專利名稱：以中藥材為主原料制備基因工程多肽藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用基因工程重組、克隆技術(shù)生產(chǎn)具有中藥的安全性，西藥的高效性和生物醫(yī)藥的活性的基因工程多肽藥物。特別是涉及到一種免疫調(diào)節(jié)劑、免疫再生劑，以及通過基因重組、克隆方法生產(chǎn)抗艾滋病藥物的技術(shù)。
據(jù)WHO公布的數(shù)字表明，全世界HIV陽性帶毒人數(shù)已達(dá)6仟萬人，死亡人數(shù)超過3佰萬人，其中2仟萬人在充分表現(xiàn)出艾滋病病兆；其中中國艾滋病人有168人，香港有422人。西藥AZT自1985年推出之后，現(xiàn)已不能奏效，HIV已表現(xiàn)出明顯的抗藥性；中藥由于受到傳統(tǒng)工藝的束縛，雖然理論上分析覺得有把握攻克HIV，實(shí)際上沒有一類能起作用。因此說，GGA基因工程多肽藥物的研制開發(fā)，無論從制藥工業(yè)或從治病療效來說，都具有重大的現(xiàn)實(shí)意義和深遠(yuǎn)的時(shí)代意義。
本世紀(jì)下半葉以來，由于生物學(xué)科的突飛猛進(jìn)及生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、有機(jī)化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、DNA重組技術(shù)及單克隆抗體技術(shù)等的發(fā)展和相互滲透的縱橫深入，使醫(yī)學(xué)科學(xué)步入其發(fā)展以來最令人振奮的時(shí)期；生物技術(shù)在藥物合成和新藥研究中的應(yīng)用越來越廣泛；抗生素、維生素、氨基酸、激素和核苷酸等微生物轉(zhuǎn)化機(jī)理及其藥物合成中的應(yīng)用，藥用酶和酶抑制劑的研制，免疫學(xué)基本原理及生物制品和單克隆抗體診斷試劑的研究，基因重組以及基因工程活性蛋白的多肽藥物的應(yīng)用范圍日漸擴(kuò)大，使許多疾病的治療更趨合理。但是，生物技術(shù)體系的五大方面(即基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程和生化反應(yīng)器工程)在農(nóng)業(yè)方面的開發(fā)利用雖然比較成功，在分子水平、細(xì)胞水平、組織水平與個(gè)體水平上對(duì)生命有機(jī)體進(jìn)行不同層次的定向設(shè)計(jì)、創(chuàng)造、組建具有人類所需性狀的新物種或新品系方面雖然也比較成功，但是在制藥工業(yè)上的應(yīng)用卻僅僅是開始，而且僅局限在牛生長激素、幼畜腹瀉疫苗、人胰島素、人干攏素、淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)、酶固定化技術(shù)與酶分子改進(jìn)修飾技術(shù)等方面；這些方面投資大，周期長，對(duì)人員和設(shè)備要求高，不便于推廣應(yīng)用。尤其是生物技術(shù)在制藥工業(yè)上的廣泛利用、推廣還是一個(gè)空白。生物技術(shù)如何以生物系統(tǒng)為對(duì)象，尤其是以中藥材為對(duì)象，生物反應(yīng)在常溫常壓下快速連續(xù)進(jìn)行，不生產(chǎn)任何無用多余產(chǎn)物，顯著節(jié)約能耗與原料，縮短生產(chǎn)周期，減少環(huán)境污染，開辟一條生產(chǎn)純度高、成本低、安全有效的生物制品或多肽藥品生產(chǎn)的新途徑，是當(dāng)代制藥工業(yè)面臨的共同課題。更何況利用基因工程重組、克隆技術(shù)改造中藥制藥工業(yè)，至今還未見任何報(bào)導(dǎo)。
本發(fā)明的目的在于提供一種利用中藥材、真菌與細(xì)菌雜交形成的新的微生物基因的質(zhì)粒DNA和動(dòng)植物細(xì)胞經(jīng)基因工程重組、克隆的方法生產(chǎn)的基因工程多肽藥物。這種基因工程多肽藥物的營養(yǎng)指數(shù)可以達(dá)到甚至超過屹今為止所有同類藥品的營養(yǎng)指數(shù)，并有最佳的性能價(jià)格比。
本發(fā)明所說的中藥材指的是中國《本草綱目》所載的中藥材、草藥、動(dòng)物、植物、菌類、海藻類、礦物等為主原料，配備其它有核細(xì)胞為材料，經(jīng)基因工程重組、克隆工藝精制而成的一種中藥西化生物藥品。
本發(fā)明所說的多酶反應(yīng)體系，指的是纖維素酶、真菌蛋白酶、葡萄糖異構(gòu)酶和淀粉酶的固定化聚合反應(yīng)體。
本發(fā)明制備工藝原理是把培養(yǎng)基中中藥材細(xì)胞的有效成份，通過多酶反應(yīng)體系的酵解，將大分子的纖維素、木質(zhì)素降解為小分子的營養(yǎng)代謝物質(zhì)，如多糖類、氨基酸、膽堿、纖維素等與動(dòng)物肝臟或胰臟或脾臟等有核細(xì)胞的DNA(或RNA)、在載體質(zhì)粒DNA的作用下進(jìn)行重組，基因與載體連接的末端比例為3∶1到10∶1之間，然后進(jìn)行脈沖場電泳使活性細(xì)胞增殖，然后進(jìn)行克隆。最終產(chǎn)生基因工程多肽藥物。這種新型的技術(shù)路線和方法能夠使絕大部分的保留培養(yǎng)基中中草藥材的有效成份，如組方中的黃芪素保存率可達(dá)80％-88％，比傳統(tǒng)工藝提高4-5倍。通過基因工程處理后，藥物的分子結(jié)構(gòu)起了根本改變、小分子蛋白、游離氨基酸、亞麻酸及多肽等生物活性物含量大大增多，對(duì)阻止艾滋病病毒以逆轉(zhuǎn)錄形式形成DNA，整合人細(xì)胞有顯著效果，對(duì)攻克艾滋病提供了有效的途徑。
按照本發(fā)明的目的，發(fā)明人公開的以中藥材為主原料制備基因工程多肽藥物的方法，是以70-90％的中藥材，3-7％鴨髓核苷酸溶液，0.1-2.0％的有核細(xì)胞DNA或RNA提取物，0.1-1.0％質(zhì)粒DNA提取液等組成，以及3-10％的酵母提取物和產(chǎn)酶促進(jìn)劑。以上各組份含量均以重量百分比計(jì)算，上述的酵母提取物可以是啤酒醇母也可以是酵母膏。上述的產(chǎn)酶促進(jìn)劑可以是蛋白胨、瓊脂等產(chǎn)酶促進(jìn)劑，也可以是吐溫80。根據(jù)各種主原料的營養(yǎng)成份不同，治病功效的要求可以選用不同的酵母、產(chǎn)酶促進(jìn)劑。
制備本發(fā)明所述的基因工程多肽藥物的技術(shù)方案如下1、基因工程菌的培養(yǎng)將含有天然質(zhì)粒的乳酸桿菌置于含氯霉素的肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，離心收集的細(xì)胞懸浮于TE中，再次離心收集的細(xì)胞，重懸于由TES、CTE，蔗糖組成的溶液中，勻漿后獲得懸浮液，將懸浮液細(xì)胞裂解后，離心、收集上清，加入CsCL和溴化乙錠離心。
將乳酸桿菌DNA轉(zhuǎn)化香菇菌，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鋪在含氯霉素的平板上。
2、鴨髓核苷酸的制備將新鮮鴨骨頭破碎，取鴨髓，用乙酸浸泡，取溶液加入三氯乙酸進(jìn)行沉淀，用吸管頭將絮狀物挑出，在75％乙酸中洗滌兩次，加入2倍7.5％濃度的醋酸氨，然后用鹽析法提純多核苷酸溶液。
3、中草藥有效成分的提取將人參、生黃芪、白術(shù)、麥冬、五味子等中草藥原材料預(yù)處理，120目粉碎，加酶攪拌，固體發(fā)酵，礦泉水浸泡，離心，取上清加甘油(待用)。
4、動(dòng)物肝臟或胰臟、脾臟DNA的制備取動(dòng)物肝臟或胰臟或脾臟進(jìn)行預(yù)處理，存放在-20℃--80℃冰箱中，啟用時(shí)切下2克量進(jìn)行勻漿破碎，離心，取上清液，加異戊醇，10分鐘后離心，取上清液，置于零下20℃待用。
5、基因工程多肽藥物的配制取70％-90％總量的步驟3的待用物，3-7％重量的步驟2獲得的溶液，和0.1-2％步驟4的待用物混勻，加入0.1-1.0％步驟1的產(chǎn)物，加入0.6％-6％連接緩沖液Tris-Hcl，牛血清白蛋白，凝膠電泳，加入堿性磷酸酶處理1小時(shí)，加入0.1％-1％啤灑酵母的紅色菌落，調(diào)PH5.8，加入2％蛋白胨，2％D-葡萄糖，2％瓊脂，電泳、再加入真菌蛋白酶，檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖，礦泉水，電泳、收集產(chǎn)品，加50％甘油，冷凍烘干，裝膠囊。
藥效分析用上述實(shí)施例制備的基因工程多肽藥物(GGA-IK)對(duì)病毒具有強(qiáng)烈的殺滅作用，且無抗藥性、無毒副作用。從1986年3月到1998年5月研究過程中所提供的臨床實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下(1)小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。24小時(shí)之內(nèi)分別給每只小鼠灌服GGA-IK混懸液3×5000mg/kg后，7天內(nèi)未見死亡。給藥后8天活殺，尸檢未見心、肝、肺等主要臟器有肉眼可見的病理變化。
(2)大鼠長期毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)大鼠給藥后的生態(tài)行為和外觀均無異常，經(jīng)體重測定實(shí)驗(yàn)組和給藥組均無明顯差異。給藥過程中測定動(dòng)物的外周血血象及凝血時(shí)間，血液生化指標(biāo)，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組和給藥組均無明顯異常，無明顯不良影響?；顨⒔馄?，未見明顯毒性損傷，胸腺增長異?；钴S。結(jié)果說明GGA-IK屬無毒物質(zhì)。
(3)基因工程多肽是由天然中藥材通過基因工程方法制備而成的純天然制品，服用后能增加機(jī)體的免疫功能，以玫瑰花環(huán)和3H-TdR等免疫理學(xué)測定服藥前后機(jī)體的免疫功能指標(biāo)，說明能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的生成，活化體內(nèi)NK-殺傷細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)促進(jìn)IL-2的生成，改善乙肝臨床癥狀。
(4)肝癌病人用本發(fā)明藥物前后，以酶免疫法測定病人體機(jī)T-Ea％(淋巴細(xì)胞活性)，同時(shí)測定機(jī)體的CY-TOXI(細(xì)胞毒殺傷指數(shù))，結(jié)果表明，服藥后，機(jī)體殺滅癌細(xì)胞能力增強(qiáng)。
(5)乙肝患者服用本發(fā)明藥物后，乙肝表面或核心抗原的檢出水平均有較大程度的緩和，有的病人已轉(zhuǎn)陰。證明GGA不但可以改善患者臨床癥狀，而且對(duì)體內(nèi)病毒有著良好的抑制作用。
(6)本發(fā)明藥物對(duì)人體各種臨床虛癥的作用是頭暈有效率89.29％，易疲勞有效率64.29％，食欲不佳有效率85.71％，睡眠不佳有效率75％。
效益分析本發(fā)明所制備的基因工程藥物具有很高的經(jīng)濟(jì)效益。
目前，艾滋病患者打一針美國產(chǎn)或法國產(chǎn)的疫苗，需花費(fèi)250-280USD，每日一針，一個(gè)月需用掉7500-1萬USD，一年十幾萬美元。
本發(fā)明藥物以驗(yàn)方投料1000g制成1萬粒成品軟膠囊，量每粒膠囊100mg；本發(fā)明藥物患者日服七次(早晚空腹，三餐飯后，上午930與下午330，每瓶50粒裝，每次服用2粒，每天服用14粒，大約需210元人民幣；一個(gè)月6300元人民幣，約742USD，一年只需8904USD。
投次一個(gè)年產(chǎn)50噸的艾克鎮(zhèn)(本發(fā)明藥物名)生產(chǎn)廠，其成本效益如下(1)廠房660m2；(租金10萬元人民幣1年)(2)酶生產(chǎn)線(中國產(chǎn))80萬元人民幣(3)基因工程藥生產(chǎn)線(中國產(chǎn))180萬人民幣(4)申報(bào)藥準(zhǔn)號(hào)150萬人民幣(5)職工、高級(jí)人才6人，中級(jí)人才12，初級(jí)人才24人，其他人才8人，共50人。
其他費(fèi)用100萬元人民幣共投資600萬-800萬元人民幣效益分析年產(chǎn)50噸(10萬kg)每瓶100粒(10g/瓶)，1000萬瓶，每瓶成本按50元人民幣計(jì)算，出廠價(jià)按250元計(jì)算，利潤200萬/瓶，一年利潤10億元人民幣。
實(shí)施例1艾克鎮(zhèn)(本發(fā)明藥物名稱)基因工程多肽藥物的制備1、基因工程菌的培養(yǎng)(乳酸桿菌質(zhì)粒DNA的制備)將攜帶天然質(zhì)粒的乳酸桿菌菌株VSP863(從福建師范大學(xué)生物工程研究院，福建省三明真菌研究所，福建農(nóng)業(yè)大學(xué)菌草研究所等單位購買，于1998年10月7日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO.0364分類命名乳酸桿菌VSP836 LactobacillusSP.)于1升含有5-8克氯霉素的培養(yǎng)基中37℃溫度培養(yǎng)過夜；培養(yǎng)基由蛋白胨20g、酵母膏5g、NaCL10g、礦泉水975ml組成。PH5.8。通過10000×g，溫度30-37℃，離心15分鐘收集細(xì)胞，并重新懸浮于10ml冷卻的TE(10mM Tris-Hcl PH5.5，1mM EDTA)中，再次離心收集細(xì)胞，重新懸浮于4ml[TES(25％鹽酸葡萄糖溶液)1ml，CTE(25％異丙醇葡萄糖溶液)1ml，25％W/V蔗糖1ml以及1ml蒸餾水]的溶液中。通過渦旋攪拌而勻漿。樣品保持于冰上進(jìn)行下述步驟；向細(xì)胞懸浮液中加入1ml溶菌酶(10mg/ml)，保溫5分鐘，再加入2m10.5M EDTA(PH6.0)，保溫10分鐘后加入50ml真菌蛋白酶K(40mg/ml)，10分鐘后再加入15ml裂解緩沖液(0.1％Triton×100，1mM EDTA，50mMTris-Hcl PH6.0)。裂解15-20分鐘，將乳酸桿菌裂解，徑真菌蛋白酶消化過的產(chǎn)物于35,000×g離心90-120分鐘。將上清液(19.8ml)移至裝有20mg CsCL和400ul溴化乙錠(10mg/ml)的塑料管中。溶解后，將混合物分置于兩個(gè)晶形塑料超離心管中，熱密封，用BeckmanTi 65轉(zhuǎn)。離心15分鐘，收集沉淀。
用一小環(huán)香菇菌細(xì)胞接種200ml無菌肉湯培養(yǎng)基，在37℃振蕩培養(yǎng)，直至OD600達(dá)到約0.5。將培養(yǎng)物置冰上10分鐘，再以6000×g離心10分鐘。將細(xì)胞沉淀物重新懸浮于100ml冰冷的0.1M MgCL2中，置冰上保持30-40分鐘再次離心。沉淀物重新懸浮于2ml冰冷0.1M輕石蠟油中，移至無菌試管內(nèi)在冰上保溫24小時(shí)。然后將感受態(tài)細(xì)胞分成等份，貯存于-70℃。
取一份冷凍感受態(tài)細(xì)胞，置冰上解凍，將0.1-1μg乳酸桿菌質(zhì)粒DNA加至50μg細(xì)胞中，將混合物在冰上保溫30分鐘。將試管從冰上移至42℃水浴中保溫2分鐘，加入1ml肉湯培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)化混合物在所需的溫度37℃振蕩培養(yǎng)120分鐘。然后將1/10的轉(zhuǎn)化混合物鋪在含有0.5-0.8％氯霉素的平板上，培養(yǎng)基是肉湯培養(yǎng)基，由蛋白胨0.01％、酵母膏0.005％、NaCL0.01％、礦泉水0.975％組成。在30-37℃培養(yǎng)28小時(shí)，培養(yǎng)產(chǎn)物為乳酸桿菌質(zhì)粒DNA。
2、鴨髓核苷酸的制備。
取新鮮鴨骨頭用(大連生產(chǎn)的)超速粉碎機(jī)破碎，然后浸泡在1升75％濃度乙醇中，過濾、去渣、取溶液，在鴨髓溶液中加入10％(100ml)三氯乙酸沉淀12小時(shí)，37℃，用吸管頭將絮狀物挑出，在75％乙醇中沉淀兩次，然后將團(tuán)塊涼干。將涼干的團(tuán)塊置入2倍量的7.5％濃度的醋酸氨溶液中8小時(shí)，然后用鹽析法提純?nèi)芤?。置?20℃的冰箱中待用。
3、艾克鎮(zhèn)組方有效成分的提取。
人參45g 生黃芪250g 白術(shù)90g 麥冬90g 五味子36g 防風(fēng)54g 柴胡54g 大青葉135g 青黛27g 蟬蛻27g 薄荷36g 香菇100g 昆布56g組成1kg量，漂洗，曬干，120日粉碎，在乳酸中浸泡8小時(shí)，然后加酶(纖維素酶0.1g，葡萄糖異構(gòu)酶0.2g，真菌蛋白酶0.1g，淀粉酶0.1g)溶液，攪拌15分鐘，PH5.2-6.2；溫度30℃-37℃，固體發(fā)酵72小時(shí)，用礦泉水浸泡8小時(shí)，板框過濾，去渣。10,000×g離心，取上清液加甘油，置-4℃冰箱備用。
4、動(dòng)物肝臟或胰臟、脾臟DNA制備。
取動(dòng)物肝臟(新鮮)500g，破碎，勻漿，用95％乙醇洗滌；將漿液置于1升異戊醇中8小時(shí)浸泡，過濾，取上清液，10,000×g離心15分鐘，溫度30℃-37℃，上清液置于-20℃保存待用。
綜合工藝取1公升艾克鎮(zhèn)溶液，加入40-80ml鴨髓多核苷酸溶液，加入上述步驟4的產(chǎn)物10-40ml，在攪拌器中均勻攪拌10分鐘。置于2立升的發(fā)酵罐中，加入乳酸桿菌質(zhì)粒DNA溶液1-2ml，發(fā)酵28小時(shí)，PH5.2-6.8，溫度30-37℃，加入0.6％-6％連接緩沖液，連接反應(yīng)在15℃進(jìn)行16-18小時(shí)，連接緩沖液含有200ml/L Tris.Hcl(PH5.6)、50ml/L MgCL2，50ml/L二硫蘇糖醇，0.5ml/L牛血清白蛋白。然后進(jìn)行凝膠電泳，使凝膠在65℃溶化，然后將溫度降至37℃，將含有DNA的凝膠置于反應(yīng)管中，在室溫下加入0.5ml-50ml/l的堿性磷酸酶，反應(yīng)體積掌握在50ml，反應(yīng)時(shí)間1小時(shí)，溫度掌握在37℃。
在反應(yīng)液中加入含有紅色菌落的啤灑酵母，PH5.8，加的量為反應(yīng)液的1％，再加2％蛋白胨，加2％D-葡萄糖，加2％瓊脂。向該反應(yīng)液中，加入0.2體積的緩沖液(40mMTris-HCL，40mM硼酸，10mM乙酸)，然后在40-50V脈沖電泳儀的泳道中進(jìn)行，PH5.8，進(jìn)行脈沖電泳1小時(shí)，溫度37℃；然后加入真菌蛋白酶20mg/L、檸檬酸0.48g/L、檸檬酸納1.32g/L、葡萄糖1.42g/L、礦泉水10ml/L，反應(yīng)時(shí)間18小時(shí)，溫度37℃。待固化后移入電泳槽，電壓160V，時(shí)間1小時(shí)。將上述步驟所得的產(chǎn)物，從電泳槽中取出，即是艾克鎮(zhèn)基因工程多肽藥物。加50％甘油，冷凍干燥，裝膠囊，進(jìn)庫。
實(shí)施例2艾克鎮(zhèn)毒理、病理研究(一)、小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果1987年3月，在福州市傳染病醫(yī)院檢驗(yàn)科，由羅亦松書記、馬翰高付院長批準(zhǔn)，選用昆明種小白鼠，合格證1986 NO 00064C，雌性小鼠體重18±3g，雄性小鼠體重20±2g，日齡60天。
24小時(shí)之內(nèi)分別給每只小鼠灌服艾克鎮(zhèn)混懸液3×5000mg/kg后，7天內(nèi)未見死亡。給藥后8天活殺，尸檢未見心、肝、肺等主要臟器有肉眼可見的病理變化。
艾克鎮(zhèn)對(duì)小鼠急性毒性的限度試驗(yàn)
該給藥劑量15000mg/kg，是人口服量大劑量的4514倍(成人口服劑量108-216mg/天，體重為65kg)?？梢娫撍師o明顯的毒副作用，使用安全。
(二)、大鼠長期毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果1987年5月-9月，在福州市傳染病醫(yī)院檢驗(yàn)科，選用昆明種大鼠，日齡45天，雌雄各半。口服(灌胃)給藥，劑量分別為40、200、400mg/kg(為人用劑量的10、50、100倍)。每組動(dòng)物8只，四組共32只，給藥后每15天測定一次各項(xiàng)指標(biāo)，2個(gè)月后活殺一半，4個(gè)月活殺觀察。
1.實(shí)驗(yàn)大鼠給藥后的生態(tài)行為和外觀均無異常。經(jīng)體重測定實(shí)驗(yàn)組和給藥組均無明顯差異。
2.給藥過程中測定動(dòng)物的外周血血象(白細(xì)胞總數(shù)及分類Pt、Hb)及凝血時(shí)間、血液生化指標(biāo)(AST、ALT、ALP、BUN、TP、ALB、GLU、TBIL、Cr和TC)，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組和給藥組均無明顯異常，無明顯不良影響。
3.活殺解剖，取心、肝、肺、腎、胸腺、腦、胸骨、胃、腸、睪丸、卵巢等組織的病理組織學(xué)觀察(觀察人員為福州市傳染病院病理室郭錫遴先生)，實(shí)驗(yàn)組和給藥組動(dòng)物相比，未見明顯的毒性損傷，200mg/kg組胸腺增生異?；钴S。
以上結(jié)果說明艾克鎮(zhèn)屬無毒物質(zhì)。
(三)、艾克鎮(zhèn)的臨床試用小結(jié)艾克鎮(zhèn)是由食用菌、海藻類和中草藥酶解發(fā)酵而成的純天然制品，服用后能增加機(jī)體的免疫功能，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的生成，活化體內(nèi)NK-殺傷細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)促進(jìn)IL-2的生成，改善各種臨床癥狀，尤其是改善乙肝臨床癥狀。從而證明，艾克鎮(zhèn)依據(jù)中醫(yī)理論的辯證論治，從整人上可以有效地作用于各種病毒及病原體?，F(xiàn)將臨床試用結(jié)果分述如下1、艾克鎮(zhèn)對(duì)乙肝病人免疫功能的作用及對(duì)老齡性免疫功能低下的作用在福建省煤炭療養(yǎng)院，1994年2月-1994年7月，前后半年觀察，主持觀察人員楊光楷付主任醫(yī)師。給乙肝病人日服3次，每次3-5粒，相當(dāng)于含有效成份1-1.5g，連服三個(gè)月，給65歲以上老年人日服2次，每次2-3粒，相當(dāng)于含有效成份600-900mg，連服一個(gè)月。以玫瑰花環(huán)和3H-TdR等免疫藥理學(xué)方法測定服藥前后機(jī)體的免疫功能指標(biāo)，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，以雙盲法進(jìn)行臨床試用，其測定結(jié)果如下表1艾克鎮(zhèn)對(duì)乙肝病人T淋巴細(xì)胞亞群的影響
表2艾克鎮(zhèn)對(duì)老齡性免疫功能低下的作用
各組P值皆＜0.052.艾克鎮(zhèn)對(duì)肝癌患者NK-殺傷細(xì)胞活性的影響在北京中國中醫(yī)藥大學(xué)，時(shí)間1996年1月-6月；主持人邊同華教授。肝癌病人服用艾克鎮(zhèn)前后，以酶免疫法測定病人機(jī)體T-Ea％(淋巴細(xì)胞活性)，同時(shí)測定機(jī)體的Cy-TOXI(細(xì)胞毒殺傷指數(shù))，指數(shù)愈高，說明機(jī)體殺滅癌細(xì)胞能力愈強(qiáng)。其測定結(jié)果如表3表3肝癌病人服藥前后測定結(jié)果
上述結(jié)果說明，肝癌患者服用艾克鎮(zhèn)之后，機(jī)體免疫功能均有所提高，而機(jī)體的抗病毒能力也有所加強(qiáng)。因此，說明服用艾克鎮(zhèn)不但對(duì)改善臨床癥狀有效，而且對(duì)肝癌細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生良好的直接攻擊作用。
3、艾克鎮(zhèn)對(duì)乙型肝炎病毒標(biāo)志轉(zhuǎn)陰的作用時(shí)間1995年8月-1996年7月；地點(diǎn)香港英皇道英皇中心保生醫(yī)療中心；主持人；吳志勇中醫(yī)師。乙肝患者服用艾克鎮(zhèn)后，測定服藥前后患者的HBSAG和HBEAG，同時(shí)測定患者機(jī)體的免疫功能指標(biāo)(T-Ea％)，結(jié)果見表4
表4說明，乙肝患者服用艾克鎮(zhèn)后，機(jī)體免疫功能均提高，乙肝的表面或核心抗原的檢出水平均有較大程度的緩和，有的病人已轉(zhuǎn)陰。證明艾克鎮(zhèn)不但可以改善患者臨床癥狀，而且對(duì)體內(nèi)病毒有著良好的抑制作用。
4、艾克鎮(zhèn)對(duì)艾滋病病人免疫指標(biāo)的影響和對(duì)機(jī)體P-24抗體的作用艾滋病病毒含有P-24抗原，而P-24抗體則是專一的艾滋病檢測指標(biāo)，不同患者P-24抗體的測值浮動(dòng)很大，只能采用自身比較，此指標(biāo)反映了體內(nèi)艾滋病毒的情況，有重大的臨床意義。由于在中國很難找到艾滋病患者，目前也沒有相應(yīng)的檢測手段和觀察條件；因此，對(duì)艾滋病人評(píng)價(jià)艾克鎮(zhèn)的工作上只能委托美國華盛頓現(xiàn)代中醫(yī)藥研究中心協(xié)助進(jìn)行，其測試結(jié)果是96年3月18日收到的傳真記錄，見表5、6
由表5結(jié)果看出，服藥后3例艾滋病人中T-4淋巴細(xì)胞百分率均升高，足以說明艾克鎮(zhèn)有效。
經(jīng)檢索，國際上未見到對(duì)艾滋病人P-24抗體的有效藥物，即使是AzT、ddI、ddc和d4T艾滋病人服用后，其P-24抗體也未見到改善。而服用艾克鎮(zhèn)的病人的P-24抗體測值呈現(xiàn)出升高的現(xiàn)象。
5、艾克鎮(zhèn)對(duì)人體各種臨床虛癥的作用受試者有臺(tái)灣、印尼、香港、福建、北京患者，收集112例，服用艾克鎮(zhèn)觀察其臨床效果，對(duì)頭暈、易疲勞、食欲不振、睡眠不佳等癥狀的作用，其結(jié)果見表7。
綜上所述，說明艾克鎮(zhèn)給治療艾滋病增添了希望。
權(quán)利要求
1.一種基因工程多肽藥物的制備方法，該方法包括下列步驟(1)從含有天然質(zhì)粒的乳酸桿菌菌株提取質(zhì)粒DNA，用該質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化香菇菌，重新提取質(zhì)粒DNA；(2)取新鮮鴨髓，制備鴨髓核苷酸；(3)將中草藥原材料預(yù)處理，粉碎，加酶、發(fā)酵，離心取上清；(4)制備動(dòng)物肝臟或胰臟、脾臟DNA；(5)將總量為70-90％的步驟(3)產(chǎn)物，3-7％重量的步驟(2)獲得的溶液，和0.1-2％重量的步驟(4)的產(chǎn)物混勻，加入步驟1的產(chǎn)物，加連接緩沖液和牛血清白蛋白進(jìn)行凝膠電泳，加堿性磷酸酶處理，加入啤灑酵母菌落，進(jìn)行脈沖電泳1小時(shí)，然后加入真菌蛋白酶，待固化后再次電泳，收集產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(3)所述中草藥原材料包括(每千克含有)人參45克，生黃芪250克，白術(shù)90克，麥冬90克，五味子36克，防風(fēng)54克，柴胡54克，大青葉135克，青黛27克，蟬蛻27克，薄荷36克，香菇100克，昆布56克。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的制備方法，其特征在于步驟(5)中加入步驟(1)的產(chǎn)物后發(fā)酵28小時(shí)，溫度30-37℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(5)中加入啤灑酵母的量為反應(yīng)液的1％，同時(shí)還加入2％蛋白胨，加2％D-葡萄糖，2％瓊脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(5)中加入真菌蛋白酶后還加入檸檬酸，檸檬酸鈉，葡萄糖，礦泉水反應(yīng)18小時(shí)，溫度37℃，然后再次脈沖電泳。
6.權(quán)利要求1-5所述方法獲得的產(chǎn)物。
全文摘要
一種基因工程多肽藥物,它是以改造過的中醫(yī)藥驗(yàn)方,秘方為基礎(chǔ),以中藥材動(dòng)植物細(xì)胞為主要原料,通過建立基因庫,DNA、RNA的提取、大腸桿菌或雙歧桿菌或乳酸桿菌與真菌雜交形成的新的微生物基因的質(zhì)粒DNA的提取,進(jìn)行重組,克隆制備而成的基因工程多肽藥物。這種基因工程多肽藥物不但具有生物活性,而且其小分子蛋白保持原有的抗原性。這種多肽藥物不但含有38%以上的活性多糖,而且還含有6%以上的亞麻酸,14%以上的小分子蛋白和游離氨基酸。本品是一種療效很高、營養(yǎng)價(jià)值很高的免疫調(diào)節(jié)劑或免疫再生劑,它對(duì)治療艾滋病1期—5期具有顯著療效。
文檔編號(hào)A61K38/02GK1250667SQ9812009
公開日2000年4月19日 申請(qǐng)日期1998年10月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月8日
發(fā)明者林陸山 申請(qǐng)人:林陸山, 吳志誠, 張園, 吳志勇, 梅凱