專利名稱：四價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗制備領(lǐng)域，具體的，涉及四價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝。
背景技術(shù)：
流行性腦脊髓膜炎是由腦膜炎雙球菌引起的化膿性腦膜炎，簡稱流腦。流腦的流行早在16世紀(jì)即被發(fā)現(xiàn)，易感人群主要為兒童及青少年。發(fā)病癥狀分普通型和爆發(fā)型；普通型表現(xiàn)為劇烈頭疼、頻繁嘔吐、煩躁不安和頸項(xiàng)強(qiáng)直凱爾尼格征和布魯津斯基征陽性等腦膜刺激癥狀，伴有呼吸、循環(huán)衰竭或其它并發(fā)癥；爆發(fā)型多見于兒童病人。起病急劇，病情兇險(xiǎn)，如不及時(shí)搶救，常在M小時(shí)內(nèi)危及生命。爆發(fā)型病死率最高可達(dá)40~60%。任何年齡都可發(fā)病，其中14歲以下年齡、尤其是7歲以下兒童發(fā)病率最高。腦膜炎雙球菌隱藏于患者或帶菌者的鼻咽分泌物中，主要通過咳嗽、打噴嚏、說話等由飛沫直接從空氣傳播，進(jìn)入呼吸道而引起感染。從全球來看，流腦散發(fā)病例和地方性流行仍然在危害人類健康。其流行的地域分布極廣，幾乎遍及各大洲。各國之間流腦的發(fā)病水平差異很大，在發(fā)展中國家發(fā)病率相對較高，在非洲發(fā)病率最高。當(dāng)今，全世界每年發(fā)生30萬 35萬流腦病例。高發(fā)地區(qū)依然是非洲、亞洲和南美洲。非洲撒哈拉以南的“腦膜炎地帶“的發(fā)病率最高，在流行年度可高達(dá) 400 /十萬 800 /十萬。由于地理及氣候原因，流行季節(jié)一般在11月底至次年6月底之間。這一地帶向東已延伸至埃塞俄比亞，往西已擴(kuò)大到塞內(nèi)加爾，涉及18個(gè)國家，約有3億人口，且還有擴(kuò)大的趨勢。自1980年起，這一地帶呈有規(guī)律地暴發(fā)流行。近年來，流行性腦脊髓膜炎爆發(fā)流行由過去的A群為主，逐漸演變?yōu)锳群與其他群并存。1996年，南撒哈拉非洲國家發(fā)生一次歷史上最大的流腦流行，報(bào)道病例數(shù)達(dá)18萬以上，死亡18000人，流行菌群以B群和C群為主。2000年與2001年沙特阿拉伯哈吉地區(qū)兩次爆發(fā)流行性腦脊髓膜炎， 共發(fā)病500多例，其中230多例為W135群，其余均為A群。據(jù)WHO報(bào)告，2002年春季布基納法索爆發(fā)流腦，發(fā)病12，587例，死亡1，447例，死亡率11.5%。也主要以W135群為主。 我國在1938年、1949年、1959年、1967年、1977年共發(fā)生過五次全國性流腦大流行，平均約 8 10年流行一次，主要以A群腦膜炎雙球菌引起的流腦流行為主。1967年春季發(fā)病率達(dá)到最高峰，為403/10萬，病死率5. 49%。80年代初我國研制的A群流腦多糖疫苗獲準(zhǔn)投入使用，預(yù)防效果良好，80年代以后我國未再發(fā)生全國性的大流行。1985年發(fā)病率為9. 9/10 萬，1986年 1989年的發(fā)病率依次為7. 56/10萬、3. 21/10萬、1. 97/10萬、1. 32/10萬。疫苗的使用，有效地控制了流行高峰。但散發(fā)病例仍然存在。根據(jù)流行規(guī)律，推測近幾年我國將是流行性腦脊髓膜炎的流行周期。近年來，流行性腦脊髓膜炎的流行還具有菌群漂移的特點(diǎn)，如美國從前為A群流行性腦脊髓膜炎流行，以后為B群流行性腦脊髓膜炎流行，再后來又轉(zhuǎn)為C群流行性腦脊髓膜炎流行，目前則轉(zhuǎn)為Y群流行。我國的流行性腦脊髓膜炎流行主要以A群為主。隨著A群流腦多糖疫苗的廣泛使用，人群對A群流腦雙球菌具有一定的免疫力，由A群流腦雙球菌引起的流行性腦脊髓膜炎比例呈逐年下降趨勢，而由C群及其他群流腦雙球菌引起的流行性腦脊髓膜炎病例逐年上升。最近幾年C群流行性腦脊髓膜炎局部爆發(fā)偶有發(fā)生，去年12月至今年1月安徽省11市共發(fā)生C群流行性腦脊髓膜炎病例 60例，死亡8例。福建省去年底也發(fā)生4例C群流行性腦脊髓膜炎。從流行趨勢看，C群流行性腦脊髓膜炎發(fā)病例數(shù)逐年增多，發(fā)病范圍逐漸擴(kuò)大。此外，也不排除非洲國家流行的 W135群流行性腦脊髓膜炎，美國流行的Y群等流行性腦脊髓膜炎輸入我國的可能性。在非洲和亞洲都存在流行性腦脊髓膜炎流行帶，過去也都以A群流行性腦脊髓膜炎流行為主， 但非洲流行性腦脊髓膜炎流行帶已轉(zhuǎn)為W135群流行為主，A群流行為輔的現(xiàn)象。隨著國際間交流的增加，人員流動(dòng)頻繁，在國外流行的Y型和W135型流腦輸入我國的可能性也在增加。因此，研制(A+C+Y+W135)四價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供四價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，該制備工藝可以制備得到的四價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗，為四價(jià)疫苗，注射一針即有多種免疫效用； 并且該疫苗安全性和各項(xiàng)檢定參數(shù)都符合標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是四價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，其特征在于，包括如下步驟
(1)選用菌種生產(chǎn)用菌種為A群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種、C群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種、 Y群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種；
(2)種子批的建立及傳代將1支原始種子凍干菌種開啟后，接種在10%羊血瓊脂培養(yǎng)基上，放于35 37°C、5 10% 二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)16 20小時(shí)傳第二代，將第二代培養(yǎng)物采入無菌脫脂牛奶中，混勻凍干制備主代種子批；再將1支主種子批菌種開啟后，接種在 10%羊血瓊脂培養(yǎng)基上，放于35 37°C、5 10% 二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)16 20小時(shí)傳第二代，凍干為工作種子批；所述主種子批和所述工作種子批菌種凍干后進(jìn)行生物學(xué)特性檢定， 所述主種子批和所述工作種子批菌種的生物學(xué)特性與原始種子批菌種一致；
(3)生產(chǎn)疫苗原液開啟工作種子批菌種1支，接種于10%羊血瓊脂培養(yǎng)基制備第一代， 將第1代菌種接種于改良半綜合固體培養(yǎng)基，繼續(xù)傳代第2代，將第2代菌種接種于改良半綜合固體培養(yǎng)基，繼續(xù)傳代第3代，將第3代菌種接種于改良半綜合液體培養(yǎng)基，繼續(xù)傳代第4代，繼續(xù)將第4代菌種接種至大罐培養(yǎng)，大罐培養(yǎng)為第5代，第5代的大罐培養(yǎng)為改良半綜合液體培養(yǎng)基；第5代大罐培養(yǎng)的培養(yǎng)物生產(chǎn)疫苗原液，每1支工作種子用于1批疫苗原液生產(chǎn)；所述第5代大罐培養(yǎng)采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)；
(4)收獲及殺菌于對數(shù)生長期的后期或靜止期的前期收獲終止培養(yǎng)，終止培養(yǎng)時(shí)取樣進(jìn)行純菌試驗(yàn)，合格后在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液至終濃度按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為1%，殺菌 30分鐘；
(5)去菌體將已殺菌的培養(yǎng)液經(jīng)HOOOrpm管式連續(xù)流離心機(jī)離心，離心流速為 1500 1600ml/min,收集上清液；
(6)沉淀、解離所述步驟(5)收集的上清液，加入10%十六烷基三甲基溴化銨至終濃度按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為0. 1%，充分混勻，A群靜置3 5小時(shí)，Y群靜置5 8小時(shí)，C、W135群靜置8 12小時(shí)；以14000rpm管式連續(xù)流離心機(jī)離心，離心流速為2000 2500ml/min,離心后收集沉淀物；將收集的沉淀物用lmol/LCaCl2研磨均勻，得到混勻的多糖復(fù)合物；將所述混勻的多糖復(fù)合物收集于瓶中，放在磁力攪拌器上，攪拌1小時(shí)，使多糖與十六烷基三甲基溴化銨充分解離；
(7)去核酸在多糖復(fù)合物中加入2 8°C冷卻過的95%的乙醇至終濃度按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為25%，搖勻，2 8°C存放，A群多糖靜置存放1 3小時(shí)，C群和W135群靜置存放16 20小時(shí)，Y群多糖靜置存放10 14小時(shí)；4000rpm離心30分鐘，去沉淀，收集上清液；
(8)沉淀收集多糖于上述上清液中加入2 8°C冷卻過95%乙醇至最終濃度為A群按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為80% ；C群、Y群及W135群按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為75%，充分振搖，待沉淀出現(xiàn)后靜置1 2小時(shí)；4000rpm離心5分鐘收集沉淀；用無水乙醇和丙酮洗滌2次以上，收集多糖沉淀，壓縮空氣風(fēng)干；干燥沉淀物即為多糖粗制品；保存在-20°C或以下，待純化；
(9)超濾膜過程去除雜蛋白和內(nèi)毒素將所述步驟(8)得到的多糖粗制品溶解于1/ 10飽和中性乙酸鈉溶液中，A群使其濃度達(dá)15 20mg / ml，C群、Y群和W135群使其濃度達(dá)10 15mg / ml ；用截留分子量為6000道爾頓的超濾膜進(jìn)行超濾，使雜蛋白和內(nèi)毒素被截留在超濾膜上從而被去除掉，收集超濾液為收獲液；
(10)沉淀精多糖將步驟(10)收集的收獲液中加入95%的乙醇至終濃度為A群按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為80%，C群、Y群及W135群按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為75% ；充分搖勻，置冷庫2 8°C 1小時(shí)， 4000rpm 10分鐘離心收集沉淀物；用無水乙醇和丙酮洗滌2次以上，收集多糖沉淀，壓縮空氣風(fēng)干，干燥沉淀物即為精多糖，保存在-20°C或以下；提取過程在15°C以下進(jìn)行。用無菌注射用水溶解精多糖，經(jīng)除菌過濾后即為原液，要求過濾前后0. 2Mm濾膜完整性試驗(yàn)合格， 原液取樣后進(jìn)行檢定；
(11)半成品配制合并單批或兩批以上的原液后即為半成品，用無菌無熱原乳糖和滅菌注射用水稀釋至含A群、C群、Y群、W135群多糖分別為100.0yg/ml，乳糖為20mg/ml ；稀釋后立即經(jīng)0. 2μπι過濾，過濾抽樣送檢，于2 8°C保存；
(12)分裝、凍干，制備疫苗成品上述半成品采用洗烘灌聯(lián)動(dòng)機(jī)組分裝，玻璃管制注射劑瓶盛裝，分裝規(guī)格為0. 5ml/瓶，分裝過程中自動(dòng)加鹵化丁基橡膠塞，分裝完成后，在分裝后6小時(shí)內(nèi)凍干；凍干完成即進(jìn)行真空壓塞和軋蓋；完成軋蓋的制品進(jìn)行透視檢查及貼簽；完成貼簽的制品即凍干疫苗成品，送2 8°C冷庫保存。進(jìn)一步的，所述步驟(4)菌體培養(yǎng)達(dá)到對數(shù)生長期的后期或靜止期的前期的判斷方法為，細(xì)菌濃度不再增加，達(dá)到160億/ml或pH開始回升至7. 0 7. 5。進(jìn)一步的，所述步驟(3)大罐培養(yǎng)的培養(yǎng)條件培養(yǎng)基量為300 600L，通氣量為 10 30m3/h，攪拌速度為200 ;350rpm,用20%Na0H溶液維持pH在6. 70 7. 40 ；在培養(yǎng)過程中，進(jìn)行菌液濃度測定和革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，121°C，30min滅菌處理后廢棄。進(jìn)一步的，所述10%羊血瓊脂培養(yǎng)基的配方為以IOOml計(jì)，含有羊血IOml ；瓊脂培養(yǎng)基100 ml。進(jìn)一步的，所述改良半綜合固體培養(yǎng)基的配方為以IOOOml計(jì)，含有
50%鹽酸酪素水解液或鹽酸水解酪蛋白按總氮計(jì)算為1300mg ；洲鹽酸酪素水解液按總氮計(jì)算為1300mg ；酵母透析液50ml ；淀粉5g ；磷酸二氫鉀Ig ；硫酸鎂0. 6g ；葡萄糖2g ；瓊脂 26go進(jìn)一步的，所述改良半綜合液體培養(yǎng)基由甲液和乙液構(gòu)成，以10000ml計(jì)的配方為所述甲液包括 50%鹽酸酪素水解液或鹽酸水解酪蛋白按總氮計(jì)算為13000mg ；酵母透析液IOOml ；氯化鉀IOg ；L-谷氨酸鈉IOg ；氯化銨12. 5g ；十二水合磷酸氫二鈉7. 5g ；磷酸二氫鈉2. 5g ； 10%胱氨酸溶液3ml ；所述乙液包括硫酸鎂6g和葡萄糖55g。綜上所述，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明采用了超濾膜過程實(shí)現(xiàn)了一步法同時(shí)去除去除雜蛋白和內(nèi)毒素的目的；不僅確保了本發(fā)明制備得到的ACYW135四價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗的純度和免疫活性符合標(biāo)準(zhǔn)，減少了制備工藝的經(jīng)濟(jì)成本。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1 ACYW135四價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗的制備四價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，包括如下步驟
(1)選用菌種生產(chǎn)用菌種為A群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種、C群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種、 Y群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種；
(2)種子批的建立及傳代生產(chǎn)用菌種應(yīng)建立種子批系統(tǒng)。原始種子批應(yīng)驗(yàn)明其記錄、 歷史、來源和生物學(xué)特性。將1支原始種子凍干菌種開啟后，接種在10%羊血瓊脂培養(yǎng)基上， 放于35 37°C、5 10% 二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)16 20小時(shí)，在35 37°C條件下傳第二代， 將第二代培養(yǎng)物采入無菌脫脂牛奶中混勻凍干制備主代種子批。再將1支主種子批菌種開啟后，采用上述相同條件培養(yǎng)傳至第二代，擴(kuò)增后凍干為工作種子批。主種子批和工作種子批菌種凍干后均必須進(jìn)行生物學(xué)特性檢定，主種子批和工作種子批菌種的各種生物學(xué)特性應(yīng)與原始種子批菌種一致。主種子批菌種用于生產(chǎn)工作種子批，工作種子批用于生產(chǎn)疫苗。 主種子批由原始種子批開啟后傳2代制備，主種子批開啟后傳2代制備工作種子批；工作種子批開啟后傳4代制備生產(chǎn)用種子。工作種子批開啟后至接種發(fā)酵罐培養(yǎng)傳代次數(shù)不得超過5代。(3)生產(chǎn)疫苗原液開啟工作種子批菌種1支，接種于10%羊血瓊脂培養(yǎng)基2支， 放35 37°C、5 10% 二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)16 20小時(shí)，涂片鏡檢合格，將第1代菌種接種于改良半綜合固體培養(yǎng)基4 6瓶，繼續(xù)傳代第2代，于35 37°C、5 10% 二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)10 18小時(shí)，涂片鏡檢合格后將第2代菌種接種于改良半綜合固體培養(yǎng)基20 25 瓶，繼續(xù)傳代第3代，于35 37°C培養(yǎng)10 18小時(shí)，涂片鏡檢合格后將第3代菌種接種于改良半綜合液體培養(yǎng)基30 40 L，繼續(xù)傳代第4代，繼續(xù)將第4代，于35 37°C深層通氣攪拌培養(yǎng)3 8小時(shí)，涂片鏡檢及細(xì)菌濃度測定合格后將將第4代菌種作為生產(chǎn)用種子接種至大罐培養(yǎng)。所述大罐培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，培養(yǎng)基為改良半綜合液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基量為300 600L。于大罐培養(yǎng)基中接種第4代生產(chǎn)用種子后，深層通氣攪拌培養(yǎng)。通氣量為10 30m3/h，攪拌速度為200 350rpm。用20%Na0H溶液維持pH 在6. 70 7. 40范圍。在培養(yǎng)過程中，進(jìn)行菌液濃度測定和革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，應(yīng)121°C 30min滅菌處理后廢棄。大罐培養(yǎng)的培養(yǎng)物生產(chǎn)疫苗原液，每1支工作種子用于1批疫苗原液生產(chǎn)。(4)收獲及殺菌于對數(shù)生長期的后期或靜止期的前期收獲終止培養(yǎng)，終止培養(yǎng)時(shí)取樣進(jìn)行純菌試驗(yàn)，合格后在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液至終濃度按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為1%， 殺菌30分鐘；于對數(shù)生長期的后期或靜止期的前期收獲終止培養(yǎng)，A群、C群及W135群培養(yǎng)一般為6.5 士 1小時(shí)，Y群培養(yǎng)一般為11 士 3小時(shí)，當(dāng)細(xì)菌濃度不再增加，達(dá)到160億/ml或PH開始回升至7. 0 7. 5時(shí)即可終止培養(yǎng)，終止培養(yǎng)時(shí)取樣進(jìn)行純菌試驗(yàn)，在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液至終濃度1% (V/V)，殺菌30分鐘。(5)去菌體將已殺菌的培養(yǎng)液經(jīng)HOOOrpm管式連續(xù)流離心機(jī)離心，離心流速為 1500 1600ml/min,收集上清液。(6)沉淀、解離所述步驟(5)收集的上清液，加入10%十六烷基三甲基溴化銨至終濃度按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為0. 1%，充分混勻，A群靜置3 5小時(shí)，Y群靜置5 8小時(shí)，C、W135 群靜置8 12小時(shí)；以HOOOrpm管式連續(xù)流離心機(jī)離心，離心流速為2000 2500ml/min， 離心后收集沉淀物；將收集的沉淀物用lmol/LCaCl2研磨均勻，得到混勻的多糖復(fù)合物；將所述混勻的多糖復(fù)合物收集于瓶中，放在磁力攪拌器上，攪拌1小時(shí)，使多糖與十六烷基三甲基溴化銨充分解離。(7)去核酸在多糖復(fù)合物中加入2 8°C冷卻過的95%的乙醇至終濃度按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為25%，搖勻，2 8°C存放，A群多糖靜置存放1 3小時(shí)，C群和W135群靜置存放 16 20小時(shí)，Y群多糖靜置存放10 14小時(shí)；4000rpm離心30分鐘，去沉淀，收集上清液；
(8)沉淀收集多糖于上述上清液中加入2 8°C冷卻過95%乙醇至最終濃度為A群按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為80% ；C群、Y群及W135群按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為75%，充分振搖，待沉淀出現(xiàn)后靜置1 2小時(shí)；4000rpm離心5分鐘收集沉淀；用無水乙醇和丙酮洗滌2次以上，收集多糖沉淀，壓縮空氣風(fēng)干；干燥沉淀物即為多糖粗制品；保存在-20°C或以下，待純化。(9)超濾膜過程去除雜蛋白和內(nèi)毒素將所述步驟(8)得到的多糖粗制品溶解于 1 / 10飽和中性乙酸鈉溶液中，A群使其濃度達(dá)15 20mg / ml，C群、Y群和W135群使其濃度達(dá)10 15mg / ml ；用截留分子量為6000道爾頓的超濾膜進(jìn)行超濾，使雜蛋白和內(nèi)毒素被截留在超濾膜上從而被去除掉，收集超濾液為收獲液。所述超濾運(yùn)行壓力為200kPa，超濾膜過程實(shí)現(xiàn)了一步法去除雜蛋白和內(nèi)毒素的效果，因此工藝步驟較少，并且減少了對抗原的破壞。經(jīng)超濾膜過程處理后A、C群多糖中雜蛋白含量分別< 10mg/g，Y群多糖中雜蛋白含量<35.6mg/g，W135群多糖中雜蛋白含量 < 35. 2mg/g, A、C、Y及W135群多糖內(nèi)毒素含量分別< 12 EU/μ g，抗原回收率A群多糖 > 65. 2%, C群多糖> 75. 5%, Y及Wl!35群多糖分別> 80%。(10)沉淀精多糖將步驟(10)收集的收獲液中加入95%的乙醇至終濃度為A群按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為80%，C群、Y群及W135群按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為75%;充分搖勻，置冷庫2 8°C 1 小時(shí)，4000rpm，10分鐘離心收集沉淀物；用無水乙醇和丙酮洗滌2次以上，收集多糖沉淀， 壓縮空氣風(fēng)干，干燥沉淀物即為精多糖，保存在-20°C或以下；提取過程在15°C以下進(jìn)行。 用無菌注射用水溶解精多糖，經(jīng)除菌過濾后即為原液，要求過濾前后0. 2Mm濾膜完整性試驗(yàn)合格，原液取樣后進(jìn)行檢定；
(11)半成品配制合并單批或兩批以上的原液后即為半成品，用無菌無熱原乳糖和滅菌注射用水稀釋至含A群、C群、Y群、W135群多糖分別為100.0yg/ml，乳糖為20mg/ml ；稀釋后立即經(jīng)0. 2μπι過濾，過濾抽樣送檢，于2 8°C保存；
(12)分裝、凍干，制備疫苗成品上述半成品采用洗烘灌聯(lián)動(dòng)機(jī)組分裝，玻璃管制注射劑瓶盛裝，分裝規(guī)格為0. 5ml/瓶，分裝過程中自動(dòng)加鹵化丁基橡膠塞，分裝完成后，在分裝后6小時(shí)內(nèi)凍干；凍干完成即進(jìn)行真空壓塞和軋蓋；完成軋蓋的制品進(jìn)行透視檢查及貼簽；完成貼簽的制品即凍干疫苗成品，送2 8°C冷庫保存。所述透視檢查采用目測法逐瓶透檢，剔除脫蓋、裝量、空瓶、破瓶、異物、萎縮等外觀不合格產(chǎn)品。透視檢查環(huán)境溫度不得高于 30°C，檢查完成及時(shí)進(jìn)行貼簽。采用貼標(biāo)機(jī)進(jìn)行貼簽，每瓶疫苗貼上(ACYW13Q四價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗標(biāo)簽1張，完成貼簽的制品及時(shí)送2 8°C冷庫保存待包裝。整個(gè)透視檢查及貼簽過程環(huán)境溫度不得高于30°C。本發(fā)明疫苗制備工藝的原液生產(chǎn)收率開啟1支工作種子按每100L大罐培養(yǎng)量計(jì)可制造出粗制多糖A群16 51g、(群9 四8、￥群2 6g、W1!35群3 9g。本發(fā)明疫苗制備工藝每批精多糖的收率=(收得精多糖量)/ (精制前投入的粗多糖量)X 100%，從粗多糖至精多糖的提取純化過程的收率各群分別為A群35 59%、C群 41 57%、Y 群 35 79%、W135 群 29 77%。實(shí)施例2 生產(chǎn)用培養(yǎng)基
上述制備工藝過程使用的培養(yǎng)基如下
生產(chǎn)用種子的制備第1代為10%羊血瓊脂培養(yǎng)基，第2代至第3代為改良半綜合固體培養(yǎng)基，第4代的生產(chǎn)用種子菌種制備以及第5代的大罐培養(yǎng)為改良半綜合液體培養(yǎng)基。生產(chǎn)用的改良半綜合液體培養(yǎng)基不含有能與加入的十六烷基三甲基溴化銨形成沉淀的成分， 不含有對人體有害或其他過敏原物質(zhì)。a 10%羊血瓊脂培養(yǎng)基
物料名稱配方(以IOOml為例計(jì))羊血IOml瓊脂培養(yǎng)基IOOml
b改良半綜合固體培養(yǎng)基的配方(以IOOOml為例計(jì))見下表
物料名稱配方(以IOOOml為例計(jì))50%鹽酸酪素水解液或鹽酸水解酪蛋白I3OOmg(按總氮計(jì)算)2%鹽酸酪素水解液I3OOmg(按總氮計(jì)算)酵母透析液50ml淀粉5g磷酸二氫鉀Ig硫酸鎂0.6g葡萄糖2g瓊脂26g
c流腦半綜合液體培養(yǎng)基的配方(以10000ml為例計(jì))見下表
權(quán)利要求
1.四價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，其特征在于，包括如下步驟(1)選用菌種生產(chǎn)用菌種為A群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種、C群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種、 Y群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種；(2)種子批的建立及傳代將1支原始種子凍干菌種開啟后，接種在10%羊血瓊脂培養(yǎng)基上，放于35 37°C、5 10% 二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)16 20小時(shí)傳第二代，將第二代培養(yǎng)物采入無菌脫脂牛奶中，混勻凍干制備主代種子批；再將1支主種子批菌種開啟后，接種在 10%羊血瓊脂培養(yǎng)基上，放于35 37°C、5 10% 二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)16 20小時(shí)傳第二代，凍干為工作種子批；所述主種子批和所述工作種子批菌種凍干后進(jìn)行生物學(xué)特性檢定， 所述主種子批和所述工作種子批菌種的生物學(xué)特性與原始種子批菌種一致；(3)生產(chǎn)疫苗原液開啟工作種子批菌種1支，接種于10%羊血瓊脂培養(yǎng)基制備第一代， 將第1代菌種接種于改良半綜合固體培養(yǎng)基，繼續(xù)傳代第2代，將第2代菌種接種于改良半綜合固體培養(yǎng)基，繼續(xù)傳代第3代，將第3代菌種接種于改良半綜合液體培養(yǎng)基，繼續(xù)傳代第4代，繼續(xù)將第4代菌種接種至大罐培養(yǎng)，大罐培養(yǎng)為第5代，第5代的大罐培養(yǎng)為改良半綜合液體培養(yǎng)基；第5代大罐培養(yǎng)的培養(yǎng)物生產(chǎn)疫苗原液，每1支工作種子用于1批疫苗原液生產(chǎn)；所述第5代大罐培養(yǎng)采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)；(4)收獲及殺菌于對數(shù)生長期的后期或靜止期的前期收獲終止培養(yǎng)，終止培養(yǎng)時(shí)取樣進(jìn)行純菌試驗(yàn)，合格后在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液至終濃度按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為1%，殺菌 30分鐘；(5)去菌體將已殺菌的培養(yǎng)液經(jīng)HOOOrpm管式連續(xù)流離心機(jī)離心，離心流速為 1500 1600ml/min,收集上清液；(6)沉淀、解離所述步驟(5)收集的上清液，加入10%十六烷基三甲基溴化銨至終濃度按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為0. 1%，充分混勻，A群靜置3 5小時(shí)，Y群靜置5 8小時(shí)，C、W135群靜置8 12小時(shí)；以14000rpm管式連續(xù)流離心機(jī)離心，離心流速為2000 2500ml/min,離心后收集沉淀物；將收集的沉淀物用lmol/LCaCl2研磨均勻，得到混勻的多糖復(fù)合物；將所述混勻的多糖復(fù)合物收集于瓶中，放在磁力攪拌器上，攪拌1小時(shí)，使多糖與十六烷基三甲基溴化銨充分解離；(7)去核酸在多糖復(fù)合物中加入2 8°C冷卻過的95%的乙醇至終濃度按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為25%，搖勻，2 8°C存放，A群多糖靜置存放1 3小時(shí)，C群和W135群靜置存放16 20小時(shí)，Y群多糖靜置存放10 14小時(shí)；4000rpm離心30分鐘，去沉淀，收集上清液；(8)沉淀收集多糖于上述上清液中加入2 8°C冷卻過95%乙醇至最終濃度為A群按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為80% ；C群、Y群及W135群按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為75%，充分振搖，待沉淀出現(xiàn)后靜置1 2小時(shí)；4000rpm離心5分鐘收集沉淀；用無水乙醇和丙酮洗滌2次以上，收集多糖沉淀，壓縮空氣風(fēng)干；干燥沉淀物即為多糖粗制品；保存在-20°C或以下，待純化；(9)超濾膜過程去除雜蛋白和內(nèi)毒素將所述步驟(8)得到的多糖粗制品溶解于1/ 10飽和中性乙酸鈉溶液中，A群使其濃度達(dá)15 20mg / ml，C群、Y群和W135群使其濃度達(dá)10 15mg / ml ；用截留分子量為6000道爾頓的超濾膜進(jìn)行超濾，使雜蛋白和內(nèi)毒素被截留在超濾膜上從而被去除掉，收集超濾液為收獲液；(10)沉淀精多糖將步驟(10)收集的收獲液中加入95%的乙醇至終濃度為A群按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為80%，C群、Y群及W135群按體積分?jǐn)?shù)計(jì)為75% ；充分搖勻，置冷庫2 8°C 1小時(shí)，4000rpm 10分鐘離心收集沉淀物；用無水乙醇和丙酮洗滌2次以上，收集多糖沉淀，壓縮空氣風(fēng)干，干燥沉淀物即為精多糖，保存在-20°C或以下；提取過程在15°C以下進(jìn)行；用無菌注射用水溶解精多糖，經(jīng)除菌過濾后即為原液，要求過濾前后0. 2Mm濾膜完整性試驗(yàn)合格， 原液取樣后進(jìn)行檢定；(11)半成品配制合并單批或兩批以上的原液后即為半成品，用無菌無熱原乳糖和滅菌注射用水稀釋至含A群、C群、Y群、W135群多糖分別為100.0yg/ml，乳糖為20mg/ml ；稀釋后立即經(jīng)0. 2μπι過濾，過濾抽樣送檢，于2 8°C保存；(12)分裝、凍干，制備疫苗成品上述半成品采用洗烘灌聯(lián)動(dòng)機(jī)組分裝，玻璃管制注射劑瓶盛裝，分裝規(guī)格為0. 5ml/瓶，分裝過程中自動(dòng)加鹵化丁基橡膠塞，分裝完成后，在分裝后6小時(shí)內(nèi)凍干；凍干完成即進(jìn)行真空壓塞和軋蓋；完成軋蓋的制品進(jìn)行透視檢查及貼簽；完成貼簽的制品即凍干疫苗成品，送2 8°C冷庫保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，其特征在于，所述步驟(4)菌體培養(yǎng)達(dá)到對數(shù)生長期的后期或靜止期的前期的判斷方法為，細(xì)菌濃度不再增加， 達(dá)到160億/ml或pH開始回升至7. 0 7. 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2任一項(xiàng)所述的四價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，其特征在于， 所述步驟(3)大罐培養(yǎng)的培養(yǎng)條件培養(yǎng)基量為300 600L，通氣量為10 30m3/h，攪拌速度為200 350rpm，用20%Na0H溶液維持pH在6. 70 7. 40 ；在培養(yǎng)過程中，進(jìn)行菌液濃度測定和革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，121°C，30min滅菌處理后廢棄。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的四價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，其特征在于，所述10% 羊血瓊脂培養(yǎng)基的配方為以IOOml計(jì)，含有羊血IOml ；瓊脂培養(yǎng)基100 ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的四價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，其特征在于，所述改良半綜合固體培養(yǎng)基的配方為以IOOOml計(jì)，含有50%鹽酸酪素水解液或鹽酸水解酪蛋白按總氮計(jì)算為1300mg ；洲鹽酸酪素水解液按總氮計(jì)算為1300mg ；酵母透析液50ml ；淀粉5g ；磷酸二氫鉀Ig ；硫酸鎂0. 6g ；葡萄糖2g ；瓊脂26g。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的四價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，其特征在于，所述改良半綜合液體培養(yǎng)基由甲液和乙液構(gòu)成，以10000ml計(jì)的配方為所述甲液包括50%鹽酸酪素水解液或鹽酸水解酪蛋白按總氮計(jì)算為13000mg ； 酵母透析液IOOml ； 氯化鉀IOg ；L-谷氨酸鈉IOg; 氯化銨12. 5g ；十二水合磷酸氫二鈉7. 5g ； 磷酸二氫鈉2. 5g ； 10%胱氨酸溶液3ml ； 所述乙液包括硫酸鎂6g和葡萄糖55g。
全文摘要
本發(fā)明公開四價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗的制備工藝，包括如下步驟選用菌種；種子批的建立及傳代；生產(chǎn)疫苗原液；收獲及殺菌;去菌體；沉淀、解離；去核酸；沉淀收集多糖；超濾膜過程去除雜蛋白和內(nèi)毒素；沉淀精多糖；半成品配制；分裝、凍干，制備疫苗成品。該制備工藝可以制備得到的四價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗為四價(jià)疫苗，注射一針即有多種免疫效用；并且該疫苗安全性和各項(xiàng)檢定參數(shù)都符合標(biāo)準(zhǔn)。
文檔編號A61P31/04GK102327605SQ201110245718
公開日2012年1月25日 申請日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月25日
發(fā)明者侯文禮, 廖常如, 張濤, 鐘澤榮 申請人:成都康華生物制品有限公司