專利名稱：一種麥冬多糖的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種麥冬多糖及其制備方法，屬于中藥制劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
麥冬為百合科植物Ophiopogon japonicus (L. f) Ker-gawl.的干燥塊根。麥冬在我國有著悠久的藥用歷史，主要含有麥冬主要化學(xué)成分為留體皂苷、多糖，還有高異黃酮類、氨基酸等，這些成分共同起作用使麥 冬具有廣泛的藥理作用，主要表現(xiàn)為抗心肌缺血和心肌梗塞作用；免疫調(diào)節(jié)作用；降低血糖作用；抗腫瘤作用等。而大部分研究表明起主要作用的是麥冬皂苷和多糖，國內(nèi)外對麥冬的活性成分的提取工藝和藥效研究始終非?；钴S，特別是對于麥冬皂苷的報道多見，但是今年來隨著分離、分析手段的提高，對于麥冬多糖的研究也取得了較大的進展。麥冬多糖為麥冬的活性成分。研究表明麥冬多糖具有增強機體免疫調(diào)節(jié)功能及增強化療藥物抗腫瘤作用，對腫瘤有明顯的抑制作用。實驗表明，麥冬多糖能誘生腫瘤壞死因子和干擾素-Y，對腫瘤細胞有殺傷和抑制作用。腫瘤壞死因子是由激活的巨噬細胞/單核細胞系統(tǒng)產(chǎn)生的多功能蛋白分子，在機體內(nèi)起著重要的生理作用。在體內(nèi)腫瘤壞死因子可以通過三種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用直接殺傷腫瘤細胞；作用于腫瘤血循環(huán)，導(dǎo)致腫瘤組織血供減少,從而影響腫瘤的生長；激活機體免疫系統(tǒng)的抗腫瘤作用。同時，腫瘤壞死因子還可介導(dǎo)炎性過程，減少網(wǎng)膜組織間皮細胞溶纖維蛋白活性，進而使網(wǎng)膜表面纖維蛋白增多，減少組織外滲。干擾素是細胞在受到刺激物作用后合成并釋放出的蛋白性淋巴因子，其作用為直接抗病毒作用；增強主要組織相容性抗原和腫瘤相關(guān)抗原的表達；增強自然殺傷細胞(NK)的細胞毒作用；增強抗體依賴性細胞的細胞毒作用；直接的抗細胞增值作用和抗血管生成作用。同時麥冬多糖能增強T淋巴細胞及NK細胞活性，提高了機體的免疫調(diào)節(jié)功能，而有利于抗腫瘤作用的發(fā)揮。其次，麥冬多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以用于糖尿病等。麥冬多糖具有顯著增強單核吞噬細胞系的功能，麥冬多糖可明顯增加巨噬細胞的吞噬指數(shù)。麥冬多糖能促進抗體和補體的形成，可以顯著增加血清補體和血清IgG的含量。專利200710040543. 6公開了一種麥冬多糖的制備方法，其提純方法為
A)取干燥麥冬塊根，壓扁，用8-12倍量水提3次，合并水提液，并將其減壓濃縮至
O.5-lg/ml,加入75%-95%乙醇至含醇量達60%_80%，靜置過夜，傾去上清液，沉淀重復(fù)醇沉I次，冷凍干燥，得淡黃色麥冬粗多糖粉末；
B)將麥冬粗多糖粉末用15倍水溶解，采用超濾方法分離，其中超濾膜的材料選自醋酸纖維膜、聚砜、聚酰胺或磺化聚砜；超濾膜的形狀采用平板式、中空纖維式、管式或卷式；超濾壓力為O. 1-0. 3Mpa，超濾膜的截留分子量指標為10000 ；
C)麥冬多糖的純化，超濾后的濃縮液通過型號為D-301、D-355、D-315或D-345的大孔弱堿性陰離子交換樹脂，用水洗脫，收集4-8倍柱體積的洗脫部分，合并，干燥，即得麥冬多Hmdg-I0
此提純方法僅采用了多次水煮醇沉、冷凍干燥、制備粗多糖，超濾膜的截留分子量為10000，純化采用陰離子交換樹脂，與本專利采用截留分子量5kd膜不同。專利申請201110326803. 2公開了一種麥冬多糖的制備方法
A)該麥冬多糖為包含阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖的雜多糖，其中半乳糖和葡萄糖的比例為1:1-3,阿拉伯糖含量為1-10%,重均分子量為2-10萬。B)該多糖制備方法為水提取，濃縮，去蛋白，醇沉，離子交換層析，冷凍干燥； 此專利申請在水提的基礎(chǔ)上采用了離子交換層析的分離純化，但所含雜質(zhì)仍然比較
多，麥冬多糖的分子量分布未確定。上述授權(quán)或公開的專利所采用的麥冬多糖提取工藝，麥冬多糖含量均未達到《中藥、天然藥物注射劑基本技術(shù)要求》(國食藥監(jiān)注[2007]743號)關(guān)于“有效陳份制成的注射齊U，主成分含量應(yīng)不少于90%。多成份制成的注射劑，所測成分應(yīng)大于總固體量的80%”的質(zhì) 量標準。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種過程簡單、操作方便的麥冬多糖提取、分離純化方法，所制得的麥冬多糖純度高、溶解性好、分子量分布均一，可用于制備麥冬多糖注射劑。為臨床提供一種新的藥用物質(zhì)。本發(fā)明的麥冬多糖提取工藝，采用膜分離工藝，用5kDa膜包，去除高分子、難溶性多糖及雜質(zhì)，，得到高純度均一麥冬多糖。本發(fā)明所述的麥冬多糖的分離、純化方法，包括以下步驟
(1)醇提使用75°/Γ95%的乙醇，加熱回流提取2 4次，每次提取2 4小時，乙醇與麥冬的重量比為1:4 8，濾過，將麥冬晾干；
(2)水提向上述晾干的麥冬中加入其6 10倍重量的純化水，加熱，回流提取2飛次，每次2 4小時,得水提液；
(3)醇沉將上述過柱流出液減壓濃縮至相對密度I.02 I. I的液體，加入乙醇使含醇量達85%以上，室溫放置10 24小時，離心，取沉淀，沉淀用無水乙醇或丙酮洗滌，減壓干燥，得粗多糖提取物；
(4)膜分離將上述粗多糖用注射用水20 50倍溶解，加入活性炭O.
煮沸，保持微沸30分鐘，離心，濾過，濾過液用5kDa膜包超濾，收集透過液，濃縮,加乙醇沉淀，沉淀用乙醇洗滌，減壓干燥，得麥冬多糖；
本發(fā)明所具有的技術(shù)優(yōu)勢為
I.麥冬多糖分離、純化技術(shù)可靠，操作步驟簡單，條件易于控制，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。2.本發(fā)明所得麥冬多糖分子量分布范圍固定，重均分子量小于5000道爾頓，重復(fù)性好。3.所制得的麥冬多糖純度高、安全性好，為首次發(fā)明制備分子量小于5000的均一麥冬多糖。
具體實施例方式實施例I :(1)醇提使用85%的乙醇，加熱回流提取2次，每次提取2小時，乙醇與麥冬的重量比為1:6，濾過，將麥冬晾干；
(2)水提向上述晾干的麥冬中加入其8倍重量的純化水，加熱，回流提取4次，每次 3小時，得水提液；
(3)醇沉將上述水提液減壓濃縮至相對密度I.02 I. I的液體，加入乙醇使含醇量達85%以上，室溫放置12小時，離心，取沉淀，沉淀用無水乙醇洗滌，減壓干燥，得粗多糖提取物；
(4)膜分離將上述粗多糖用注射用水30倍溶解，加入活性炭I%，加熱煮沸，保持微沸30分鐘，離心，濾過，濾液用5kDa膜包超濾，將截留液加乙醇沉淀，沉淀用乙醇洗滌，減壓干燥，得麥冬多糖；
上述麥冬多糖，苯酚硫酸法測定，麥冬多糖純度95. 2%，分子量分布小于5000道爾 頓。實施例2:
(1)醇提使用75%的乙醇，加熱回流提取3次，每次提取3小時，乙醇與麥冬的重量比為1:4，濾過，將麥冬晾干；
(2)水提向上述晾干的麥冬中加入其6倍重量的純化水，加熱，回流提取2次，每次 2小時，得水提液；
(3)醇沉將上述水提液減壓濃縮至相對密度I.02 I. I的液體，加入乙醇使含醇量達85%以上，室溫放置10小時，離心，取沉淀，沉淀用無水丙酮洗滌，減壓干燥，得粗多糖提取物；
(4)膜分離將上述粗多糖用注射用水20倍溶解，加入活性炭O.I %，加熱煮沸，保持微沸30分鐘，離心，濾過，濾液用5kDa膜包超濾，收集透過液，濃縮，加乙醇沉淀，沉淀用乙醇洗滌，減壓干燥，得麥冬多糖；
上述麥冬多糖，經(jīng)測定，苯酚硫酸法測定，麥冬多糖純度96. 2%，分子量分布小于5000道爾頓，淀粉、蛋白含量檢測為陰性。實施例3:
(1)醇提使用95%的乙醇，加熱回流提取4次，每次提取4小時，乙醇與麥冬的重量比為I: 8，濾過，將麥冬晾干；
(2)水提向上述晾干的麥冬中加入其10倍重量的純化水，加熱，回流提取5次，每次 4小時，得水提液；
(3)醇沉將上述水提液減壓濃縮至相對密度I.02 I. I的液體，加入乙醇使含醇量達85%以上，室溫放置24小時，離心，取沉淀，沉淀用無水乙醇或丙酮洗滌，減壓干燥，得粗多糖提取物；
(4)膜分離將上述粗多糖用注射用水50倍溶解，加入活性炭3%，加熱煮沸，保持微沸30分鐘，離心，濾過，濾液用5kDa膜包超濾，收集透過液，濃縮，加乙醇沉淀，沉淀用乙醇洗滌，減壓干燥，得麥冬多糖；
上述麥冬多糖，經(jīng)測定，苯酚硫酸法測定麥冬多糖純度96. 8%，分子量分布小于5000道爾頓，淀粉、蛋白含量檢測為陰性。實施例4 :苯酚硫酸法測定麥冬多糖中總糖的含量實驗方法精密稱取標準單糖或單糖混合物lOOmg，配制成濃度為O. lmg/ml的溶液，分別取O. 2ml, O. 4ml, O. 6ml, O. 8ml, I. Oml,依次補加蒸懼水至lml。以蒸懼水為對照，分別向其中加入6%的苯酚O. 5ml，濃硫酸2. 5ml，充分振蕩搖勻后，冷卻至室溫，490nm處測定吸光度值，以濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，做標準曲線，得標準曲線方程式。準確稱取適量麥冬多糖樣品配成濃度為O. lmg/ml的溶液，按同法處理后，根據(jù)多糖樣品的吸光度值，代入標準曲線方程計算出麥冬多糖樣品的總糖含量。實驗結(jié)果以標準葡萄糖為對照品
￥高I麥冬多糖含量(重量百分比％)—
實施例I所的樣品95. 2_
實施例2所的樣品96.2_ 實施例3所的樣品|96. 8—
實施例6 :分子量分布范圍檢測
試驗方法采用高效液相色譜法(中國藥典2010年版二部附錄V H方法二)測定。儀器與試藥島津LC-IOAVP高效液相色譜儀(手動進樣)；檢測器示差折光檢測器SHODEX RI-201H，檢測器溫度35 V ; GPC專用軟件大連依利特EC2000。供分子量測定用右旋糖酐分子量標準對照品(中國藥品生物制品檢定所購買，D3、D4、D5、D6、D7、D8、D2000,分子量依次為 7100、10000、21400、41100、84110、133800、2000000，批號分別為140640-2000-01、140641-2000-01、140642-2000-01、140643-2000-01、140644-2000-01、140645-2000-01、140646-2000-01);水為娃哈哈純凈水
色譜條件
色譜柱為測多糖專用色譜柱，Shodex KS-805 ;流動相水；柱溫45 °C ;流速
I. Oml/min,檢測器溫度35°C。方法試驗
供試品溶液的制備取提取的多糖原料適量，加水制成每I ml中約含2 mg的溶液，振搖，室溫放置過夜，作為供試品溶液。對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的葡聚糖對照品D3 D8和D2000，各10mg，分置2ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。(每Iml中含各葡聚糖對照品5mg。)
標準曲線的制備及樣品測定
取上述右旋糖酐系列對照品溶液分別進樣20ul，記錄洗脫峰的保留時間，由GPC專用軟件繪制標準曲線，以標準分子量的對數(shù)值為縱坐標，以相應(yīng)色譜峰的保留時間為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程。該方法的標準校正曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)達O. 9994。(標準曲線同前面麥冬藥材)
分子量測定法
精密移取供試品溶液20ul，注入高效液相色譜儀，可獲得供試品溶液的歸一化色譜圖，記錄洗脫峰的保留時間，根據(jù)GPC專用軟件繪制的標準曲線及供試品的保留時間，采用GPC專用軟件計算樣品各組分的重均分子量、數(shù)均分子量及其分子量分布，結(jié)果三批樣品分子量分布范圍均小于5000道爾頓。實施例7 :麥冬多糖對肝癌小鼠腫瘤生長及免疫器官的影響 試驗材料I、供試品
麥冬多糖注射液，規(guī)格4ml 12mg,由實施例1、2、3制備的麥冬多糖配制。2、對照品和試劑
市售人參多糖注射液，規(guī)格2ml :6mg，批號20090502,由山西普德藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。注射用環(huán)磷酰胺，規(guī)格0. 2g，批號10051521，由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)。O. 9 %氯化鈉注射液，規(guī)格250ml，批號1003154204,由山東魯抗辰欣有限公司 提供。3、實驗動物和飼養(yǎng)條件
昆明種小鼠115只，SPF級，雌性，用于試驗時17-23kg，試驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)2d。動物飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境，室溫19 26V’濕度40%_70%，日溫差蘭4°C，換氣次數(shù)8-10次/h，晝夜明暗交替時間12h/12h，實驗動物使用許可證號SYXK (魯)20050055。動物用金屬兔籠單籠飼養(yǎng)，自由飲水，每日上下午各給予一次顆粒鼠飼料。飼養(yǎng)籠具兩周更換一次，料盒和水瓶每周更換一次，更換的籠具、料盒、水瓶需進行消毒處理。鼠飼料由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，許可證號滬飼審(2008) 04002。4、主要儀器設(shè)備
FA1004N型電子天平，由上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；
JY2001型電子分析天平，由上海精密科學(xué)儀器有限公司提供 HEMAVET-950型全自動血球計數(shù)儀，由Drew Scientific公司提供 試驗方法
I、給藥劑量及給藥頻率
麥冬多糖注射液，人參多糖注射劑市售iv，人參多糖注射劑市售im均設(shè)高、中、低三個劑量，分別為24、12、6mg/kg。環(huán)磷酰胺陽性對照組劑量為20mg/kg。模型組給予生理鹽水。本試驗小鼠給藥時間為9天，每天一次。2、動物分組
昆明種小鼠115只，按體重隨機分為11組麥冬多糖、人參多糖市售iv、人參多糖市售im均分為高、中、低劑量組，環(huán)磷酰胺陽性組，模型對照組。3、藥物配制
麥冬多糖高、中、低劑量分別取2、1、0. 5ml麥冬多糖注射液，加生理鹽水各稀釋至5ml,濃度分別為 I. 2、0· 6、0· 3 mg/ml。人參多糖市售(iv)高、中、低劑量分別取2、1、0. 5ml市售人參多糖注射液，加生理鹽水各稀釋至5ml，濃度分別為I. 2、O. 6、O. 3 mg/ml。人參多糖市售(im)低劑量取O. 6ml市售人參多糖注射液,加生理鹽水稀釋至
I.2ml,濃度為 I. 5mg/ml。環(huán)磷酰胺陽性對照組取一支注射用環(huán)磷酰胺，加生理鹽水稀釋至200ml，濃度為lmg/ml。
4、試驗過程
取瘤源肝癌小鼠3只，腹部消毒，用無菌消毒注射器抽取肝癌腹水，用生理鹽水按I :
2.5稀釋后備用。昆明種小鼠115只，逐一腋下碘酒、酒精消毒，腋下皮下接種上述制備的肝癌瘤液
O.2ml/ 只。
接種24h后，小鼠稱重，按體重隨機分為11組麥冬多糖注射液、人參多糖市售iv、人參多糖市售im高、中、低劑量組，環(huán)磷酰胺陽性組，模型對照組，每組10 11只。麥冬多糖注射液，人參多糖市售iv高、中、低劑量組，環(huán)磷酰胺陽性對照組，模型對照組尾靜脈注射相應(yīng)藥物，給藥體積均為O. 2ml/10g，人參多糖市售im高、中劑量組肌注給予人參多糖注射原液，給藥體積分別為O. 08,0. 04ml/10g,人參多糖市售im低劑量組肌注給予相應(yīng)藥物，給藥體積為O. 04ml/10g。每日給藥I次，連續(xù)給藥9d。第9天給藥后，禁食不禁水12h，稱重，摘眼球取血，解剖，稱取瘤重及胸腺、肝、脾重量，計算抑瘤率及對免疫器官重量的影響。觀察對小鼠體重、免疫學(xué)指標及肝腎功能的影響，包括紅細胞數(shù)目(WBC)，紅細胞數(shù)目(RBC)，血小板數(shù)目(PLT)，中性粒細胞數(shù)目(NE)，淋巴細胞數(shù)目(LY)，單核細胞數(shù)目(MO)，胸腺、脾臟、肝臟相對重量，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，尿素氮(BUN)。5、統(tǒng)計學(xué)處理
各個指標以均數(shù)土標準差表示，用SPSS13. O進行給藥組與模型對照組的統(tǒng)計學(xué)分析。試驗結(jié)果
小鼠皮下接種肝癌細胞，接種后麥冬多糖注射液、人參多糖市售iv連續(xù)9天尾靜脈注射給予荷瘤小鼠，人參多糖市售im連續(xù)9天肌肉注射給予荷瘤小鼠。麥冬多糖注射液與模型對照組比較，24、6mg/kg能減輕肝癌小鼠瘤重，具有明顯的抑瘤作用。與環(huán)磷酰胺組比較，各組脾臟系數(shù)均增大，白細胞均有明顯升高，12、6 mg/kg可增大胸腺系數(shù)，24mg/kg可明顯升高紅細胞。人參多糖市售與模型對照組比較,iv (24、12、6mg/kg)及im (24mg/kg)能減輕肝癌小鼠瘤重，具有明顯的抑瘤作用。與環(huán)磷酰胺組比較，各組胸腺系數(shù)均增大，白細胞均有明顯升高，iv (6mg/kg)可使脾臟系數(shù)增加，iv、im ( 24、6mg/kg)可明顯升高紅細胞。與人參多糖市售im (24mg/kg)抑瘤率比較，麥冬多糖注射液高(24、6mg/kg)、人參多糖市售iv (24、6mg/kg)抑瘤率明顯升高,抑瘤效果明顯優(yōu)于人參多糖市售im (24mg/kg)。試驗結(jié)論
麥冬多糖注射液與模型對照組比較，24、6mg/kg能減輕肝癌小鼠瘤重，具有明顯的抑瘤作用。與環(huán)磷酰胺組比較，各組脾臟系數(shù)均增大，白細胞均有明顯升高，12、6 mg/kg可增大胸腺系數(shù)，24mg/kg可明顯升高紅細胞。人參多糖市售與模型對照組比較,iv (24、12、6mg/kg)及im (24mg/kg)能減輕肝癌小鼠瘤重，具有明顯的抑瘤作用。與環(huán)磷酰胺組比較，各組胸腺系數(shù)均增大，白細胞均有明顯升高，iv (6mg/kg)可使脾臟系數(shù)增加，iv、im ( 24、6mg/kg)可明顯升高紅細胞。與人參多糖市售im (24mg/kg)抑瘤率比較，麥冬多糖注射液抑瘤率明顯升高，抑瘤效果明顯優(yōu)于人參多糖市售im (24mg/kg)0
麥冬多糖提取物對肝癌荷瘤小鼠瘤重的影響
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與模型組比較，*表示/7 ( O. 05，**轟示P ( O. 01 ;與麥冬多糖市售im(24mg/kg)比較，Δ 表示/7 ( O. 05，ΔΔ 表示/7 ( O. 01
麥冬多糖提取物對肝癌荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響
權(quán)利要求
1.一種麥冬多糖，特征在于該麥冬多糖重均分子量小于5000道爾頓。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述，其特征在于該麥冬多糖總多糖含量>90%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述，其特征在于該麥冬多糖制備關(guān)鍵步驟在于采用膜分離方法，去除大分子物質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述，該麥冬多糖采用以下方式制備(I)醇提使用75% 95%的乙醇，加熱回流提取21次，每次提取2 4小時，乙醇與麥冬的重量比為I: Γ8，濾過，將麥冬晾干；(2)水提向上述晾干的麥冬中加入其6 10倍重量的純化水，加熱，回流提取2飛次，每次2 4小時，得水提液；(3)醇沉將上述水提液減壓濃縮至相對密度I. 02 I. I的液體，加入乙醇使含醇量達85%以上，室溫放置10 24小時，離心，取沉淀，沉淀用無水乙醇或丙酮洗滌，減壓干燥，得粗多糖提取物；(4)膜分離將上述粗多糖用純化水20 50倍溶解，加入活性炭O. I % 3 %，加熱煮沸，保持微沸30分鐘，離心，濾過，濾液用5kDa膜包超濾，收集濾過液，濃縮，加乙醇沉淀，沉淀用乙醇洗滌，減壓干燥，得麥冬多糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述，由該麥冬多糖制備注射液具有增強免疫能力及抑瘤作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種麥冬多糖及其制備方法。該方法為選取麥冬經(jīng)醇提、水提、醇沉后，離心取沉淀得麥冬粗多糖，取粗多糖用水溶、加活性炭煮沸、膜分離、再醇沉，離心，取沉淀，干燥，得麥冬多糖，本工藝生產(chǎn)具有技術(shù)可靠、操作步驟簡單、條件易于控制的特點，適用于大規(guī)模生產(chǎn)；所制得的麥冬多糖分子量分布范圍固定，重均分子量小于5000道爾頓，總多糖含量>90%；用其制備麥冬多糖注射液具有增強免疫及抑瘤作用。
文檔編號A61P37/04GK102875689SQ201210379080
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月9日
發(fā)明者馬河, 郭琪, 粱大連 申請人:山東省醫(yī)藥工業(yè)研究所