專利名稱：膠原靶向治療增生性瘢痕蛋白藥物的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及免疫學(xué)領(lǐng)域的機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)及基因 的重組表達(dá)技術(shù)領(lǐng)域的人白細(xì)胞介素10 (human interlenkin 10，hIL_10)與膠原特異結(jié) 合的CBD多肽在基因水平融合后所表達(dá)的重組蛋白及其該重組蛋白應(yīng)用。
背景技術(shù)：
皮膚損傷愈合后，瘢痕仍繼續(xù)增殖，即可發(fā)展成增生性瘢痕。增生性瘢痕突出皮 面，形狀不規(guī)則，高低不平，潮紅充血，質(zhì)地實(shí)韌。有灼痛和瘙癢感，于環(huán)境溫度增高，情緒激 動(dòng)，或進(jìn)食辛辣刺激性食物時(shí)癥狀加劇。增生往往延續(xù)幾月或幾年后才逐漸發(fā)生退行性變 化，表現(xiàn)為突起高度減低，顏色轉(zhuǎn)暗，充血消退，變軟。有些最終可以平復(fù)，痛癢癥狀也大為 減輕或消失。增生瘢痕，好發(fā)于損傷深度僅及真皮的創(chuàng)傷，如深2度燒傷和切取厚的中厚度 片的供皮區(qū)創(chuàng)面等，偶爾亦見于較深的創(chuàng)傷和手術(shù)切口。增生瘢痕與正常瘢痕的病理組織差別，僅在于瘢痕深部膠原纖維的增厚，排列不 規(guī)則，或呈旋渦形，或纏繞成繩索狀。究其形成原因，是因?yàn)轳：劢M織中膠原蛋白過度沉積， 膠原蛋白的合成代謝超常持續(xù)進(jìn)行，超過分解代謝的速度，在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，大量形成膠 原纖維最終形成增生瘢痕?；蚬こ淌窃诜肿由飳W(xué)和分子遺傳學(xué)綜合發(fā)展基礎(chǔ)上于本世紀(jì)70年代誕生的 一門嶄新的生物技術(shù)科學(xué)。1989年Fiorentino等發(fā)現(xiàn)小鼠Th2細(xì)胞株產(chǎn)生一種新的細(xì) 胞因子，能抑制Thl細(xì)胞株細(xì)胞因子mRNA的轉(zhuǎn)錄，稱為細(xì)胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibitory factor，CSIF)，同年命名為白細(xì)胞介素 10 (interlenkin 10， IL-10)。人成熟IL-10分子為160氨基酸殘基，分子量18. 7kDa，pI8. 1。白細(xì)胞介素10 (IL-10)是人體多種細(xì)胞產(chǎn)生的重要免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，包括免疫 抑制、抗炎及免疫調(diào)節(jié)特性，主要生物學(xué)功能是限制和終止炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞的 分化和增殖，同時(shí)也具有調(diào)理免疫刺激的特性，清除感染和非感染的顆粒。體內(nèi)外和動(dòng)物實(shí) 驗(yàn)表明IL-I在炎癥、惡變和自身免疫性疾病方面都發(fā)揮了重要功能，在臨床上應(yīng)用于治療 急、慢性炎癥疾病、自身免疫性疾病如炎性腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆病、多發(fā)性硬化癥、 銀屑病等。但針對(duì)增生性瘢痕，目前還沒有有效的解決方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種膠原靶向hIL-10重組蛋白(簡(jiǎn)稱CBD-IL-10)及其臨 床應(yīng)用，該重組蛋白既保持了 hIL-10的生物學(xué)活性，又增加了 hIL-10在體內(nèi)的靶向性，不 僅賦予了該蛋白具有與hIL-10同樣的抗病毒、抗腫瘤以及機(jī)體免疫功能的活性，更為重要 的是其在傷口愈合過程中能夠與膠原特異靶向結(jié)合，從而預(yù)防抑制瘢痕的形成。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為膠原靶向治療增生性瘢痕蛋白藥物 的制備中所采用的一種靶向CBD-IL-10重組蛋白，其氨基酸序列如下所示H2N-Met Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met lie Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp lie Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly lie Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp lie Lys lie Asn Tyr lie Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys lie Arg Gln Gly Gly Gly Gly Ser Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr-COOH,
其中H2N-’代表蛋白質(zhì)氨基端(N末端)，‘-C00H’代表蛋白質(zhì)羧基端(C末端)。上述靶向hIL-10重組蛋白在作為治療增生性瘢痕及瘢痕疙瘩疾病藥物的應(yīng)用。瘢痕組織中膠原蛋白過度沉積，而CBD多肽(TKKTLRT，7肽)能夠特異性結(jié)合膠原 蛋白，是膠原蛋白特異性結(jié)合的多肽序列。將膠原蛋白特異結(jié)合的CBD導(dǎo)向肽與IL-10融合 表達(dá)，既可以降低用藥劑量及治療成本，減輕用藥帶來的毒副作用；同時(shí)更為重要的是在體 內(nèi)能夠使IL-10藥物“靶向”到達(dá)體內(nèi)作用部位而有效發(fā)揮藥理作用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相 比，本發(fā)明通過基因工程手段把hIL-10與膠原特異結(jié)合的CBD多肽在基因水平融合后表達(dá) 的重組蛋白，重組后形成了一種新的蛋白(CBD-IL-10)，并且賦予了該蛋白具有與hIL-10 同樣的抗病毒、抗腫瘤以及機(jī)體免疫功能的活性；更為重要的是CBD-IL-10在傷口愈合過 程中能夠與膠原蛋白特異靶向結(jié)合，從而預(yù)防抑制瘢痕的形成。


圖1是IL-10氨基酸序列序列表。圖2是靶向CBD-IL-10的重組蛋白氨基酸序列表。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過基因工程手段把hIL-10與膠原特異結(jié)合的CBD多肽在基因水平融合 后表達(dá)的重組蛋白(CBD-IL-10)。所述的hIL-10，其氨基酸序列如下
H2N-Met Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met lie Gln Phe Tyr Leu Glu Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp lie Lys Ala His Val Asn Ser Leu Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp lie Lys lie Asn Tyr lie Glu Ala Tyr Met lie Arg Gln-COOH ；
所述膠原特異結(jié)合的CBD導(dǎo)向肽，其氨基酸序列如下 H2N-Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr-C00H，‘&N-，代表蛋白質(zhì)氨基端(N末端)，‘-C00H， 代表蛋白質(zhì)羧基端(C末端)；hIL-10和CBD導(dǎo)向肽之間通過引入Gly Gly Gly Gly Ser柔
Phe Pro Gly Thr Phe Phe Asp Phe Lys Glu Val Met Gly Glu Asn Glu Asn Lys Gly lie Tyr Thr Met Lys性Linker連接，蛋白表達(dá)之后不會(huì)影響各自的結(jié)構(gòu)和功能。融合后的靶向CBD-IL-10的氨基酸序列如下
H2N-Met Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met lie Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp lie Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly lie Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp lie Lys lie Asn Tyr lie Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys lie Arg Gln Gly Gly Gly Gly Ser Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr-COOH, iH2N-'代表蛋 白質(zhì)氨基端(N末端)，‘-C00H’代表蛋白質(zhì)羧基端(C末端)。實(shí)施例1 :CBD-IL_10的表達(dá)、純化及生物學(xué)活性測(cè)定 (一)CBD-IL-10基因的獲得
1.總RNA的提取
人外周血經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗滌2次，重懸于10% RPMI 1640 培養(yǎng)液，加入終濃度為10g/L的ConA，置5% C02培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞。參照RNA 抽提試劑盒的方法，抽提總RNA，_80°C保存?zhèn)溆谩?.總RNA的提取及IL-10 cDNA的擴(kuò)增
用Takara公司RNA提取及反轉(zhuǎn)試劑盒，按說明抽提總RNA，進(jìn)行RT- PCR反應(yīng)總RNA 500ng，5X 逆轉(zhuǎn)錄 Buffer2Pl，oligo dT 0. 5 μ 1,6 mer 0· 5 μ 1，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 0· 5μ1，DEPC 水加至10μ1。37°C溫育30min，后85°C溫育3 min，得到細(xì)胞cDNA。(二)載體的構(gòu)建、表達(dá)及其鑒定 1. /7MD18-T克隆載體的構(gòu)建
按大腸桿菌慣用密碼子設(shè)計(jì)CBD基因序列、引物及相應(yīng)的酶切位點(diǎn)以及Iinker(G4S), 合成如下2條引物Fl、F2。CBD 導(dǎo)向肽氨基酸序列如下H2N-Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr-COOH ； CBD 5' accaaaaaaacccttcgcacc3'；
Fl 5' catatgagcccaggccagggcacccagtctgagaacag3'；
F25' gtcgactcaggtgcgaagggtttttttggtagaaccaccaccaccgtttcgtatcttcattgtcatgt ag3，；
以Fl、F2為引物，以cDNA為模板，隨之按95°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin,30個(gè)循環(huán)后 72°C進(jìn)行延伸12min，得到PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物回收連入/7MD18-T載體，進(jìn)行酶切鑒定和序列測(cè) 定，得到/7MD18T-IL10-CBD重組克隆載體。2. /7ET-IL10-CBD表達(dá)載體的構(gòu)建
測(cè)序正確的PMD18T-IL10-CBD重組克隆載體及原核(+)表達(dá)載體，分別經(jīng) NdeI /MlI雙酶切，回收目的片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，挑取克隆，同樣回收 質(zhì)粒，酶切鑒定，進(jìn)一步經(jīng)測(cè)序鑒定，構(gòu)建成/7ET-IL10-CBD表達(dá)載體的工程菌。3. CBD-IL-10重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)
5上述工程菌/7ET-IL10-CBD/BL21接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過 夜，次日以洲的接種量接種到同樣的培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37°C振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期、培 養(yǎng)液光密度OD6tltl為0. 5^0. 6時(shí)，加入IPTG繼續(xù)培養(yǎng)壙5 hr誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體。4、CBD-IL-10蛋白表達(dá)的檢測(cè)及鑒定
將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體培養(yǎng)物離心，收集菌體，采用12 %的SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物， IPTG誘導(dǎo)者與未誘導(dǎo)者相比，在分子量相應(yīng)處有一條明顯的深染新生蛋白帶，蛋白表達(dá)量 占菌體總蛋白的40%，與預(yù)計(jì)融合蛋白的分子量大小相符。將蛋白從凝膠電轉(zhuǎn)移至PVDF膜 上，常規(guī)Western blot分析，ECL發(fā)光，可見一明顯顯色帶，分子量一致。未誘導(dǎo)菌株，標(biāo)準(zhǔn) 蛋白及表達(dá)菌中其它條帶無陽性反應(yīng)。(三)基因工程菌的培養(yǎng)及高密度發(fā)酵 1. 一級(jí)種子的制備
挑選LB(含氨芐青霉素)平板上的單菌落接種于IOml LB (含氨芐青霉素)液體培養(yǎng) 基中，37°C 200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜。2.發(fā)酵種子液的培養(yǎng)
把一級(jí)種子按洲的接種量接種于適量的改良的LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素) 中，同樣條件下培養(yǎng)菌體的密度至0D_為1. 5-2左右。3、基因工程菌的高密度發(fā)酵
按5%的接種量把發(fā)酵種子液接種于含蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、硫酸銨、硫酸鎂、 磷酸鹽、甘氨酸和甘油等為主要成分的復(fù)合培養(yǎng)基中，攪拌速度為100-800rpm，溶氧控制 在20-40%，溫度為37°C條件下，補(bǔ)料流加至OD6tltl約為30時(shí)，加入終濃度為lmmol / L的 IPTG，再發(fā)酵4hr離心收集菌體。(四)CBD-IL-10融合蛋白的純化 1.融合蛋白的粗提
取誘導(dǎo)表達(dá)的菌體 30g，用 150mL 20mmol/L pH6. 8 的 PB (1. 5mllmol/LMgCl2、 3. 5mgDNaSe，適量EDTA)細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，4°C攪拌裂解!3hr。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢 測(cè)發(fā)現(xiàn)表達(dá)的融合蛋白存在于上清和沉淀中，說明誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白是以可溶性及包涵 體形式存在的。4°C 12000rpm離心15min，收集上清，裝入透析袋，用pH6. 8的10mmol/L的 PB透析M-3^!r，換液2-3次，離心收集上清液。2.包涵體的溶解及復(fù)性
裂菌沉淀IL-10包涵體經(jīng)洗滌、尿素溶解，于4°C在復(fù)性緩沖液的逐漸稀釋下緩慢復(fù)性。3、融合蛋白的純化
取陽離子交換基質(zhì)SP-S印harose Fast Flow裝柱，柱體積5· 4X20cm，用10mmol/L pH6. 8的PB平衡，上樣后用含0. 5 mol/L NaCl的lOmmol/L pH6. 0的PB線性梯度洗脫，收 集主峰即得到融合蛋白。即為CBD-IL-10，氨基酸序列如圖2所示。(五)CBD-IL-10的生物活性測(cè)定
MC/9細(xì)胞來源于小鼠的肥大細(xì)胞，在小鼠IL-4或IL-3以及小鼠IL-10或人IL-10的 協(xié)同刺激下生長(zhǎng)繁殖，且細(xì)胞數(shù)量隨著IL-10濃度的增加而增長(zhǎng)，具體如下
給100μ1 MC/9細(xì)胞QX IO4細(xì)胞/ml)加入小鼠IL-4 20 U、人IL-10標(biāo)準(zhǔn)品2 U或表達(dá)的CBD-IL-10，370C，5%C02孵箱培養(yǎng)72hr，臺(tái)盼藍(lán)染色，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)MC/9活細(xì)胞 數(shù)。根據(jù)細(xì)胞數(shù)量計(jì)算IL-10的活性單位，與對(duì)照組mIL-4、陰性上清液比較差異均無顯著 意義(/7>0. 05)，而IL-10標(biāo)準(zhǔn)品和表達(dá)的CBD-IL-10均能刺激MC/9細(xì)胞的增殖，細(xì)胞數(shù)量 與單抗中和組、陰性對(duì)照組比較差異均有顯著意義(ρ<0· 05)。因此，大腸桿菌表達(dá)的可溶性 和包涵體復(fù)性的IL-10均具有生物學(xué)活性。經(jīng)ELISA定量檢測(cè)及MC/9細(xì)胞的活性分析，粗 制品的可溶性和包涵體復(fù)性IL-10的比活性分別為1. 02X 104U/mg和4. IX 102U/mg。實(shí)施例2 =CBD-IL-IO抑制瘢痕增生試驗(yàn) (一)增生性瘢痕組織
燒傷愈合后3個(gè)月的前臂增生性瘢痕組織(病理證實(shí))，紅色、硬，高出正常皮膚 約4 7 mm。應(yīng)用BALA/c-nu雄性小鼠30只，6 8周齡，體重18 20g。(二)燒傷后增生性瘢痕的動(dòng)物模型的制備
去除增生性瘢痕下脂肪組織，將瘢痕切成6mmX5mmX 3mm大小組織塊，置于預(yù)冷 DMEM (含青霉素、鏈霉素雙抗各100 U/ml)的培養(yǎng)液中，無菌條件下在裸鼠肩胛皮膚作一小 切口，將瘢痕組織小塊移植在皮下，不予縫合。在3 h內(nèi)完成30只動(dòng)物模型。觀察動(dòng)物模 型有無感染、排斥反應(yīng)，選擇穩(wěn)定的瘢痕模型作為治療動(dòng)物使用。瘢痕模型建立20d，此時(shí)增 生性瘢痕血液循環(huán)建立，瘢痕穩(wěn)定。(三)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、hIL-10標(biāo)準(zhǔn)組及CBD-IL-10大劑量治療組、中劑量治療組、小 劑量治療組，裸鼠數(shù)目每組分別為6只，采用瘢痕內(nèi)注射的方法，IL-10為IOyg /ml/次， CBD-IL-10分別為5、10和20 μ g /ml/次，200 μ 1/次，3次/周，總共治療3周；對(duì)照組每 次僅給以PBS，其余相同。停藥3d后取材，用游標(biāo)卡尺直接測(cè)量瘢痕最大徑a和最小徑b換 算成瘢痕體積，公式為V=ab2/2。與對(duì)照組相比，IL-10及CBD-IL-10個(gè)治療組，均能明顯抑 制瘢痕的生長(zhǎng)(如表1. P<0. 05)。表1治療前后瘢痕體積變化(mm3)
權(quán)利要求
1. 一種靶向CBD-IL-10重組蛋白，其氨基酸序列如下所示H2N--MetSerProGlyGlnGlyThrGlnSerGluAsnSerCysThrHisPheProGlyAsnLeuProAsnMetLeuArgAspLeuArgAspAlaPheSerArgValLysThrPhePheGlnMetLysAspGlnLeuAspAsnLeuLeuLeuLysGluSerLeuLeuGluAspPheLysGlyTyrLeuGlyCysGlnAlaLeuSerGluMetlieGlnPheTyrLeuGluGluValMetProGlnAlaGluAsnGlnAspProAsplieLysAlaHisValAsnSerLeuGlyGluAsnLeuLysThrLeuArgLeuArgLeuArgArgCysHisArgPheLeuProCysGluAsnLysSerLysAlaValGluGlnValLysAsnAlaPheAsnLysLeuGlnGluLysGlylieTyrLysAlaMetSerGluPheAsplieLyslieAsnTyrlieGluAlaTyrMetThrMetLyslie Arg Gln Gly Gly Gly Gly Ser Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr-COOH,其中H2N-’代表蛋白質(zhì)氨基端(N末端)，‘-C00H’代表蛋白質(zhì)羧基端(C末端)。
2.權(quán)利要求1所述的靶向CBD-hIL-10重組蛋白在作為治療增生性瘢痕及瘢痕疙瘩疾 病藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程領(lǐng)域，涉及靶向hIL-10的重組蛋白及其應(yīng)用。本發(fā)明重組蛋白是由人白細(xì)胞介素10(humaninterlenkin10,hIL-10)與膠原特異結(jié)合的CBD多肽在基因水平融合后表達(dá)的重組蛋白，重組后形成了一種新的蛋白。該蛋白具有與hIL-10同樣的抗病毒、抗腫瘤以及機(jī)體免疫功能的活性；更為重要的是CBD-IL-10在傷口愈合過程中能夠與膠原特異靶向結(jié)合，作為治療增生性瘢痕及瘢痕疙瘩疾病藥物的應(yīng)用中，可預(yù)防抑制瘢痕的形成。
文檔編號(hào)A61P17/02GK102115495SQ20101060435
公開日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者張戰(zhàn)風(fēng), 朱雄翔, 湯朝武, 白曉智, 石繼紅, 胡大海, 董茂龍, 韓軍濤 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)