專利名稱：具有改善腦代謝的藥物制劑防治骨質(zhì)疏松癥的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用具有改善腦代謝的藥物防治骨質(zhì)疏松癥的新用途，這些藥物的代表藥物是吡拉西坦，該藥對老年性骨質(zhì)疏松具有較好的預(yù)防及治療作用。其他同類藥包括茴拉西坦、吡硫醇、利斯的明、多奈哌齊、石杉堿甲、雙氫麥角堿、都可喜、艾地苯醌，也有一定的預(yù)防骨質(zhì)疏松的功效，此外，某些具有改善腦代謝的中藥活性成分如三七總皂苷、銀杏內(nèi)酯、黃芩莖葉黃酮、巴戟天寡糖、赤芍總苷、阿魏酸、知母皂苷、紅花黃色素也具有一定的防治骨質(zhì)疏松的作用。用這些具有改善腦代謝的藥物對絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松和老年性骨質(zhì)疏松具有較好的預(yù)防及治療作用，對腎上腺糖皮質(zhì)激素等藥物造成的骨質(zhì)疏松也有具有較好的預(yù)防及治療作用。
背景技術(shù)：
骨質(zhì)疏松是一個嚴(yán)重的社會問題，已引起了醫(yī)學(xué)界的關(guān)注，隨著老齡化社會的來臨，人們對生活質(zhì)量的要求越來越高，骨質(zhì)疏松問題越來越引起社會的關(guān)注，現(xiàn)在骨質(zhì)疏松研究在國內(nèi)外都非常熱門，特別是原發(fā)性骨質(zhì)疏松。我國是世界上人口最多的國家，其中老年人口占亞洲老年人口的1/2和世界人口的1/5。北京、上海和成都3市的骨質(zhì)疏松流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，60-69歲年齡段骨質(zhì)疏松的發(fā)生率女性與男性分別為60％和30％左右。我國人口基數(shù)大，骨質(zhì)疏松患者已達6000萬～8000萬例，這給家庭和社會帶來嚴(yán)重的負擔(dān)[2]。另據(jù)統(tǒng)計2000年全國65歲以上的人有1.3億，占全國人口的10.7％，已成為典型的老年型國家。而患有骨質(zhì)疏松癥的患者在這些人群中約占90％，而髖骨骨折的病人在1年內(nèi)將有12％～40％死于各種合并癥。在存活者中也有50％的人行動不便。這不但給病人造成了嚴(yán)重的身心摧殘，同時也給家庭和社會增加了巨大的人力及財力負擔(dān)。在美國和西方國家中，在年齡超過55歲絕經(jīng)后的女性中，有一半的人患程度不同的骨質(zhì)疏松癥，而在65歲以上的老年人中患骨質(zhì)疏松者高達95％以上。隨著科學(xué)的發(fā)展和人類的進步，人均壽命不斷延長，老年人口迅速增加，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率也隨著出現(xiàn)迅速的增加。預(yù)計至2050年全世界65歲以上的老年人將由目前3.23億增加到15.55億，屆時骨質(zhì)疏松導(dǎo)致髖骨骨折發(fā)生人數(shù)也將由目前的166萬增加到626萬，其中亞洲、拉丁美洲、中東和非洲國家的患者將占70％以上。根據(jù)官方統(tǒng)計，美國每年用于骨質(zhì)疏松方面的直接和間接耗資達100億美元；英國的健康與社會保險機構(gòu)每年為骨質(zhì)疏松提供的資金超過5億英鎊；法國僅支付平均每年3萬股骨頸骨折的患者的住院費用約13.5億法郎。骨質(zhì)疏松所造成的如此巨大的社會和經(jīng)濟負擔(dān)，構(gòu)成了一個嚴(yán)重的全球性問題，已經(jīng)引起世界各國的極大關(guān)注。老齡化社會的到來使骨質(zhì)疏松的發(fā)生率日趨增高，嚴(yán)重威脅人們的生活質(zhì)量。
目前國內(nèi)外防治骨質(zhì)疏松癥藥物非常有限，常用的骨礦化促進劑，如鈣劑、維生素D療效有限；骨吸收抑制劑如雌激素、降鈣素、二磷酸鹽、異丙氧黃酮等雖有一定的作用，但不良反應(yīng)也多，影響臨床應(yīng)用，骨形成促進劑如氟化物的療效一直受爭議，美國至今還沒有上市[2-5]。在臨床治療方面，從雌激素替代療法，至二磷酸鹽類，降鈣素等藥物的防治已走過了幾個重要的發(fā)展階段，目前正轉(zhuǎn)入對骨形態(tài)蛋白及白細胞介素等細胞因子的治療研究，但是，至目前為止，這些用于防治骨質(zhì)疏松的藥物，均有不少副作用，有些療效一般，有些價格昂貴，目前尚沒有一種公認的理想藥物，因此，尋找高效低毒防治骨質(zhì)疏松的藥物仍然是藥理學(xué)工作者迫切的任務(wù)。
在防治骨質(zhì)疏松的藥物中，人們研究最多的是內(nèi)分泌因素對骨的影響而忽略了神經(jīng)因素的影響，在最近幾年的研究當(dāng)中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)在調(diào)節(jié)骨代謝中的重要作用，特別是下丘腦在調(diào)節(jié)骨代謝中起重要作用。在神經(jīng)遞質(zhì)方面的研究，經(jīng)過多年的研究，研究者們發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)有多種遞質(zhì)與骨質(zhì)疏松存在關(guān)系，其中5-羥色胺，乙酰膽堿，兒茶酚氨類神經(jīng)遞質(zhì)與骨質(zhì)疏松的關(guān)系較為密切，有人發(fā)現(xiàn)老年大鼠腦內(nèi)乙酰膽堿M受體的含量與骨量的降低明顯相關(guān)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。此外有報道，中樞神經(jīng)系統(tǒng)對骨代謝的調(diào)節(jié)就目前的研究發(fā)現(xiàn)有兩條通路，都是通過下丘腦起中樞調(diào)節(jié)作用，一條是下丘腦-垂體-腺體軸，一條是瘦素-交感神經(jīng)軸，前一條軸其的作用機理和作用規(guī)律研究得比較透徹，后一條軸是近年來新發(fā)現(xiàn)的一條軸，而且對新一代的抗骨質(zhì)疏松藥物的發(fā)現(xiàn)起到了理論引導(dǎo)作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過外周通路的介導(dǎo)，對骨的代謝起調(diào)節(jié)作用，內(nèi)分泌系統(tǒng)和外周交感神經(jīng)系統(tǒng)都有介導(dǎo)作用，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、交感神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)生變化時，骨代謝均可發(fā)生變化。人的老化首先是腦的老化，腦老化引起一系列的其他組織器官的老化，抗腦衰老可能達到抗其他組織衰老的效果，腦在調(diào)節(jié)骨代謝中起主導(dǎo)地位，腦的老化對老年性骨質(zhì)疏松，特別是II型老年性骨質(zhì)疏松的發(fā)生起重要作用。因此，我們認為抗腦衰老的藥物對抗骨質(zhì)疏松必定有一定的療效。

發(fā)明內(nèi)容
本項目組提出的用“具有改善腦代謝的藥物”防治“骨質(zhì)疏松癥”研究的理論和思路，經(jīng)大量的動物實驗研究和篩選，我們發(fā)現(xiàn)吡拉西坦具有激活、保護和修復(fù)大腦神經(jīng)腦細胞的作用，同時，對骨形成也有較好的促進作用，可用于防治骨質(zhì)疏松。進一步研究還發(fā)現(xiàn)茴拉西坦、吡硫醇、利斯的明、多奈哌齊、石杉堿甲、雙氫麥角堿、都可喜、艾地苯醌這些改善腦代謝的活性藥物及促進智力的藥物對老年性骨質(zhì)疏松也有一定的防治作用。
此外，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，某些具有改善腦代謝的中藥活性成分如三七總皂苷、銀杏內(nèi)酯、黃芩莖葉黃酮、巴戟天寡糖、赤芍總苷、阿魏酸、知母皂苷、紅花黃色素也具有一定的防治骨質(zhì)疏松的作用。用這些具有改善腦代謝的藥物對絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松和老年性骨質(zhì)疏松具有較好的預(yù)防及治療作用，對腎上腺糖皮質(zhì)激素等藥物造成的骨質(zhì)疏松也有具有較好的預(yù)防及治療作用。
具體實施例方式實施例一1材料和方法1.1動物來源和分組
6月齡普通級Sptague-Dawley(SD)雄性大鼠30只，體重300+50g。隨機分成5組，每組6只。對照組、模型組、吡拉西坦低劑量組(L)、吡拉西坦高劑量組(H)、司坦唑醇組。飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)室內(nèi)溫度保持24℃～28℃，濕度在50％～60％。分籠普通飼養(yǎng)，每籠兩只，自由攝食攝水，專室飼養(yǎng)，專人負責(zé)，每星期稱體重一次。分組給藥情況如下(1)對照組(2)模型組(3)吡拉西坦低劑量組(4)吡拉西坦高劑量組(5)司坦唑醇組1.2動物給藥實驗第一周開始，對照組皮下注射生理鹽水，模型組和給藥組皮下注射D-半乳糖，并分別用生理鹽水、10％吡拉西坦、20％吡拉西坦、12.5％司坦唑醇灌胃。三個月后處死大鼠，大鼠殺前13、14天皮下注射25mg/kg鹽酸四環(huán)素各一次，殺前3、4兩天皮下注射鈣黃綠素5mg/kg各一次，兩熒光標(biāo)記間隔10天。
1.3取材連續(xù)給藥三個月后，在3％的戊巴比妥麻醉下，右心室抽血處死大鼠，并立即煎開右心耳，從左心室灌注2.0％-2.5％的多聚甲醛-戊二醛的固定液50ml/kg，并立即完整取出腦，放入2.5％的戊二醛溶液中后固定。取出左側(cè)脛骨和股骨，后面的工序與第一部分相同。抽出的血靜置一段時間后，3000r/min離心，吸取上清(即血清)用于生化指標(biāo)的測定和防免測定睪酮、FSH、LH，-20℃保存。
1.4電鏡觀察弓狀核結(jié)構(gòu)1.4.1主要試劑和儀器(略)1.4.2溶液的配置(略)1.4.3樣品的處理固定1.前固定用2.0％-2.5％的多聚甲醛-戊二醛灌注固定，然后放入2.5％的戊二醛溶液中固定，2.清洗用0.2M磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2～3次，每次10～15分鐘。
3.后固定1％的四氧化鋨固定1～2小時。
4.清晰用0.2M磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2～3次，每次10～15分鐘。
5.脫水用50％-70％-80％-95％-100％乙醇梯度脫水，每個濃度1次，每次15分鐘，其中100％的乙醇脫水兩次，每次15分鐘。，最后用100％的丙酮脫水一次，時間為15分鐘。
6.浸泡把樣本放入環(huán)氧樹脂包埋劑∶無水丙酮1∶1的混合液中浸泡2～4小時，再放入純包埋劑中在室溫下浸泡2～4小時。
7.聚合把樣品和包埋劑一并放入40℃中加熱24小時，60℃中加熱24～48小時。
1.4.3.2切片用超薄切片機切片，厚度600A左右1.4.3.3染色用醋酸鈾、檸檬酸鉛各染色15～30分鐘。
1.4.3.4看鏡(略)1.5骨形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)的測定1.5.1不脫鈣骨骨標(biāo)本的包埋(1)包埋前單體(甲基丙烯酸甲酯)的洗脫方法1)將1500ml的甲基丙烯酸甲酯倒入分液漏斗(3L)中2)加入5％NaOH溶液500ml，充分搖勻，靜置，待溶液分層后，放出下層溶液，費去。
3)重復(fù)操作“2”三次，三次的總量與單體量相當(dāng)(洗脫阻滯劑)4)加等量的水重復(fù)操作“2”三次(洗脫NaOH)5)將上述處理過的單體放入無水CaCl2(1000ml∶500g)脫水2次6)濾紙過濾，收集濾液7)-4℃保存?zhèn)溆?，第二天取出看有無冰晶漂浮，無，表明無水可備用，有，則需從新脫水。
(2)脛骨上段包埋前的制備過程1)暴露骨髓腔將固定液中的脛骨用低速鋸鋸開，暴露骨髓腔，解剖部位如下2)脫水，分別通過70％1天，70％1天，95％2天，100％1天，100％1天，五個脫水過程，二甲苯 透明1天。
3)浸潤先后用浸潤I、浸潤II、浸潤III分別浸潤2天，三種浸潤液的配置方法如下

(3)包埋用新鮮配置的浸潤III(當(dāng)日配置)倒入裝有浸潤好的骨頭塊容積約為15ml的小瓶中，倒入的包埋劑約10ml，蓋好瓶蓋，并在瓶蓋上插一注射器針頭，擺好骨頭塊的位置，使標(biāo)本置中，切面向下，室溫過夜。第二天把包埋瓶置入37-39℃的水育箱中聚合約48小時，直至包埋塊形成。
1.5.2不脫鈣骨片的制作(1)載玻片的制備(略)
(2)切片用石膏打磨機將包埋塊打磨成合適大小，并暴露切面，把切面打磨到合適位置。將打磨好的快固定在切片機上，右手漫漫切下，左手用一軟毛刷輕輕撥下切片，注意不要弄爛切下的片，然后用毛刷把片轉(zhuǎn)移到滴有一滴70％酒精的載玻片上，再滴一滴70％的酒精，然后漫漫展平切片，蓋上一張薄塑料片，并用濾紙將多余的酒精吸干。
將切好的一組片，用夾子夾穩(wěn)，放入41℃左右的鼓風(fēng)烤箱中烤4小時左右，取出備用。一個標(biāo)本切兩種厚度的片4μ(薄片)和8μ(厚片)，薄片用于染色數(shù)破骨細胞，厚片用于直接封片和Von Kossa染色。
1.5.3骨片染色4μ的薄片常采用Masson-Goldner Trichrome染色，染色后，骨質(zhì)為綠色，骨髓為紅色，用于觀察骨小梁表面的破骨細胞和測量其周長。8μ的厚片采用Von Kossa法染色，染色后，骨質(zhì)為黑色，反映礦化后的骨質(zhì)，用于觀察骨量和骨結(jié)構(gòu)，下面是Masson-Goldner Trichrome染色過程。
工作液的準(zhǔn)備

染色過程(略)1.5.4厚片骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)的測定(1)測量分析范圍脛骨上段測量范圍從生長板往下畫出0.5mm，以避開初級海綿體，再從0.5mm處往下畫3mm。
腰椎測量范圍從腰椎兩側(cè)沿生長板下緣0.25mm處各畫一條曲線，測量兩條曲線之間的區(qū)域。
(2)動、靜態(tài)參數(shù)測量和計算本實驗所有參數(shù)采用國際通用標(biāo)準(zhǔn)骨組織形態(tài)計量學(xué)術(shù)語命名。
1.5.5股骨Ca、P、Mg等元素的測定剔除股骨上的軟組織后，稱骨濕重，放入100℃的高溫烤箱中連續(xù)烤72小時，取出稱其干重，然后每個樣品分別放入10ml的安培瓶中，加入6N的鹽酸5ml，放入80℃烤箱中連續(xù)消化72小時，將消化液用22ц濾膜過濾，吸取0.5ml濾液，稀釋40倍后，用ICP檢測骨中Ca、P、Mg等元素的含量。
1.5.6統(tǒng)計學(xué)分析正態(tài)分布數(shù)據(jù)的組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，預(yù)先用Levene’s test檢驗方差齊性，如方差相等采用LSD檢驗，如方差不齊則采用Tamhane’s T2檢驗；偏態(tài)分布則用Kruskal-Wallis秩和檢驗后，再進一步用Conover’s t檢驗比較兩兩組間差別。
2結(jié)果2.1電鏡結(jié)果2.1.1電鏡下觀察到正常的大鼠腦弓狀核的結(jié)構(gòu)，大鼠腦弓狀核內(nèi)的神經(jīng)原包含兩種類型，一種為亮細胞，另一種為暗細胞。亮細胞內(nèi)細胞器含量少，胞質(zhì)清亮，胞核光滑，經(jīng)研究被認為亮細胞在調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)中不起主導(dǎo)作用。相反，暗細胞內(nèi)細胞器含量豐富，具有豐富的線立體、高爾基復(fù)合體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，核糖體大量存在。胞核凹凸不平，很不規(guī)則。暗細胞被認為是弓狀核內(nèi)具有分泌功能的神經(jīng)原細胞，它對調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能具有重要作用。我們在實驗中也觀察到這兩種典型的細胞，因此可以證明我們對弓狀核的定位是準(zhǔn)確的。
2.1.2在模型組中我們觀察到老化的神經(jīng)元細胞，在模型組大鼠中我們觀察到細胞胞漿含量少而渾濁，細胞器少且結(jié)構(gòu)模糊。有一些細胞胞漿中觀察到較多的脂褐素。我們還觀察到雙極細胞，雙極細胞是由于神經(jīng)細胞的胞體、軸突和樹突萎縮，軸突變得短而細，在低倍放大率能夠看到，神經(jīng)元細胞呈梭形狀，中間是胞體，兩頭是萎縮的突觸。這種是老化的神經(jīng)元細胞。另我們還觀察到凋亡細胞，細胞核呈圓形凋亡細胞的胞核內(nèi)，染色質(zhì)邊聚。以上事實說明模型組大鼠的神經(jīng)原細胞呈現(xiàn)老化狀態(tài)。對照組大鼠未觀察到任何以上病變，對照組大鼠神經(jīng)原細胞內(nèi)，細胞器豐富，胞質(zhì)內(nèi)含有大量的核糖體，高爾基復(fù)合體清晰可見，線粒體含量豐富，結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)清亮。
2.1.3高劑量吡拉西坦能夠?qū)笵-半乳糖引起的腦老化病變，我們在實驗中觀察到高劑量吡拉西坦組大鼠的神經(jīng)原細胞與模型組截然不同，而與對照組大鼠的神經(jīng)原細胞相似，胞漿內(nèi)細胞器含量豐富，結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)清亮，脂褐素少見，沒有觀察到凋亡細胞和雙級神經(jīng)原細胞。說明吡拉西坦能夠?qū)笵-半乳糖引起的中樞神經(jīng)原老化。
2.1.4司坦唑醇對抗D-半乳糖引起的腦老化有一定的作用，但作用不是很明顯，在司坦唑醇組的神經(jīng)原細胞中，我們沒有發(fā)現(xiàn)凋亡細胞，也沒有看到雙極神經(jīng)原，但神經(jīng)原細胞內(nèi)的細胞器含量較少，而且結(jié)構(gòu)不是很清晰。
2.2骨形態(tài)計量結(jié)果2.2.1雄性大鼠各組體重、股骨骨干重、睪丸重以及后兩者對體重的比值比較雄性大鼠各組體重、股骨骨干重、睪丸重以及后兩者對體重的比值見表2-5表1雄性大鼠各組體重、股骨骨干重、睪丸重以及后兩者對體重的比值表(x±s，n＝6)group BW(g) BDW(g) BDW/BW(g*10-3) TW(g) AD(g*10-2)CON 376.8±31.710.746±0.091.98±0.000 2.18±0.464.17±0.66D-Gal 361.8±42.1 0.677±0.081.87±0.000*1.79±0.593.47±0.64*PI(L) 377.8±27.350.709±0.061.85±0.123 2.04±0.683.61±0.32PI(H) 383.0±27.540.703±0.061.85±0.126 2.02±0.454.80±2.10STAN 371.75±34.80.726±0.052.01±0.224#2.35±0.703.61±0.27*P＜0.05 **P＜0.01 vs basal group #P＜0.05，##P＜0.01 vs model group by SAS ANOVA體重(BW)、骨干重(BDW)、骨重/體重(BDW/BW)、睪丸重(TW)、腎上腺(AD)CON對照組D-Gal模型組PI(L)吡拉西坦低劑量組PI(H)吡拉西坦高劑量組，STAN司坦唑醇組從表1中可以看出，各組大鼠體重、骨干重?zé)o明顯變化，模型組雖有體重、骨干重的下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義。用骨干重除以體重之后，他們的比值，模型組與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義，其他用藥組則無明顯變化。模型組大鼠的睪丸、腎上腺與對照組相比，模型組大鼠的睪丸、腎上腺重量下降，其中腎上腺下降有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.2.2脛骨靜態(tài)參數(shù)比較脛骨靜態(tài)參數(shù)見表2
表2脛骨靜態(tài)參數(shù)記錄表(x±s，n＝6)group％Tb.Ar Tb.Th Tb.N TB.Sp(％) (um) (#/mm) (um)CON 8.0+3.0 64.97+6.06 1.24+0.54 885.15+511.63D-Gal3.7+1.5**61.77+12.260.62+0.26**1879.17+1004.94*PI(L)4.2+2.5 61.66+12.590.66+0.37 1770.75+772.16PI(H)6.3+5.1 71.53+17.450.78+0.42 1510.98+572.74STAN 7.7+2.7# 67.07+3.88 1.14+0.37# 916.18+406.76#*P＜0.05 **P＜0.01 vs basal group #P＜0.05，##P＜0.01 vs model group by SAS ANOVA表2顯示，模型組大鼠脛骨上端的骨小梁百分率、骨小梁數(shù)目明顯下降，P＜0.01，骨分離度明顯上升，P＜0.05，說明模型建立成功。司坦唑醇組大鼠脛骨上端的骨小梁百分率、骨小梁數(shù)目與模型組相比升高，骨分離度下降，P＜0.05，說明陽性對照藥司坦唑醇能夠?qū)笵-半乳糖引起的骨量丟失。
2.2.3脛骨動態(tài)參數(shù)記錄表脛骨動態(tài)參數(shù)記錄表3表3脛骨動態(tài)參數(shù)記錄表(x±s，n＝6)group ％L.Pm MARBFR/BV BFR/BS BFR/TV(％) (um/d) (％yr) (％yr) (％yr)CON 24.03±5.39 1.13±0.36 22.60±7.63 302.5±95.2 11.78±4.28D-Gal 26.23±11.26 1.13±0.29 12.19±8.37*285.2±131.1 11.07±5.95PI(L) 14.71±9.36 1.19±0.27 7.76±6.58 161.0±69.6 6.26±3.58PI(H) 16.15±10.55 2.27±1.76 19.32±18.90 268.8±198.0 11.75±7.75STAN17.26±6.59 0.82±0.23 9.45±5.84 131.9±79.6 5.38±3.52*P＜0.05 **P＜0.01 vs basal group #P＜0.05，##P＜0.01 vs model group by SAS ANOVA表3顯示，模型組的BFR/BV明顯下降，BFR/BV是反映骨形成的重要指標(biāo)，說明模型組的骨形成量明顯降低，這與預(yù)實驗的結(jié)果是相一致的。其他指標(biāo)無明顯變化。
2.2.4腰椎靜態(tài)參數(shù)比較腰椎靜態(tài)參數(shù)比較見表4表4腰椎靜態(tài)參數(shù)記錄(x±s，n＝6)
group％Tb.Ar Tb.Th Tb.NTB.Sp(％) (um) (#/mm) (um)CON 23.1±5.0 87.88±15.01 2.62±0.28 296.78±42.48D-Gal 15.8±4.1**65.74±10.66**2.38±0.35 362.68±72.62*PI(L) 18.2±6.5 75.47±15.08 2.36±0.48 366.96±115.87PI(H) 23.4±4.5##86.82±19.18# 2.72±0.29# 284.05±36.52#STAN19.2±4.9 70.23±8.692.70±0.39 305.74±62.25*P＜0.05 **P＜0.01 vs basal group #P＜0.05，##P＜0.01 vs model group by SAS ANOVA表2-8顯示，模型組大鼠的腰椎骨骨量明顯降低。從骨小梁百分率、骨小梁數(shù)目和骨分離度等指標(biāo)看，與脛骨上端的變化相一致。高劑量吡拉西坦組大鼠的腰椎骨量與模型組相比，骨小梁百分率明顯上升，P＜0.01，骨小梁數(shù)目也上升，P＜0.05，骨小梁厚度也增厚，P＜0.05，而骨分離度明顯下降，P＜0.05。說明高劑量吡拉西坦對D-半乳糖引起的腰椎骨丟失有良好的對抗效果。
2.2.5腰椎動態(tài)參數(shù)比較腰椎動態(tài)參數(shù)記錄見表5表5腰椎動態(tài)參數(shù)記錄表(x±s，n＝6)group％L.PmMAR BFR/BVBFR/BS BFR/TV(％) (um/d) (％yr)(％yr) (％yr)CON 21.9±22.93 1.11±0.25 38.25±7.67 170.99±46.488.69±1.11D-Gal15.8±13.98**1.06±0.24 23.62±5.78**152.27±24.495.97±1.25**PI(L)11.70±11.57 1.28±0.64 20.25±19.6 146.05±203.75.93±7.27PI(H)15.58±5.79 1.44±0.44#36.46±17.6#161.41±92.257.91±3.49#STAN 14.95±5.29 1.07±0.31 26.24±10.76 151.42±79.366.07±2.78*P＜0.05 **P＜0.01 vs basal group #P＜0.05，##P＜0.01 vs model group by SAS ANOVA根據(jù)表2-9，我們可以看出，模型大鼠的骨形成參數(shù)明顯下降。骨％L.Pm、BFR/BV、BFR/TV均明顯降低，P＜0.01。高劑量吡拉西坦組大鼠的骨MAR、BFR/BV、BFR/TV均明顯上升，P＜0.05，說明高劑量組腦復(fù)康能夠增加大鼠骨的鈣化沉積和骨的形成。
2.2.6腰椎破骨細胞數(shù)量比較腰椎破骨細胞數(shù)量見表6表6腰椎破骨細胞數(shù)量見(x±s，n＝6)
group N.OCCON 3.2±0.6D-Gal 2.9±1.5PI(L) 3.4±1.1PI(H) 2.8±0.8STAN 3.0±0.7.
*P＜0.05 **P＜0.01 vs basal group #P＜0.05，##P＜0.01 vs model group by SAS ANOVA根據(jù)表2-10的結(jié)果顯示，大鼠腰椎的破骨細胞數(shù)目無明顯變化，說明大鼠的骨吸收指標(biāo)無明顯變化。
2.2.7股骨骨鈣、骨磷、骨鎂比較股骨骨鈣、骨磷、骨鎂見表7表7股骨骨鈣、骨磷、骨鎂(x±s，n＝6)groupCa P MgBAL 0.249±0.1920.106±0.009 4.23±2.67D-Gal0.256±0.0210.109±0.007 4.47±0.48PI(L)0.239±0.2760.104±0.008 4.12±0.36PI(H)0.225±0.2660.100±0.009 4.05±0.31STAN 0.236±0.5200.103±0.012 4.18±0.45*P＜0.05 **P＜0.01 vs basal group #P＜0.05，##P＜0.01 vs model group by SAS ANOVA根據(jù)表7的數(shù)據(jù)顯示，各組大鼠股骨的鈣、磷、鎂含量無明顯變化，2.2.8各組血清睪酮、LH、CAT、GLU含量比較各組血清睪酮、LH、CAT、GLU含量比較見表8表8各組睪酮、LH、CAT、GLU記錄表(x±s，n＝6)group 睪酮 LH CAT GLUcontrol171.67±135.3 7.58±3.57 0.259±0.05 99.7±16.85D-galactose50.4±28.62*5.93±1.22 0.187±0.07*101.4±27.30piracetam(L) 43.67±21.32 6.9±1.150.350±0.04**121.3±13.93piracetam(H) 46.51±9.476.1±3.920.268±0.25 112.9±10.27stansolol 111.75±78.2*3.05±0.70*0.406±0.15**106.5±10.38P＜0.05 **P＜0.01 vs basal group #P＜0.05，##P＜0.01 vs model group by SAS ANOVA
根據(jù)表8，我們可以看到模型組和腦復(fù)康組雄性大鼠的血清睪酮含量降低，基礎(chǔ)組和司坦唑醇組大鼠血清睪酮含量相當(dāng)，說明D-半乳糖可以導(dǎo)致血清睪酮含量下降。各組血清LH的比較結(jié)果顯示，除了司坦唑醇組血清LH下降外，其他各組的LH含量不變，說明大鼠腦對睪酮含量降低的反饋刺激反應(yīng)性降低，而對外源性激素的反饋抑制卻很明顯。CAT結(jié)果顯示，模型組和各用藥組的CAT明顯下降，說明大鼠氧化壓力增高，大鼠老化。血糖含量結(jié)果顯示各組大鼠血糖含量無明顯變化。
3小結(jié)3.1D-半乳糖對大鼠下丘腦弓狀核有促衰老影響，吡拉西坦和司坦唑醇有對抗作用下丘腦是內(nèi)分泌系統(tǒng)的中樞調(diào)節(jié)部位，其中弓狀核是主要調(diào)節(jié)核團，弓狀核屬于中樞分泌細胞的小細胞，分泌多種促垂體釋放激素，對調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能起重要作用，從我們的實驗結(jié)果可以看出，D-半乳糖可以加速大鼠弓狀核的衰老，增加弓狀核細胞的雕亡。在模型組中，從電鏡結(jié)果我們觀察到雕亡細胞，觀察到細胞核邊聚和雙極神經(jīng)原，而在其他組沒有看到任何雕亡細胞，且模型組神經(jīng)原細胞胞漿薄而渾濁，細胞器減少，含有較多的脂褐素顆粒。而腦復(fù)康和司坦唑醇都能對抗D-半乳糖的促中樞神經(jīng)原的衰老作用。吡拉西坦是中樞興奮藥，有促進中樞受損神經(jīng)細胞的修復(fù)作用，屬于抗衰老藥。臨床上常用于腦血管意外的病人，可以加速受損腦細胞的修復(fù)，使病人加快康復(fù)。從電鏡結(jié)果看出吡拉西坦組大鼠神經(jīng)原細胞胞漿飽滿清亮，細胞器豐富，未觀察到凋亡細胞。司坦唑醇是同化類激素，具有雄激素作用，能夠促進蛋白質(zhì)的合成，是抗骨質(zhì)疏松的陽性藥物。從弓狀核神經(jīng)原電鏡結(jié)果我們觀察到細胞胞漿豐富，細胞器中等，沒有觀察到凋亡細胞。但胞漿內(nèi)含有較多的脂褐素顆粒。
3.2D-半乳糖能夠影響垂體促性腺激素的釋放，吡拉西坦對促性腺激素的分泌無明顯影響，而司坦唑醇能夠減低垂體促性腺激素的釋放。垂體的功能能夠直接影響性腺的功能，垂體的病變能夠引起骨質(zhì)疏松，下丘腦功能的下降直接影響垂體的功能，我們在實驗中觀察到，模型組的睪酮含量降低，而促黃體生成素的含量并不升高，說明下丘腦-垂體對性激素低下的發(fā)潰功能下降，吡拉西坦組的LH也無明顯升高，說明吡拉西坦不是通過影響下丘腦-垂體-性腺軸發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。司坦唑醇組雄激素含量增加，與模型組相當(dāng)，但其LH明顯降低，說明下丘腦-垂體對性激素的反饋抑制異常敏感。這也說明下丘腦-垂體功能受到抑制。具體垂體有無受到影響需要進一步的證明。
3.3D-半乳糖使大鼠睪丸的結(jié)構(gòu)發(fā)生衰老樣變化，血清睪酮含量降低。模型組大鼠睪丸光鏡下觀察到，曲細精管管腔增大，管壁變薄。，管內(nèi)精子少見。這與預(yù)實驗結(jié)果相符，且血清睪酮含量降低。說明D-半乳糖影響了睪丸的功能，雄激素含量降低。吡拉西坦組的睪酮含量也低，與模型組相當(dāng)，但其骨量卻上升，進一步說明，它不是通過影響下丘腦-垂體-性腺軸發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。司坦唑醇組血清睪酮含量升高，與對照組相當(dāng)，說明司坦唑醇是通過影響了體內(nèi)雄激素的含量起抗骨質(zhì)疏松的作用。
3.4D-半乳糖使大鼠骨量的降低，吡拉西坦和司坦唑醇均能對抗，實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠脛骨上段和腰椎的骨小梁百分率，骨小梁數(shù)目，均降低。骨分離度均升高。卻都有統(tǒng)計學(xué)意義。脛骨上端的動態(tài)參數(shù)顯示，脛骨上端和腰椎的骨形成增加，但脛骨上端除了單位面積骨形成率有統(tǒng)計學(xué)意義之外，其他無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是我們選用的9月齡的大鼠，其脛骨的骨峰度較低的原因大鼠年齡。而腰椎動態(tài)參數(shù)結(jié)果顯示，模型組大鼠的標(biāo)記百分率、鈣化沉積率、單位面積骨形成率均下降，而破骨細胞數(shù)量未見明顯變化。說明D-半乳糖是通過抑制骨形成使骨量降低。高劑量吡拉西坦組的腰椎和司坦唑醇組的脛骨上段的骨靜態(tài)參數(shù)與模型組相比明顯增加，有統(tǒng)計學(xué)意義，從他們的動態(tài)參數(shù)來看，吡拉西坦組腰椎的骨形成率明顯增高，而司坦唑醇組脛骨上段的骨形成量明顯增多。這就說明吡拉西坦和司坦唑醇均能增加骨的形成。對骨的吸收無明顯影響。
實施例二根據(jù)實施例一的研究結(jié)果，我們對具有改善腦代謝的活性藥物及促進智力的藥物進行了進一步研究，研究發(fā)現(xiàn)茴拉西坦、吡硫醇、利斯的明、多奈哌齊、石杉堿甲、雙氫麥角堿、都可喜、艾地苯醌八種藥物對老年性骨質(zhì)疏松也有一定的防治作用。
實施例三根據(jù)實施例一和實施例二的研究結(jié)果，我們對某些具有改善腦代謝的中藥活性成分進行了進一步研究，研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷、銀杏內(nèi)酯、黃芩莖葉黃酮、巴戟天寡糖、赤芍總苷、阿魏酸、知母皂苷、紅花黃色素八種藥物也具有一定的防治骨質(zhì)疏松的作用。用這些具有改善腦代謝的藥物對絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松和老年性骨質(zhì)疏松具有較好的預(yù)防及治療作用，對腎上腺糖皮質(zhì)激素等藥物造成的骨質(zhì)疏松也有具有較好的預(yù)防及治療作用。
上述藥品可制成片劑，膠囊劑，顆粒劑，沖劑，口服液，外用制劑，注射劑和任何可供臨床應(yīng)用的的藥物制劑。
權(quán)利要求
1.具有改善腦代謝的藥物吡拉西坦、茴拉西坦、吡硫醇、利斯的明、多奈哌齊、石杉堿甲、雙氫麥角堿、都可喜、艾地苯醌、三七總皂苷、銀杏內(nèi)酯、黃芩莖葉黃酮、巴戟天寡糖、赤芍總苷、阿魏酸、知母皂苷、紅花黃色素在防治骨質(zhì)疏松癥的應(yīng)用。
2.如權(quán)力要求1所述的具有改善腦代謝的藥物，可制成片劑，膠囊劑，顆粒劑，沖劑，口服液，外用制劑，注射劑和任何可供臨床應(yīng)用的的藥物制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了用具有改善腦代謝的藥物防治骨質(zhì)疏松癥的新用途，這些藥物的代表藥物是吡拉西坦，該藥對老年性骨質(zhì)疏松具有較好的預(yù)防及治療作用。其他同類藥包括茴拉西坦、吡硫醇、利斯的明、多奈哌齊、石杉堿甲、雙氫麥角堿、都可喜、艾地苯醌，也有一定的預(yù)防骨質(zhì)疏松的功效，此外，某些具有改善腦代謝的中藥活性成分如三七總皂苷、銀杏內(nèi)酯、黃芩莖葉黃酮、巴戟天寡糖、赤芍總苷、阿魏酸、知母皂苷、紅花黃色素也具有一定的防治骨質(zhì)疏松的作用。用這些具有改善腦代謝的藥物對絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松和老年性骨質(zhì)疏松具有較好的預(yù)防及治療作用，對腎上腺糖皮質(zhì)激素等藥物造成的骨質(zhì)疏松也有具有較好的預(yù)防及治療作用。
文檔編號A61K31/7042GK1709274SQ20051007826
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月8日
發(fā)明者吳鐵, 崔燎, 覃冬云, 鄒麗宜, 羅紅梅, 許碧蓮, 劉鈺瑜 申請人:廣東醫(yī)學(xué)院