xiàn)阻斷miR-139的表達(dá) 后CXCR4的表達(dá)水平顯著上調(diào)(如圖Ie所示)；相反，在高表達(dá)HER2的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染合成的 miR-139，又能夠抑制CXCR4的表達(dá)(如圖If所示)。以上結(jié)果表明，在胃癌等轉(zhuǎn)移性腫瘤 細(xì)胞中，HER2信號(hào)通過(guò)抑制miR-139的表達(dá)，解除后者對(duì)CXCR4表達(dá)的抑制作用。在進(jìn)一步的研究中，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面跨膜糖蛋白⑶44對(duì)于HER2介導(dǎo)的miR-139 表達(dá)抑制是必需的。如圖Ig所示，在高表達(dá)HER2的SGC-7901和MKN-45細(xì)胞中沉默⑶44 的表達(dá)，則細(xì)胞中miR-139的表達(dá)明顯上調(diào)，而在HER2中度表達(dá)⑶44陰性的AGS細(xì)胞中異 位表達(dá)CD44，則miR-139的表達(dá)受到顯著抑制，在HER2陰性的GES-I細(xì)胞中共表達(dá)HER2和 ⑶44，則miR-139的表達(dá)亦被顯著抑制(如圖Ih所示)。這些結(jié)果表明，HER2通過(guò)與⑶44 相互作用，抑制miR-139的表達(dá)，從而促進(jìn)CXCR4的表達(dá)。2. HER2/CD44通過(guò)促進(jìn)miR-139基因組蛋白去乙?；种坪笳弑磉_(dá)。我們對(duì)miR-139的表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)miR-139的表達(dá)與其在基 因座位上的宿主基因PDE2A并沒(méi)有相關(guān)性，提示miR-139可能是獨(dú)立表達(dá)的。隨后，我們通 過(guò)5，RACE實(shí)驗(yàn)鑒定了 miR-139前體及其基因表達(dá)調(diào)控序列，構(gòu)建了 miR-139啟動(dòng)子區(qū)域 (-1500 +200bp)的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體。如圖2a所示，通過(guò)轉(zhuǎn)染進(jìn)入胃癌MKN-45 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抑制HER2或⑶44的表達(dá)并不能顯著改變熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體中miR-139 啟動(dòng)子的活性(如圖2a所示)，提示HER2/⑶44可能通過(guò)表觀遺傳學(xué)途徑調(diào)控miR-139的 表達(dá)。為了探索miR-139表達(dá)調(diào)控的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制，我們分別用組蛋白去乙?；?酶抑制劑PBA和DNA甲基化酶抑制劑5-Aza-CdR處理細(xì)胞。如圖2b所示，PBA處理可以明 顯恢復(fù)miR-139的表達(dá)，而5-Aza-CdR則沒(méi)有明顯作用；應(yīng)用另一種組蛋白乙?；敢种苿?TSA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到了相似的結(jié)果(如圖2e所示)。另一方面，通過(guò)亞硫酸鹽測(cè)序等實(shí)驗(yàn)， 我們發(fā)現(xiàn)HER2表達(dá)沉默并不能顯著影響細(xì)胞中miR-139基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平。以上結(jié)果表明，miR-139表達(dá)的抑制作用可能是基于miR-139基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白的去乙酰 化修飾。我們應(yīng)用PBA處理HER2陽(yáng)性胃癌細(xì)胞后檢測(cè)CXCR4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CXCR4蛋白水平 顯著下調(diào)(如圖2d所示)；我們隨后應(yīng)用乙?；M蛋白H3的抗體進(jìn)行染色體免疫沉淀分 析，發(fā)現(xiàn)正常HER2陽(yáng)性胃癌SGC-7901和MKN-45細(xì)胞中無(wú)法檢測(cè)到miR-139基因啟動(dòng)子區(qū) 組蛋白H3第9位賴(lài)氨酸(H3K9)的乙?；ㄟ^(guò)抑制HER2或⑶44的表達(dá)，或者應(yīng)用PBA 阻斷組蛋白的去乙?；^(guò)程，則可以顯著上調(diào)miR-139基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3K9的乙?；?水平(如圖2e所示)。這些結(jié)果證實(shí)，HER2信號(hào)通過(guò)誘導(dǎo)miR-139基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋 白去乙?；种破浔磉_(dá)，從而促進(jìn)CXCR4的表達(dá)。我們進(jìn)一步對(duì)HER2信號(hào)誘導(dǎo)miR-139基因組蛋白去乙?；脑敿?xì)機(jī)制進(jìn)行了研 究。如圖2f所示，分別應(yīng)用抗組蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)抗體和作為Mi2/核小體重塑 和去乙?；瘡?fù)合體(NuRD)重要組分的轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白復(fù)合物MTAl的抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫 沉淀，均能有效地沉淀獲得miR-139的啟動(dòng)子DNA區(qū)段，表明MTAl和HDAC2均參與結(jié)合 miR-139的啟動(dòng)子區(qū)域，從而可能參與該區(qū)域的組蛋白去乙?；^(guò)程。那么，MTAl的表達(dá)是否受到HER2信號(hào)調(diào)控呢？我們?cè)贛KN-45細(xì)胞中抑制HER2或 ⑶44的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MTAl的表達(dá)隨之受到抑制，與之同步的是miR-139表達(dá)的上調(diào)(如圖2g 所示)。相似地，應(yīng)用表皮生長(zhǎng)因子家族受體酪氨酸激酶抑制劑gefitinib處理細(xì)施，或者 表達(dá)⑶44的顯性負(fù)突變體，也能夠強(qiáng)烈抑制MTAl的表達(dá)(如圖2h左所示)。與此相反， HER2信號(hào)的激活劑Heregulin則可以明顯上調(diào)細(xì)胞中MTAl的表達(dá)(如圖2h右所示)，顯 示腫瘤細(xì)胞中HER2信號(hào)可以明顯促進(jìn)MTAl的表達(dá)，而后者是參與組蛋白去乙酰化修飾的 重要蛋白質(zhì)復(fù)合物。我們進(jìn)一步研究了受HER2信號(hào)上調(diào)的MTAl對(duì)下游miR-139和CXCR4表達(dá)的影 響。如圖2i所示，無(wú)論是否使用HER2信號(hào)的激活劑Heregulin，MTAl表達(dá)沉默后細(xì)胞中 miR-139均得以恢復(fù)表達(dá)，從而封閉CXCR4的表達(dá)。在MKN-45細(xì)胞中，組蛋白去乙?；?HDAC抑制劑PBA可以明顯上調(diào)miR-139的表達(dá)，并糾正由MTAl過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的miR-139表達(dá) 抑制，但它對(duì)MTAl本身的表達(dá)水平?jīng)]有影響(如圖2j所示)。以上結(jié)果表明，HER2通過(guò)與 ⑶44相互作用上調(diào)MTAl的表達(dá)，后者進(jìn)一步通過(guò)募集HDAC誘導(dǎo)miR-139基因組蛋白的去 乙酰化，從而抑制其表達(dá)。3.通過(guò)沉默HER2和⑶44的表達(dá)上調(diào)miR-139，可以有效地抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。通過(guò)在BALB/c裸鼠右后肢皮下注射對(duì)照SGC-7901和MKN-45細(xì)胞，或者穩(wěn)定表 達(dá)HER2、⑶44表達(dá)沉默的上述細(xì)胞，建立裸鼠移植瘤模型。連續(xù)測(cè)量腫瘤體積(如圖3a所 示)，待瘤體達(dá)500m3時(shí)剝瘤稱(chēng)重，計(jì)算其與體重的比值(如圖3b所示)。我們發(fā)現(xiàn)，HER2 或CD44的表達(dá)沉默可以明顯抑制在體腫瘤的形成和生長(zhǎng)，而同時(shí)抑制二者的表達(dá)更是完 全阻斷了移植瘤的形成(如圖3a、b所示)。對(duì)腫瘤組織裂解物進(jìn)行Northern blot和 Westernblot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HER2或CD44表達(dá)沉默后，miR-139的表達(dá)明顯上升，而CXCR4的表 達(dá)則顯著受到抑制(如圖3c所示)。4.臨床胃癌樣本中HER2、CD44、miR-139和CXCR4表達(dá)呈現(xiàn)相關(guān)性。我們收集了 43例原發(fā)性胃癌石蠟包埋組織樣品，其中19例并發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。免疫組化和原位雜交實(shí)驗(yàn)顯示，在轉(zhuǎn)移性胃癌中，17例(89% )為HER2陽(yáng)性，17例(89% )為 ⑶44陽(yáng)性，18例(95% )為CXCR4陽(yáng)性，而在這些樣品中均來(lái)檢測(cè)到miR-139的表達(dá)，而在 非轉(zhuǎn)移胃癌樣品中，HER2、CD44、CXCR4和miR-139陽(yáng)性比率分別為13% (3例)、33% (8 例)、13% (3例)和46% (表1)。在19例并發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中，有16例(84% )為HER2、 CD44和CXCR4同時(shí)陽(yáng)性(表l，p < 0. 0001)，這16例轉(zhuǎn)移灶對(duì)應(yīng)的原發(fā)腫瘤中，有15例同 時(shí)表達(dá)3種蛋白，1例為HER2和⑶44雙陽(yáng)性，同時(shí)在這些轉(zhuǎn)移性原發(fā)腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶中均 未檢測(cè)到miR-139的表達(dá)。在非轉(zhuǎn)移性胃癌樣品中，僅有3例(12. 5% )檢測(cè)到三種蛋白的 同時(shí)表達(dá)(表1)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在非轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移性胃癌樣品中，HER2、CD44和CXCR4的表 達(dá)均呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性(P < 0. 0001)。表1. 43例胃癌患者腫瘤細(xì)胞HER2、CD44、miR-139和CXCR4的表達(dá)情況
權(quán)利要求
1.microRNA-139在制備治療轉(zhuǎn)移性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
2.microRNA-139在制備腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了microRNA-139(簡(jiǎn)稱(chēng)miR-139)在制備轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療藥物和診斷試劑中的用途。miR-139通過(guò)作用于其靶基因趨化因子受體CXCR4抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。腫瘤細(xì)胞中，人表皮生長(zhǎng)因子家族分子HER2通過(guò)與CD44相互作用，下調(diào)miR-139的表達(dá)，因此，檢測(cè)miR-139及其相互關(guān)聯(lián)的HER2、CD44和CXCR4的表達(dá)，可以對(duì)腫瘤進(jìn)行早期診斷，對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后做出評(píng)價(jià)；在HER2陽(yáng)性腫瘤中表達(dá)miR-139，或通過(guò)干預(yù)miR-139的上游信號(hào)恢復(fù)內(nèi)源miR-139的表達(dá)，可以對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑制作用。
文檔編號(hào)A61K31/7105GK102000347SQ201010535660
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者付海京, 孟艷玲, 張瑞, 楊安鋼, 王磊, 謝橋生, 賈林濤, 鮑煒 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)