專利名稱：重組ccr5δ32基因型胚胎干細胞株及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種重組CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型胚胎干細胞株，本發(fā)明還涉及采用同源基因重組技術獲得所述干細胞株的方法。
背景技術：
CCR5是T細胞表面與艾滋病毒結合的聯(lián)合受體之一，研究人員們一直在尋找改變或破壞CCR5受體功能的方法，希望達到治療艾滋病的目的。有人利用鋅指核酸酶破壞造血干細胞的 CCR5 基因表達(Nathalia Holt et al. Human hematopoietic stem/progenitorcells modified by zinc-finger nucleases targeted to CCR5control HIV-Iin vivo.Nat Biotechnology28(8) :839_47，2010.)，使CCR5基因發(fā)生突變。但此方法的缺點是造成T細胞的CCR5基因完全失活狀態(tài)，不能保留CCR5的其它功能。而且，這種CCR5基因失活的細胞不具備永生性。
已發(fā)現(xiàn)CCR5A32/A32基因型的人群對艾滋病具有天然的免疫力。文獻(Hutter, G. etal. Long-term control of HIV by CCR5Delta32/Delta32stem celltransplantation. N Engl JMed 360 :692-698,2009)報道用帶有天然缺失 32 堿基的 CCR5基因的骨髓成功治愈了一例既有白血病又有艾滋病的患者。CCR5A32是指該基因缺失32個堿基的突變型，由于此突變導致艾滋病毒無法與T細胞結合從而無法攻擊T細胞產生免疫缺陷。遺憾的是，盡管自然界本身存在這種基因型，真正處于純合狀態(tài)(CCR5 Λ 32/Λ 32)的這種基因型并對艾滋病具有天然免疫力的個體極少，在歐洲人群中僅占I %，而在亞洲和其他人種至今未見報道。因此，想要利用他們的骨髓或臍帶血來治療艾滋病基本不具備可能性和實用性。況且，不論是骨髓或是臍帶血，都無法在體外擴增，更是增加了其獨有的稀缺性。而人為定點刪除CCR5中32個堿基的CCR5 Δ 32/ Δ 32的并具有永生性的細胞株，至今尚未見報道。大腸桿菌同源重組是20世紀90年代末發(fā)展起來的一種新的基因工程技術，最初是在大腸桿菌Escherichia coli里進行的,它可以不必依賴限制性酶切位點而定點精確地完成諸如片段插入、刪除及序列改變等等基因改造。大腸桿菌同源重組技術常用于染色體DNA的靶向修飾-基因敲入與敲除，以及空隙修復(gap-r印air)方式獲取目的基因。二者共同之處是都必須以PCR方法合成兩側50-70bp的短同源序列，然后通過細菌內同源重組將短同源序列間的片段插入基因的目標位置或套取相應的基因目標片段。由此可見，利用該項技術可以在大腸桿菌體內方便地進行DNA靶序列的敲除、敲入、克隆、突變等多種遺傳工程操作。結合目前飛速發(fā)展的胚胎干細胞(ES)技術使得在生物整體水平上定向改變和修飾哺乳類動物的遺傳物質稱為可能。雖然基因打靶技術應用于改造胚胎干細胞基因較早，但由于以前打靶載體多為利用限制性酶切技術構建打靶載體，由于酶切位點的局限性打靶載體的同源臂長度受到限制，從而使得胚胎干細胞的基因同源重組成功率極低。而最近利用細菌內同源重組技術在BACDNA的基礎上可以構建出足夠長的同源臂的打靶載體，因此可以較大地提高胚胎干細胞基因打革巴的效率(Song et al. Modeling disease in human ESCs using an efficientBAC-based homologous recombination system. Cell Stem Cell,6 :80-89,2010)。綜上，如果能利用同源基因重組技術手段，定點刪除CCR5的32個堿基，得到CCR5 Δ 32，建立一種處于純和狀態(tài)CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型的永生性細胞株。這種永生性細胞株，在適當?shù)臈l件下，可以定向分化為所需要的細胞(如CD4陽性細胞)，既能抵御特定病毒的侵入，同時又保留了 CCR5的其它功能。并且，這種過程可以無限重復。因此，建立永生性的CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型胚胎干細胞株具有重大意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是對胚胎干細胞的CCR5基因的32個堿基進行定點刪除改造，建立 具有永生性的CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型靈長目動物胚胎干細胞株。所得到的細胞株在被定向誘導分化為CD4陽性細胞后，既能抵御特定病毒的侵入，又保留了 CCR5的其它功能，且具有永生性。本發(fā)明的另一目的是利用同源重組技術制備上述細胞株。本發(fā)明對人胚胎干細胞的CCR5基因的32個堿基進行定點刪除改造，建立了具有永生性的CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型胚胎干細胞株，達到了上述發(fā)明目的。因此，本發(fā)明提供了一種其CCR5基因特定位點缺失了 32對堿基；所述特定位點是 3321-3352，S卩 TATCAATTCTGGAAGAAITTCCAGACATTAAA (CCR5 基因號 NG 012637. 1，位于3ρ21· 31)。本發(fā)明在基因打靶hES的過程中確認CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型(見實施例)。本發(fā)明根據多項人胚胎干細胞株常用鑒定實驗(多能基因的表達、擬胚體形成、畸胎瘤形成及核型分析)證明經過基因改造后的人胚胎干細胞株仍然保留了人胚胎干細胞的特征活性，即，該細胞株具有分化成CD4陽性T細胞的能力。T細胞表面標志為CD3陽性，為HIV病毒侵襲感染的T細胞亞型為⑶4陽性。如果CCR5 Λ 32/ Λ 32基因型hES細胞株在體外誘導分化成CD4陽性T細胞，可以通過抗CD3、CD4抗體進行免疫組化實驗和流式細胞術鑒定，當實驗結果表明分化細胞為CD3、CD4雙陽性時即證明該細胞株具有分化成CD4陽性T細胞的能力。本發(fā)明所得到的CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型人胚胎干細胞株，經定向分化為骨髓造血干細胞(或CD4陽性細胞)后，即可作為細胞性藥物，直接用于HIV病毒的基因治療。由于人胚胎干細胞具有全能性，可以在體外特定條件下分化成人體各種組織細胞包括CD4陽性T細胞；同時人胚胎干細胞具有干細胞特性，可以在體外無限增殖擴增。因此，本發(fā)明所獲得的CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型人胚胎干細胞株是一種特殊的人胚胎干細胞株，既能無限擴增殖，又具有多向分化潛能。將其定向分化為骨髓干細胞(或CD4陽性細胞)時，可用于艾滋病的治療。由于CCR5參與了機體的免疫功能，當發(fā)生Λ 32突變時，僅導致病毒不能侵入，而對其它功能基本不受影響，而且由于胚胎干細胞的永生性和無限擴增能力，使得這種過程得以無限重復，具有很強的實用性，為治療艾滋病提供了一種新途徑。另一方面，本發(fā)明還提供了一種采用同源重組技術獲得CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型胚胎干細胞株的方法。本方法的主要技術手段是采用BAC DAN和大腸桿菌內同源重組技術構建打靶載體，電轉入胚胎干細胞后改造CCR5基因。具體方法是采用BAC DAN和大腸桿菌內同源重組技 術構建打靶載體，電轉化胚胎干細胞后改造CCR5基因。所述構建打靶載體是構建兩個帶有正負篩選PNS標記的中間打靶載體和一個無篩選標志的CCR5A32打靶載體，通過標記和置換兩步打靶法獲得一種無篩選標記的CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型胚胎干細胞株。發(fā)明人使用了前述具有人CCR5基因的BAC克隆菌株RP11-24F11，以及德國genebridge 公司的試劑盒“counter-selection BAC modification Kit”,該試劑盒能夠對BAC DNA進行細菌內同源重組，從而較快地獲得前述三種打靶載體。然后通過“標記與置換”策略，運用這3種打靶載體經兩步同源重組，將基因型為CCR5的hES細胞株改造為不帶任何標記基因或外來片段的CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型的hES細胞株。本發(fā)明的方法不僅可用于人胚胎干細胞的CCR5基因的32個堿基定點刪除，還可用于其它靈長類動物胚胎干細胞的基因改造，建立CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型的其它靈長目動物胚胎干細胞株。


圖I 插入 rpsl-neo cassette ；圖 2CCR5 Δ 32DNA 替換 rpsl-neo cassette ；圖3rpsl_neo cassette設計及插入位點；圖4CCR5 Δ 32DNA設計及替換位點；圖5打靶載體-3線性化；圖6打靶載體I構建；圖7打靶載體I線性化；圖8打靶載體2構建；圖9打靶載體2線性化；圖IOhES第一次基因打靶；圖IlhES第二次基因打靶；圖12CCR5 Δ 32DNA第一次置換hES上標記基因；圖13CCR5 Δ 32DNA第二次置換hES上標記基因。
具體實施例方式一、打靶載體構建(一 )打靶載體3構建(見圖1、2、5)I. PCR擴增含同源臂的rpsl-neo片段I. I引物設計
I. I. I選擇標志基因插入片段(rpsl-neo cassette)的引物(見圖3)上游引物設計包括5'端50bp的同源臂和3'端的rpsl-neo的24bp引物；下游引物設計包括5'端50bp的同源臂和3'端的rpsl-neo的22bp引物。上游引物AATCATCTTTACCAGATCTCAAAAAGAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTGGCCTGGTGATGATGGCGGGATCG下游引物AGCAGATGACCATGACAAGCAGCGGCAGGACCAGCCCCAAGATGACTATCCTCGAGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGI. I. 2CCR5 Δ 32寡核苷酸片段(CCR5 Δ 32DNA)合成引物(見圖4)
上游引物GGTGGTGGCTGTGTTTGGCGTCTCTCCCAGGAATCATCTTTACCAGATCTCAAAAAGAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACAGTCAG下游引物ACCGAAGCAGAGTTTTTAGGATTCCCGAGTAGCAGATGACCATGACAAGCAGCGGCAGGACCAGCCCCAAGATGACTATCCTGACTGTATGGAAAATGAG該兩個引物后段劃斜線處為annealing PCR用。I. 2PCRI. 2. I選擇標志基因插入片段(rpsl-neo cassette)

權利要求
1.一種靈長目動物的CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型細胞株，其特征是CCR5基因位于3321 3352位點的32對堿基缺失。
2.權利要求I所述的細胞株，其特征是基因重組胚胎干細胞株。
3.權利要求I或2所述的細胞株，所述靈長目動物是人。
4.權利要求2所述的細胞株，其特征是采用同源基因重組技術建立的。
5.一種CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型胚胎干細胞株的制備方法，其特征是采用同源基因重組技術，直接對胚胎干細胞的CCR5基因的32個堿基進行定點刪除。
6.權利要求5所述的制備方法，所述同源基因重組技術是采用BACDAN和大腸桿菌內同源重組技術構建打靶載體，電轉化胚胎干細胞后改造CCR5基因。
7.權利要求6所述的制備方法，所述構建打靶載體是構建兩個帶有正負篩選(PNS)標記的中間打靶載體和一個無篩選標志的CCR5 Δ 32打靶載體，通過標記和置換兩步打靶法獲得一種無篩選標記的CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型胚胎干細胞株。
8.權利要求I或2所述的細胞株在制備艾滋病的治療藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組CCR5Δ32/Δ32基因型胚胎干細胞株，本發(fā)明還涉及所述干細胞株的制備方法。本發(fā)明利用同源重組技術直接對人胚胎干細胞的CCR5基因的32個堿基進行定點刪除改造，建立了具有永生性的CCR5Δ32/Δ32基因型靈長類動物胚胎干細胞株。所得到的細胞株在被定向誘導分化為CD4陽性細胞后，既能抵御病毒的侵入，又保留了CCR5的其它功能，為治療艾滋病提供了一種新途徑。
文檔編號A61P31/18GK102888381SQ20111020076
公開日2013年1月23日 申請日期2011年7月18日 優(yōu)先權日2011年7月18日
發(fā)明者李東升, 曾毅, 盧智勇, 滕智平 申請人:武漢丹彌優(yōu)生物醫(yī)藥有限公司