專利名稱：用胸腺素β4治療大皰性表皮松解癥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治愈或預(yù)防由大皰性表皮松解癥及其所有亞型引起的皮膚和周圍組織的退化性、免疫性炎癥和其它紊亂癥狀。
2.背景技術(shù)詳述大皰性表皮松解癥(EB)是一種罕見的基因紊亂疾病，它發(fā)生在所有的人種中。EB作為一類疾病，表現(xiàn)為皮膚表面的一個很小的創(chuàng)傷就會引起水泡，導致開放性瘡傷、潰瘍和結(jié)疤。這類疾病的嚴重程度不同，從輕微性到嚴重性的殘廢、毀傷以及有生命危險的皮膚疾病。與燒傷不同，這些痛苦有些時候永遠不會消失。最嚴重的情況下，需要很大程度的調(diào)整生活方式。受這類疾病折磨的小孩永遠都不能騎自行車，也不能滑雪和參加運動，因為小孩的正常運動會導致慢性疼痛。這類疼痛的覆蓋范圍是小孩身體的75％。水泡和結(jié)疤也會發(fā)生在嘴和食道處。因此，只能經(jīng)常吃一些流質(zhì)和軟的食物。結(jié)疤也會引起手指和腳趾的融合，導致畸形，嚴重影響機體功能。病人的大部分生活都是在醫(yī)院中接受治療，輸血、活組織切片檢查和手術(shù)治療。病人的眼睛也經(jīng)常起水泡，幾天看不見光。慢性貧血使得機體能量缺失，發(fā)育遲緩?；加蠩B后，患者存活一般不超過30年。
EB有三種主要類型單純型EB、營養(yǎng)失調(diào)型EB(顯形的或隱性的)和接合型EB。各類型表現(xiàn)不同嚴重程度的癥狀。一般來說，EB引起的水泡可限制在特定的部位，例如手或腳，或者在身體更大的部位。較輕微的水泡會正常治愈，在皮膚上不會留下永久的損傷。非輕微型水泡治愈時會留下疤痕，導致皮膚永久性的變化，例如手指融合和手縮短，運動功能減弱。一些接合型EB在幼年時會有生命危險。
EB是由皮膚的生理、生化和免疫特性的有害變化所致。所有類型的EB都是遺傳性的，并且現(xiàn)在已經(jīng)知道幾種導致疾病的不同亞型基因?；蛉毕菔沟闷つw層彼此不能有效粘附，產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)脆弱的區(qū)域。脆弱的皮膚尤其易受輕微摩擦的損傷，所引起的癥狀的特點就是產(chǎn)生了水泡。皮膚是感染的一個重要屏障，它是免疫系統(tǒng)的第一道防線。那些受EB侵害的脆弱的皮膚則失去了這一重要的防御機能。脈管系統(tǒng)的這些變化降低了修復損傷的能力，增加了皮膚癌發(fā)生的可能，例如扁平細胞癌，并且增加了受感染的幾率。此外，口腔和消化腔的開放性瘡傷會導致脫水和營養(yǎng)不良。
有許多治療EB的嘗試，但是沒有一種方法對預(yù)防和治療EB有實質(zhì)性的效果。各種生長因子，合成皮膚，抗生素和其它治療都不能有效、充分地治療EB。盡管EB是一種遺傳疾病，然而能使傷口快速和更好治愈的治療方法將是極其重要的。而且，預(yù)防性治療也能明顯給患者帶來實質(zhì)性的好處，并且還可能提高壽命。
各種藥品、營養(yǎng)品或化妝品的配方已被提議用來減輕或逆轉(zhuǎn)EB或其導致的困擾。
在該領(lǐng)域，一直希望找到一種更好的方法和物質(zhì)來治療或預(yù)防與EB相關(guān)的水泡和傷口。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種促進愈合或預(yù)防與EB相關(guān)的水泡、瘡傷或皮膚惡變的治療方法，包括給予需要這種治療的患者施用有效量的組合物，該組合物包含一種能抑制EB的多肽，其中該多肽包含有序列LKKTET或者具有EB抑制能力的該序列的保守突變體。
發(fā)明詳述本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)了鰲合肌動蛋白的肽，例如胸腺素β4(Tβ4)和其它鰲合肌動蛋白的肽，或含有氨基酸序列LKKTET或其保守突變體序列的肽片段，這些肽能夠促進與EB相關(guān)的水泡、瘡傷和皮膚惡變的治愈和預(yù)防。本發(fā)明的肽可以是N-或C-末端突變體，例如KLKKTET和LKKTETQ。盡管EB是一種遺傳缺陷性疾病，不限于任何特定的理論，這些肽可能具有促進修復、愈合和預(yù)防的能力，它們具有誘導末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(一種非模板控制的DNA聚合酶)、降低一個或多個炎癥細胞因子或化學因子的水平、作為一種內(nèi)皮細胞的趨化因子和/或血管生成因子的能力，從而治愈和預(yù)防EB患者的皮膚惡變。
最初，胸腺素β4被認為是內(nèi)皮細胞在體外遷移和分化中的正向調(diào)節(jié)蛋白。胸腺素β4最早是在胸腺中被分離的，它具有43個氨基酸，分子量4.9KDa，并且普遍存在于各種組織中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了該蛋白的幾種作用，包括在內(nèi)皮細胞分化和遷移、T細胞分化、肌動蛋白螯合以及在血管形成中的作用。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，本發(fā)明是一種促進愈合和預(yù)防與EB相關(guān)的水泡、瘡傷和皮膚惡變的治療方法，包括給予需要這種治療的患者施用有效量的組合物，該組合物包含一種能抑制EB的多肽，其中該多肽包含有序列LKKTET或者具有EB抑制能力的該序列的保守突變體。該多肽優(yōu)選為胸腺素β4、胸腺素β4的同種異型體(isoform)、氧化的胸腺素β4、胸腺素β4亞砜(Tβ4 sulfoxide)或胸腺素β4的拮抗劑。
本發(fā)明的組合物包含胸腺素β4(Tβ4)、Tβ4的同種異型體、氧化的Tβ4、Tβ4亞砜、多肽或任何其它具有肌動蛋白結(jié)合域的螯合或結(jié)合肌動蛋白的蛋白質(zhì)、或包含或基本包含氨基酸序列LKKTET或具有EB抑制性的該序列保守突變體的多肽片段。國際申請No.PCT/US99/17282，公開了Tβ4的同種異型體，根據(jù)本發(fā)明它可能是有用的，并且還公開了氨基酸序列LKKTET以及具有EB抑制能力的該序列的保守突變體，它們可能是本發(fā)明可以利用的，在此作為參考引用。國際申請No.PCT/GB99/00833(WO 99/49883)，公開了氧化的胸腺素β4，它可能是本發(fā)明可以利用的，也在此作為參考引用。盡管本發(fā)明下文所述的內(nèi)容主要是針對Tβ4和Tβ4的同種異型體，但是需要提及的是下文的描述同樣適用于氨基酸序列LKKTET、包含LKKTET或者基本上由LKKTET或具有EB抑制能力的該序列的保守突變體組成的肽片段以及氧化的Tβ4。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種愈合和預(yù)防皮膚水泡及瘡傷的方法，該方法是使有效量的EB抑制性的組合物接觸皮膚，其中該組合物包含Tβ4或Tβ4的同種異型體。這種接觸可以是局部性的或全身性的。局部給藥的例子包括，例如，用洗劑、油膏劑、凝膠劑、霜劑、貼劑、噴霧劑、混懸劑、分散制劑、水凝膠劑、軟膏劑或油劑接觸皮膚，所述制劑僅含有Tβ4、或者是Tβ4與至少一種促進Tβ4滲透或延遲或緩慢釋放Tβ4肽進入治療區(qū)域的試劑的混合物。全身性給藥包括，例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射，或吸入、透皮或口服給藥，所施用的藥物組合物含有Tβ4或Tβ4的同種異型體等。給藥對象可以是哺乳動物，優(yōu)選為人類。
Tβ4或其類似物、同種異型體或衍生物以適宜的抑制EB的劑量給藥。例如，Tβ4可以在0.1-50微克的Tβ4劑量范圍內(nèi)給藥，優(yōu)選劑量范圍是1-25微克。
本發(fā)明的藥物組合物可以每日，隔天等方式給藥，一天給藥一次或一天給藥多次，例如，一天給藥2、3、4次或更多次。
Tβ4同種異型體是已知的，且其與已知氨基酸序列Tβ4的同源性達到70％、75％、80％或更高。這些同種異型體包括，例如，Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15。與Tβ4類似，同種異型體Tβ10和Tβ15也能鰲合肌動蛋白。Tβ4、Tβ10和Tβ15以及其它的同種異型體具有共同的氨基酸序列LKKTET，該序列與介導肌動蛋白的鰲合或結(jié)合相關(guān)。盡管不受任何特定理論的約束，但是Tβ4同種異型體的活性可能部分是由于具有調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合的能力。例如，Tβ4能調(diào)節(jié)皮膚的肌動蛋白的聚合(例如，β-胸腺素似乎能通過鰲合游離的G-肌動蛋白來使F-肌動蛋白解聚)。Tβ4調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合的能力全部或部分地由于它能通過LKKTET序列結(jié)合或鰲合肌動蛋白。因而，和Tβ4一樣，其它鰲合或結(jié)合肌動蛋白、或調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合的蛋白質(zhì)，包括含有氨基酸序列LKKTET的Tβ4同種異型體，也能夠減輕EB，或與Tβ4聯(lián)合使用減輕EB。
因而，可以預(yù)見Tβ4的同種異型體，例如，Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15，以及尚未得到鑒定的Tβ4同種異型體，均可用來實現(xiàn)本發(fā)明的目的。這些Tβ4的同種異型體能用于本發(fā)明的方法中，包括施用于受試體。本發(fā)明因此進一步提供了一種藥物組合物，該藥物組合物含有Tβ4、以及Tβ4的同種異型體Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15，以及藥學上可接受的載體。
此外，經(jīng)過合適的鰲合、結(jié)合、移動或聚合實驗證明的或者通過鑒定表明存在有介導肌動蛋白結(jié)合的氨基酸序列如LKKTET的其它具有肌動蛋白鰲合或結(jié)合能力的蛋白質(zhì)，或能移動肌動蛋白或調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合的蛋白質(zhì)，同樣也能用在本發(fā)明的方法中。這些蛋白包括例如凝溶膠蛋白(gelsolin)、維生素D結(jié)合蛋白(DBP)、肌動結(jié)合蛋白(profilin)，cofilin，adsevertin，propomyosin，fincilin，depactin，DNA酶I，vilin，達肝素(fragmin)，severin，外殼蛋白(capping protein)，β-輔肌動蛋白和acumentin。這些方法包括應(yīng)用于受試體的方法，本發(fā)明進一步提供了一種藥物組合物，該藥物組合物含有所述的凝溶膠蛋白、維生素D結(jié)合蛋白(DBP)、profilin，cofilin，depactin，DNA酶I，vilin，fragmin，severin，外殼蛋白，β-輔肌動蛋白和acumentin。因此，本發(fā)明包括使用一種EB抑制性多肽，該多肽含有氨基酸序列LKKTET(該序列可能存在于它的一級序列中)及其保守突變體。
此處所提及的術(shù)語“保守突變體”是指氨基酸殘基被其它生物功能類似的殘基替換。保守突變體的例子包括用其它殘基來替換疏水殘基，如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，用其它殘基來替換極性殘基，例如用賴氨酸替換精氨酸、天冬氨酸替換谷氨酸，或天冬氨酰胺替換谷酰胺，及其它類似替換。
Tβ4分布在許多組織和細胞類型中，因而能刺激Tβ4產(chǎn)生的試劑可添加到組合物中來促進組織和/或細胞產(chǎn)生Tβ4。這類試劑包括生長因子家族的成員，如胰島素樣生長因子(IGF-1)、血小板來源的生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、基本成纖維細胞生長因子(bFGF)、胸腺素α-1(Tα1)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。尤其優(yōu)選的是，試劑為轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)或TGF-β超家族的其它成員。本發(fā)明的Tβ4組合物可通過皮膚的細胞外基質(zhì)的沉積、細胞遷移和血管形成來實現(xiàn)結(jié)締組織的生長，從而減輕EB的癥狀。
根據(jù)一個實施方式，給受試體施用了一種在受試體內(nèi)刺激產(chǎn)生如上所述的EB抑制性肽的試劑。
此外，可協(xié)助和刺激減輕EB的試劑也可與Tβ4或Tβ4同種異型體一起添加到組合物中。這些試劑包括皮膚內(nèi)的血管生成劑、生長因子、控制細胞分化的試劑、促進細胞遷移的試劑和刺激細胞外基質(zhì)物質(zhì)供給的試劑。例如，以非限定的方式，Tβ4或Tβ4同種異型體可單獨添加或與下列任意一種或幾種試劑混合添加，所述試劑為有效劑量的VEGF、KGF、FGF、PDGF、TGFβ、IGF-1、IGF-2、IL-1、前胸腺素α和胸腺素α1。
本發(fā)明還包括一種藥物組合物，該組合物是在藥學上可接收的載體中含有治療有效量的Tβ4或Tβ4同種異型體。這種載體包括上面所列舉的非腸道給藥的載體。
愈合或預(yù)防與EB相關(guān)的水泡、瘡傷和皮膚惡變的實際劑量、試劑、制劑或組合物與許多因素有關(guān)，包括受試體的體重和健康狀況。但是，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以采用PCT/US99/17282所公開的確定臨床劑量的方法和技術(shù)以及本發(fā)明引用文獻的方法來確定適用劑量。
合適的局部給藥制劑包含Tβ4或Tβ4同種異型體的濃度范圍(重量百分比)為約0.001-10％，更優(yōu)選約0.01-0.1％，最優(yōu)選約0.05％。
本發(fā)明描述的治療方法涉及含有Tβ4或其它本發(fā)明化合物的試劑或組合物的多種給藥途徑或傳輸途徑，包括任何傳統(tǒng)的給藥技術(shù)(例如，但不限于，局部給藥、局部注射、吸入或全身給藥)。治療方法和所用組合物還包括通過混合藥學上可接受的無毒賦形劑或載體，將含有Tβ4或其它本發(fā)明化合物的組合物制成的藥物組合物。
本發(fā)明包括使用與Tβ4肽或其功能片段相作用的抗體。抗體主要由具有不同表位特異性的混合單克隆抗體組成，并且提供了清楚的單抗制備。單抗是由含有蛋白片段的抗原通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)制備的，參見PCT/US99/17282公開的內(nèi)容。本發(fā)明所用的術(shù)語“抗體”包括單克隆和多克隆抗體。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種通過給予有效量的一種調(diào)節(jié)Tβ4基因表達的制劑進行治療的方法。術(shù)語“調(diào)節(jié)”是指當Tβ4過度表達時，抑制Tβ4基因的表達；當Tβ4表達不足時誘導Tβ4基因的表達。術(shù)語“有效量”是Tβ4制劑的劑量，該劑量能有效調(diào)節(jié)Tβ4基因的表達，導致與Tβ4相關(guān)的EB癥狀的減弱。調(diào)節(jié)Tβ4或Tβ4同種異型體基因表達的試劑可以是，例如，多核苷酸。多核苷酸可以是反義的，三聯(lián)試劑(triplex agent)或核酶。例如，可以使用結(jié)構(gòu)基因區(qū)域的反義核苷酸，或是Tβ4的啟動子區(qū)域的反義核苷酸。
在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種使用介導Tβ4活性的化合物的方法。影響Tβ4活性的化合物(例如，拮抗劑和激動劑)包括肽、肽類似物、多肽、化學化合物、礦物質(zhì)如鋅，和生物制劑。
由于不受限于任何特定的理論，本發(fā)明可通過誘導末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(一種非模板控制的DNA聚合酶)、降低一個或多個炎癥細胞因子或化學因子的水平、并且作為一種內(nèi)皮細胞的化學趨向因子來促進與EB相關(guān)的水泡、傷口和皮膚惡變的治愈和預(yù)防，因而，可以促進由EB或其它退化性因素或環(huán)境因素引起的皮膚惡變的治愈和預(yù)防。
權(quán)利要求
1.一種促進愈合或預(yù)防與EB相關(guān)的水泡、瘡傷或皮膚惡變的治療方法，包括給予需要這種治療的患者施用有效量的組合物，該組合物包含一種能抑制EB的多肽，其中該多肽包含有氨基酸序列LKKTET或者具有EB抑制活性的該序列的保守突變體。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的多肽能促進皮膚癥狀的改善，包括增加所述患者皮膚的彈性。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的多肽包括胸腺素β4(Tβ4)、Tβ4的N末端突變體、Tβ4的C末端突變體、Tβ4的同種異型體、氧化的Tβ4或Tβ4亞砜。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的組合物被全身給藥。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的組合物被局部給藥。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述組合物的形式是凝膠劑、霜劑、貼劑、洗劑、噴霧劑、混懸劑、分散制劑、軟膏、水凝膠劑或油膏劑。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中，進一步包括至少一種能使Tβ4緩釋的試劑，或者促進Tβ4滲透到治療區(qū)域的試劑。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的多肽是重組的或合成的。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的多肽是一種抗體。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述的抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
11.一種促進愈合或預(yù)防與EB相關(guān)的水泡、瘡傷或皮膚惡變的治療方法，包括給予需要這種治療的患者施用有效量的組合物，該組合物包含一種能夠刺激EB抑制性多肽產(chǎn)生的試劑，所述多肽含有氨基酸序列LKKTET或其具有EB抑制活性的保守突變體。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述的多肽是胸腺素β4。
13.權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述的試劑是胸腺素β4的拮抗劑。
14.一種組合物，其用于促進愈合或預(yù)防與EB相關(guān)的水泡、瘡傷或皮膚惡變，該組合物含有有效量的包括EB抑制性多肽的組合物，該多肽含有氨基酸序列LKKTET或其具有EB抑制活性的保守突變體。
15.權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述的組合物包含LKKTET的N末端或C末端突變體。
16.權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述的組合物包含KLKKTET或LKKTETQ。
17.權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述的多肽包含Tβ4、Tβ4的同種異型體、氧化的Tβ4或Tβ4亞砜。
18.權(quán)利要求14所述的組合物，其包含凝膠劑、霜劑、貼劑、洗劑、噴霧劑、混懸劑、分散制劑、軟膏、水凝膠劑或油膏劑。
全文摘要
通過給予一種螯合肌動蛋白的多肽，例如胸腺素β4、胸腺素β4的同種異型體或氧化的胸腺素β4，治療和預(yù)防與大皰性表皮松解癥相關(guān)的水泡、瘡傷或皮膚惡變。
文檔編號A61P43/00GK1511017SQ02810095
公開日2004年7月7日 申請日期2002年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月17日
發(fā)明者阿蘭·L·戈爾茨坦, 阿蘭 L 戈爾茨坦, 芬克爾斯坦, 小杰克·芬克爾斯坦 申請人:雷金納克斯生物制藥公司