專利名稱：蒼術(shù)總萜醇提取物在制備抗幽門螺桿菌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蒼術(shù)總萜醇提取物，尤其涉及在制備抗幽門螺桿菌藥物中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蒼術(shù)具有悠久的臨床應(yīng)用歷史，中醫(yī)認(rèn)為其性溫，味辛、苦，歸脾、胃、肝經(jīng)，具有健脾燥濕的作用，主要用于濕困脾土、脘痞腹脹、食欲不振、嘔吐、腹瀉、瘧疾、痰飲、水腫等癥的治療。健脾燥濕是中醫(yī)治療消化性潰瘍的常用治法之一。蒼術(shù)總萜醇提取物為從菊科植物茅蒼術(shù)干燥根莖中提取得到的以茅術(shù)醇和P-桉葉醇為主要活性成分的總萜醇，臨床擬用于消化性潰瘍。消化性潰瘍會(huì)導(dǎo)致胃酸分泌過多，胃粘膜的抵抗力下降，或兩者兼而有之。消化性 潰瘍形成的主要原因是當(dāng)胃酸的分泌相對(duì)地超過了胃分泌的粘液對(duì)胃的保護(hù)能力和(或)堿性的十二指腸液中和胃酸的能力時(shí)，含有胃蛋白酶和低PH值的胃液會(huì)使胃壁消化，就會(huì)發(fā)生消化性潰瘍。利用現(xiàn)代藥理研究，對(duì)蒼術(shù)有效成分的胃潰瘍藥效篩選證實(shí)，蒼術(shù)總萜醇提取物中茅術(shù)醇對(duì)H+，K+-ATP酶有較強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)茅術(shù)醇濃度到達(dá)1. 0 X 10_5M，就對(duì)H+，K+-ATP酶產(chǎn)生抑制作用，當(dāng)茅術(shù)醇濃度為4. 0 X 10_4M則能完全抑制H+，K+-ATP酶，其對(duì)Na+-ATP酶，Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、H+-ATP酶亦有一定的抑制作用。茅術(shù)醇、P -桉葉醇對(duì)幽門結(jié)扎潰瘍、阿司匹林所致的胃潰瘍均有抑制作用。然而，茅術(shù)醇和￠-桉葉醇抗?jié)儥C(jī)理并不一致，茅術(shù)醇是質(zhì)子泵抑制劑，3 -桉葉醇是組胺H2受體阻斷劑，兩個(gè)倍半萜醇類化合物協(xié)同作用而抑制胃液分泌，從而發(fā)揮抗?jié)兊淖饔?。消化性潰瘍的主要原因之一是幽門螺桿菌，幽門螺桿菌感染是慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年世界衛(wèi)生組織/國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將幽門螺桿菌定為I類致癌原。目前國內(nèi)外常用的抗幽門螺桿菌藥物有胃復(fù)春片、羥氨芐青霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、呋喃唑酮、有機(jī)鉍、胃得樂、樂得胃等，但由于口服，胃酸的環(huán)境使藥效大大受到影響。目前，消化性潰瘍采用質(zhì)子泵抑制劑或H2受體拮抗劑聯(lián)合兩種抗生素的“三聯(lián)療法”原則，療程一般為2周，但又有耐藥性問題的產(chǎn)生。因此，替換性治療或預(yù)防策略值得重視。感染幽門螺桿菌(HP)會(huì)導(dǎo)致慢性胃炎和腸胃潰瘍病。如今，領(lǐng)域內(nèi)已有如下共識(shí)(1)胃黏膜正常的志愿者，口服HP混懸液可造成胃炎癥狀和病理改變。(2)患慢性胃炎時(shí)HP檢出率非常高，而胃黏膜正常者則不能檢出此菌。(3)慢性胃炎病人血清中HP抗體明顯增高，胃液中可檢出抗HP免疫球蛋白，這表明HP是有致病性的抗原(病原體)。(4)針對(duì)HP進(jìn)行治療，會(huì)使慢性胃炎病人胃黏膜明顯改善。(5)60%-80%的胃潰瘍和70%-100%的十二指腸潰瘍病人的胃竇部可檢出HP，血清學(xué)檢查證實(shí)，這些人血清HP抗體滴度較高。(6)用傳統(tǒng)抗?jié)兯幬镏委煙o效的難治性潰瘍，改用抗HP藥物治療后，大多數(shù)潰瘍能愈合。(7)用HP感染恒河猴，能讓之發(fā)生慢性胃炎，胃黏膜的病理改變與人類感染相似，即制備HP胃炎動(dòng)物模型獲得了成功。以上說明，HP與慢性胃病有相關(guān)性是確鑿無疑的。HP肯定是慢性胃炎的致病菌，與潰瘍病和胃癌關(guān)系也極為密切。即是說，HP是引發(fā)慢性胃病的元兇和罪魁禍?zhǔn)住?br> 申請(qǐng)人的中國專利申請(qǐng)200810239177.1名稱為蒼術(shù)總萜醇提取物及其制備方法和用途的后續(xù)發(fā)明。中國專利申請(qǐng)200810239177.1公開了蒼術(shù)總萜醇提取物為通過提取、精制步驟從菊科植物蒼術(shù)Atractylis Iancea和/或Atractylodes chinensis (Atractylodes lancea DC. var. chinensis Kitam.)的干燥根莖中獲得的富含蒼術(shù)倍半萜醇的提取物，所述蒼術(shù)總萜醇提取物的組成成分為(I)蒼術(shù)醇的含量范圍為65% 95%重量，其中，所述蒼術(shù)醇為茅術(shù)醇與β -桉葉醇的混合物，兩者比例為I O. 5 2 ;(2)蒼術(shù)素的含量為2. 5% 20%重量；以及(3)余量的其他倍半萜醇類、倍半萜烯及聚炔類化合物；其中，倍半萜烯的總含量不超過2%重量。上述的總萜醇提取物可以有效保留和突出提取物的藥理藥效學(xué)作用，同時(shí)也大幅度降低提取物的急性毒性以及與刺激性相關(guān)的副作用。
綜上所述，目前技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)認(rèn)為，蒼術(shù)總萜醇提取物中的茅術(shù)醇和桉葉醇具有抑制H+，Κ+-ΑΤΡ酶的作用，以發(fā)揮抑制胃酸分泌的作用，從而達(dá)到抗消化性潰瘍的作用。 然而蒼術(shù)總萜醇提取物具有抗幽門螺桿菌性質(zhì)并未被發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用。這阻礙了蒼術(shù)總萜醇提取物在治療其他胃病以及其他由幽門螺桿菌引發(fā)疾病的藥物研發(fā)與應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蒼術(shù)總萜醇提取物的新用途，即在在制備抗幽門螺桿菌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明人是在驗(yàn)證蒼術(shù)總萜醇提取物具有抑制胃酸分泌作用的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)總萜醇提取物具有抗幽門螺桿菌的作用，且抗菌活性隨培養(yǎng)基PH值的降低而增強(qiáng)。 本發(fā)明所述的蒼術(shù)總萜醇提取物為通過提取、精制步驟從菊科植物蒼術(shù)的干燥根莖中獲得的富含蒼術(shù)倍半萜醇的提取物。
所述蒼術(shù)總萜提取物的組成成分為
(I)蒼術(shù)醇的含量范圍為509Γ90%重量，其中，所述蒼術(shù)醇為茅術(shù)醇與β-桉葉醇的混合物，兩者比例為1:0. 5^2；
(2)蒼術(shù)素的含量為2· 5°/Γ20%重量；以及
(3)余量的其他倍半萜醇類、倍半萜烯及聚炔類化合物；其中，倍半萜烯的含量不超過2%重量。
其具有體外抗幽門螺旋桿菌的活性，其活性隨培養(yǎng)基pH值條件的降低而增強(qiáng)。該提取物從具有悠久應(yīng)用歷史的中藥材中得到，副作用小。
蒼術(shù)總萜醇提取物對(duì)臨床分離的幽門螺旋桿菌有體外抑制作用，蒼術(shù)總萜醇提取物 70% (蒼術(shù)醇含量 70%)的 MIC 范圍為 O. 16 2. 56mg/ml, MIC50 值為 O. 64mg/ml, MIC90 值為2. 56mg/ml。當(dāng)培養(yǎng)基PH條件由7. 2降低至2. O時(shí)，蒼術(shù)總萜醇提取物對(duì)幽門螺旋桿菌的抗菌活性增強(qiáng)，其MIC5。值由O. 64mg/ml降低至O. 32mg/ml, MIC9。值由2. 56mg/ml降低至O.64mg/ml
本發(fā)明的積極效果是蒼術(shù)總萜醇提取物不僅具有抑制胃酸分泌的作用，而且具有抗幽門螺旋桿菌的活性，抗菌活性隨培養(yǎng)基PH值得降低而增強(qiáng)，阻斷消化性潰瘍兩大致病因素，即胃酸分泌過多和幽門螺旋桿菌。
具體實(shí)施例方式下面將描述本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容完全不局限于此。(幾個(gè)提取物制備方法相同，成品含量近似，刪除了原來的實(shí)施例1)實(shí)施例1蒼術(shù)總萜醇提取物的制備采用生品矛蒼術(shù)干燥根莖，粉碎，過篩2kg，放進(jìn)蒸餾裝置中，加正己烷IOL回流提取lh，提取3次，合并提取液，減壓回收溶劑得油狀提取物。然后減壓(精餾精制設(shè)置精餾塔塔柱直徑80mm，填料2. 0X2. Omm的高效不銹鋼0環(huán)，有效填料段高度1. 5m ;塔釜容積5L，采用外循環(huán)導(dǎo)熱油系統(tǒng)加熱，加熱總功率20kw，功率可調(diào)；塔頂冷凝器為蛇管式，換熱面積0. 5m2 ;真空泵，抽氣速率lOL/s，極限真空20Pa)。蒼術(shù)水蒸氣蒸餾提取物200·g，裝入塔釜，循環(huán)水冷卻，抽真空，使系統(tǒng)壓カ維持在8mmHg，外循環(huán)導(dǎo)熱油系統(tǒng)加熱使塔釜梯度升溫。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，收集12(T180°C餾分。經(jīng)GC-MS測(cè)定蒼術(shù)總萜醇提取物(茅術(shù)醇和^ -桉葉醇兩者含量之和)含量為77. 5%。均質(zhì)后，裝入藥瓶密封，消毒制成產(chǎn)品。實(shí)施例2蒼術(shù)總萜醇提取物的制備采用生品矛蒼術(shù)干燥根莖，粉碎，過篩，取2. 5kg。置于ニ氧化碳超臨界萃取設(shè)備中，進(jìn)行連續(xù)萃取3h。萃取條件萃取壓カ為15MPa，萃取溫度為40°C，分離壓カ為5 6MPa，分離溫度為45°C。然后減壓(精餾精制設(shè)置精餾塔塔柱直徑80mm，填料2. 0X2. Omm的高效不銹鋼9環(huán)，有效填料段高度1. 5m;塔釜容積5L，采用外循環(huán)導(dǎo)熱油系統(tǒng)加熱，加熱總功率20kw，功率可調(diào)；塔頂冷凝器為蛇管式，換熱面積0. 5m2 ;真空泵，抽氣速率lOL/s，極限真空20Pa)。蒼術(shù)水蒸氣蒸餾提取物200g，裝入塔釜，循環(huán)水冷卻，抽真空，使系統(tǒng)壓カ維持在8mmHg，外循環(huán)導(dǎo)熱油系統(tǒng)加熱使塔釜梯度升溫。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，收集12(Tl8(TC餾分。經(jīng)GC-MS測(cè)定蒼術(shù)總萜醇提取物(茅術(shù)醇和P -桉葉醇兩者含量之和)含量為89. 6%。均質(zhì)后，裝入藥瓶密封，消毒制成產(chǎn)品。實(shí)施例3蒼術(shù)總萜醇提取物的制備采用炮制矛蒼術(shù)干燥根莖，粉碎，過篩2. 5kg，放進(jìn)蒸餾裝置中，水蒸氣蒸餾提取8h，使油水分離，收集揮發(fā)油。然后減壓(精餾精制設(shè)置精餾塔塔柱直徑80mm，填料2.0X2. Omm的高效不銹鋼0環(huán)，有效填料段高度1. 5m ;塔釜容積5L，采用外循環(huán)導(dǎo)熱油系統(tǒng)加熱，加熱總功率20kw，功率可調(diào)；塔頂冷凝器為蛇管式，換熱面積0. 5m2 ;真空泵，抽氣速率lOL/s，極限真空20Pa)。蒼術(shù)水蒸氣蒸餾提取物200g，裝入塔釜，循環(huán)水冷卻，抽真空，使系統(tǒng)壓カ維持在8mmHg，外循環(huán)導(dǎo)熱油系統(tǒng)加熱使塔釜梯度升溫。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，收集12(Tl80°C餾分。經(jīng)GC-MS測(cè)定蒼術(shù)總萜醇提取物(茅術(shù)醇和P -桉葉醇兩者含量之和)含量為50. 5%。均質(zhì)后，裝入藥瓶密封，消毒制成產(chǎn)品。為更好的理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面將用不同含量蒼術(shù)總萜醇提取物體外抗幽門螺桿菌MIC值測(cè)定試驗(yàn)及結(jié)果說明其在制備抗幽門螺旋桿菌藥物中的應(yīng)用。實(shí)施例4不同蒼術(shù)醇含量的蒼術(shù)總萜醇提取物體外抗幽門螺桿菌MIC值測(cè)定試驗(yàn)內(nèi)容及其結(jié)果如下(I)受試樣品為樣品1-1 :蒼術(shù)總萜醇提取物50%提取物(蒼術(shù)醇含量50%)。樣品1-2 :蒼術(shù)總萜醇提取物70%提取物(蒼術(shù)醇含量70%)。樣品1-3 :蒼術(shù)總萜醇提取物90%提取物(蒼術(shù)醇含量90%)。樣品2:胃復(fù)春片。樣品3:克拉霉素。
(2)實(shí)驗(yàn)菌株選取臨床分離幽門螺桿菌40株，幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43504為質(zhì)控菌株，菌株由三甲醫(yī)院分離并鑒定。(3)試驗(yàn)方法含藥平板的制備樣品I含藥平板的制備精密稱取樣品819. 2mg，置于無菌試管，加入0. 5mlDMS0,輕輕振蕩使全部溶解，繼續(xù)加入無菌水至8ml，得102. 4mg/ml溶液，取4ml加入4ml無菌水，得51. 2mg/ml溶液；同法依次取4ml加入4ml無菌水系列倍比稀釋，得濃度分別為25. 6、12. 8,6. 4,3. 2、1. 6,0. 8,0. 4,0. 2mg/ml 的系列樣品溶液。分別取上述樣品溶液Iml加入9cm無菌平板，加入幽門螺桿菌固體培養(yǎng)基9ml，立即混勻，置水平臺(tái)待凝后得到濃度依次為2. 56、1. 28,0. 64,0. 32,0. 16,0. 08,0. 04,0. 02mg/ml的含藥平板。胃復(fù)春片含藥平板制備取胃復(fù)春片五片，無菌操作研磨成細(xì)粉末，精密稱取 1024mg,加入無菌水10ml，置60°C水浴恒溫2小時(shí)，于4°C冰箱放置24小時(shí)，無菌操作濾除殘?jiān)?，?00°C加熱15分鐘滅菌，補(bǔ)足無菌水至10ml，得相當(dāng)于原藥102. 4mg/ml的提取液，取4ml加入4ml倍比稀釋,得51. 2mg/ml稀釋液，同法依次取4ml加入4ml無菌水系列倍比稀釋，得濃度分別為25. 6、12. 8,6. 4,3. 2、1. 6,0. 8,0. 4,0. 2mg/ml的系列稀釋液。分別取上述樣品溶液Iml加入9cm無菌平板，加入幽門螺桿菌固體培養(yǎng)基9ml，立即混勻，置水平臺(tái)待凝后得到濃度依次為 5. 12,2. 56、1. 28,0. 64,0. 32,0. 16,0. 08,0. 04,0. 02mg/ml 的含藥平板?？死顾睾幤桨逯苽淙】死顾?0片，測(cè)定平均片重，無菌操作研磨成細(xì)粉末，精密稱取適量(約相當(dāng)于128mg克拉霉素)，置IOOml滅菌容量瓶，加入無水乙醇約20ml溶解，加入PH6. 5磷酸鹽緩沖液定容，得1280ug/ml克拉霉素溶液，取4ml加入4ml磷酸鹽緩沖液系列倍比稀釋，得濃度分別為 640、320、160、80、40、20、10、5、2. 5、1. 25,0. 625,0. 3125、0. 156ug/ml的系列稀釋液；分別取上述樣品溶液Iml加入9cm無菌平板，加入幽門螺桿菌固體培養(yǎng)基9ml，立即混勻，置水平臺(tái)待凝后得到濃度依次為8、4、2、1、0. 5,0. 25,0. 125、0. 06,0. 03,0. 015ug/ml 的含藥平板。(4)菌懸液制備取試驗(yàn)菌株，接種幽門螺桿菌平板培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)48小時(shí)，用接種環(huán)刮取菌苔至無菌生理鹽水，混旋儀混勻后與麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷幔s為lX108cfu/ml。(5)接種及培養(yǎng)將試驗(yàn)菌懸液按順序加入96孔板相應(yīng)孔內(nèi)，放置于多點(diǎn)接種儀。取已制備的各含藥平板按濃度由低至高順序接種。于37°C培養(yǎng)48小時(shí)，取出觀察結(jié)果，記錄生長狀況。(6)試驗(yàn)結(jié)果DMSO溶劑培養(yǎng)基對(duì)照平板生長結(jié)果各臨床菌株在DMSO濃度分別0. 156%、
0.078%,0. 039%,0. 0195%的平板培養(yǎng)基均能生長良好，菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果均符合幽門螺旋桿菌特征。樣品及對(duì)照藥物對(duì)臨床菌株的MIC測(cè)定結(jié)果見表1，各藥物的MIC5(1、MIC90及MICe值統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2表I蒼術(shù)總萜醇提取物對(duì)臨床菌株的MIC測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種蒼術(shù)總萜醇提取物在制備抗幽門螺桿菌藥物中的應(yīng)用，所述的蒼術(shù)總萜醇提取物為通過提取、精制步驟從菊科植物蒼術(shù)的干燥根莖中獲得的富含蒼術(shù)倍半萜醇的提取物，所述蒼術(shù)總萜提取物的組成成分按重量比(W/V)計(jì)(1)蒼術(shù)醇的含量范圍為50°/Γ90%，其中，所述蒼術(shù)醇為茅術(shù)醇與β-桉葉醇兩者重量比為1:0. 5^2的混合物；(2)蒼術(shù)素的含量為2.5°/Γ20% ；(3)余量是其他倍半萜醇類、倍半萜烯及聚炔類化合物；其中，倍半萜烯的含量不超過2%重量。
2.如權(quán)利要求1所述的蒼術(shù)總萜醇提取物在制備抗幽門螺桿菌藥物中的應(yīng)用，其特征是所述的蒼術(shù)醇的含量為70%。
全文摘要
本發(fā)明涉及蒼術(shù)總萜醇提取物，尤其涉及在制備抗幽門螺桿菌藥物中應(yīng)用。所述的蒼術(shù)總萜醇提取物為通過提取、精制步驟從菊科植物蒼術(shù)的干燥根莖中獲得的富含蒼術(shù)倍半萜醇的提取物。蒼術(shù)總萜醇提取物不僅具有抑制胃酸分泌的作用，而且具有抗幽門螺旋桿菌的活性，抗菌活性隨培養(yǎng)基pH值的降低而增強(qiáng)，從而阻斷消化性潰瘍兩大致病因素，即胃酸分泌過多和幽門螺旋桿菌。
文檔編號(hào)A61P31/04GK103006736SQ20121050130
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者梁慧, 嚴(yán)啟新, 曾偉珍, 康暉 申請(qǐng)人:深圳海王藥業(yè)有限公司