專利名稱：取代的二環(huán)[3.3.1]壬烷－2,4,9三酮作為活性藥物成分的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及取代的二環(huán)[3.3.1]壬烷-2，4，9三酮的使用，特別是克魯西(clusianone)或克魯西的衍生物作為活性藥物成分或藥劑中的活性成分，特別是用于產(chǎn)生用來預(yù)防性和/或治療性(醫(yī)療性)處理腫瘤或癌癥疾病以及病毒疾病的藥物。即，本發(fā)明是涉及取代的二環(huán)[3.3.1]壬烷-2，4，9三酮作為藥物或藥物組合物的藥物活性成分，特別是細(xì)胞抑制的和抗病毒的組合物(病毒抑制)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及取代的二環(huán)[3.3.1]壬烷-2，4，9三酮作為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制物和/或端粒酶抑制物以及作為MAP激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控物。
腫瘤或癌癥疾病不是一種單一的病理狀態(tài)，而是對于大量不同類型的惡性疾病的總稱。實(shí)際上機(jī)體的每個組織都可能發(fā)生癌性病變，有時甚至是幾種不同類型。反過來，每種病癥都有其自身的特征。導(dǎo)致這種疾病的原因經(jīng)常是不同的。
盡管有這種多樣性，實(shí)際上所有腫瘤或癌性病變都由非常相似的基本分子或細(xì)胞過程所產(chǎn)生。過去二十年的研究已經(jīng)在分子水平使人們對癌癥發(fā)生和腫瘤發(fā)生的基本過程的知識有驚人的進(jìn)展。
遺傳信息是由細(xì)胞核內(nèi)的染色體的DNA分子所攜帶。僅占細(xì)胞中總量的很小一部分的兩類基因在癌癥的發(fā)展中起了重要的作用，即原癌基因(癌基因前體)和抑癌基因(抑制腫瘤的基因)。在它們正常的形態(tài)中，它們指導(dǎo)細(xì)胞的生命周期，它們控制著過程的復(fù)雜順序，使細(xì)胞變得更大，或者如果必要，使細(xì)胞分解。這兩類基因共同作為人腫瘤中大量的的未受控制的細(xì)胞增殖過程的根源例如，在調(diào)控區(qū)域或在結(jié)構(gòu)區(qū)域的原癌基因發(fā)生突變，然后可能有大量的生長促進(jìn)蛋白產(chǎn)生，或者是該生長促進(jìn)蛋白具有過度的活性；原癌基因已經(jīng)成為一類刺激細(xì)胞能夠過度增殖的促進(jìn)癌癥的致癌基因。與之相對比，抑癌基因如果因突變失去活性，會導(dǎo)致癌癥的發(fā)展；結(jié)果細(xì)胞失去具有功能的抑癌蛋白，以及能夠正常防止細(xì)胞不正常增殖的關(guān)鍵性生長阻滯物。
一種針對無限制性增殖的應(yīng)急機(jī)制包括在正常的細(xì)胞之中，其還包括一類計(jì)數(shù)器能夠記錄每個細(xì)胞分裂并在一定數(shù)量傳代后使之停止。在經(jīng)歷一定數(shù)量的細(xì)胞分裂或倍增后，該過程可以被大致的預(yù)計(jì)，正常細(xì)胞的生長停止。該過程被稱之為細(xì)胞的老化或衰老。
在細(xì)胞水平負(fù)責(zé)細(xì)胞老化或衰老過程的是染色體末端的DNA片段稱之為端粒。它們記錄著細(xì)胞群經(jīng)歷多少個增殖循環(huán)過程，并在特定的時間后，啟動衰老或臨界。通過這種方式它們限制著細(xì)胞群無限制生長的能力。在最健康的人類細(xì)胞中，當(dāng)每次細(xì)胞分裂染色體發(fā)生復(fù)制時，端粒被縮短一個片段。當(dāng)它們被縮小到特定的臨界長度時，這對于細(xì)胞是進(jìn)入衰老階段的信號；如果細(xì)胞忽視這個警告，端粒被進(jìn)一步縮短直到最終的臨界點(diǎn)發(fā)生當(dāng)端粒非常短時，染色體或其片段就相互連接并誘發(fā)對細(xì)胞致死的遺傳紊亂。
正常細(xì)胞所經(jīng)歷的老化或衰老過程，即失去分裂的能力，依賴于正常死亡的細(xì)胞中染色體在每個細(xì)胞分裂后在其端粒末端失去50到200個DNA核苷酸。這些末端核苷酸(端粒)的丟失具有有絲分裂時鐘的功能，其記錄著細(xì)胞分裂的數(shù)目。端粒的保留表現(xiàn)出對于細(xì)胞逃避衰老過程并能夠無限分裂是必須的。
上述的保護(hù)性機(jī)制在多數(shù)癌癥和腫瘤細(xì)胞的惡化過程中被去活化，特別是通過活化一個包含能夠產(chǎn)生端粒酶的基因。這種酶能夠系統(tǒng)性的補(bǔ)充被縮短的端粒部分，并永久的維持從而使細(xì)胞能夠沒有限制的分裂。因此，在多數(shù)腫瘤或癌癥疾病中，細(xì)胞的永生性是由于端粒酶的活性產(chǎn)生的短的但穩(wěn)定的端粒的保留。所產(chǎn)生的細(xì)胞潛在的永生性在幾個方面都是不利的首先，它對腫瘤變得非常大有作用；第二，它給予前體癌細(xì)胞或已經(jīng)為真性癌細(xì)胞以時間去積累進(jìn)一步的突變使得它們具有能夠增殖以及進(jìn)入其它組織并最終轉(zhuǎn)移的能力。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在約80％的腫瘤性疾病中，惡化細(xì)胞的無限性生長是基于被損害的端粒酶的調(diào)控功能。通過端粒酶抑制物治療腫瘤或癌癥疾病表現(xiàn)出可能是對這些疾病的一種有前景的療法。隨后，已在本領(lǐng)域進(jìn)行許多努力來發(fā)展抑制端粒酶的活性成分。
因此，WO 00/74667 A2建議端粒酶抑制物(如AZT)結(jié)合能夠誘導(dǎo)端粒破壞的活性組分(如紫衫醇)用于癌癥的治療。WO 99/65875 A1和US-A-5 863936建議異二環(huán)系統(tǒng)作為端粒酶抑制物用于癌癥疾病的治療。如在歐洲公開的專利EP 0 938 897 A1所描述的兒茶酚可以作為端粒酶抑制物用于癌癥治療。
在腫瘤或癌癥細(xì)胞內(nèi)分子或細(xì)胞水平通過其它機(jī)制也嘗試在本領(lǐng)域進(jìn)行干預(yù)。因此，本領(lǐng)域目前用很多烷基化物治療腫瘤或癌癥疾病，通過DNA的烷基化，最終誘導(dǎo)腫瘤或癌細(xì)胞DNA的直接破壞(環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺，卡氯芥，苯丁酸氯芥等)。類似的用于腫瘤或癌癥治療的為通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶來干涉腫瘤或癌癥細(xì)胞復(fù)制的物質(zhì)(喜樹堿，9-氨基喜樹堿，依連洛特肯，阿霉素等)(參照，如佩奇克萊夫<Clive Page>等的《綜合藥理學(xué)》，莫斯比<Mosby>，1997)。
但是，除烷基活化成分外，在臨床使用的還有一些拓?fù)湟种莆?；目前在不同腫瘤的臨床治療中，沒有通過抑制端粒酶或結(jié)合抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶和端粒酶特性的活性成分。
本發(fā)明的目的是來發(fā)現(xiàn)和提供適合于治療腫瘤或癌癥疾病的活性成分和藥物，但也適用于其它疾病(如病毒性疾病)。
本申請已經(jīng)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)取代的二環(huán)[3.3.1]壬烷-2，4，9三酮的分子式(I)。
其中·R1，R2，R4和R5，相同或不同，獨(dú)立的為下述基團(tuán)中之一 但其附帶限制條件為如果自由基R1或R2或R4或R5為苯?；@些自由基中的其它則不是苯?；?。
·R3為氫原子。
·R6和R7都同為甲基或同為氫基，R8和R9都同為甲基或同為氫基。
但其附帶限制條件為如R6和R7為甲基，則R8和R9為氫基；如R8和R9為甲基，則R6和R7為氫基；以及它們的生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物，特別是產(chǎn)生用來預(yù)防性和/或治療性(醫(yī)療性)處理腫瘤或癌癥疾病以及病毒疾病的藥物，特別是對于人和動物，即屬于人用及獸用藥物部門。
分子式(I)的化合物的生理耐受性或可接受性鹽溶液可以為含有如礦物酸，羧基酸或磺基酸的鹽溶液；特別優(yōu)選的例子為含有鹽酸，氫溴酸，硫酸，磷酸，甲磺酸，乙磺酸，甲苯磺酸，苯磺酸，萘磺酸，乙酸，丙酸，乳酸，酒石酸，檸檬酸，反乙烯丁二酸，馬來酸或安息香酸的鹽溶液。但是，含有常規(guī)的堿的溶液也可以作為生理耐受性或可接受性鹽溶液，例如，堿性金屬鹽(如鈉或鉀鹽)，堿性土壤金屬鹽(如鈣或鎂鹽)或從氨水衍生的銨鹽，或有機(jī)鹽如二乙胺，三乙胺，乙烷二異丙基乙胺，普魯卡因，二芐基胺，N-甲基嗎啉，二氫松香乙胺，1-麻黃胺，甲基哌啶。
本發(fā)明還包括分子式(I)的化合物的水合物。上述分子式(I)的化合物的形式，其根據(jù)發(fā)明被命名為水化物，在固體或液體狀態(tài)，通過與水起水合作用形成分子化合物(水化物)。在水合物中，水分子通過分子間作用力特別是通過氫鍵結(jié)合。固態(tài)水合物包含以化學(xué)計(jì)量或非化學(xué)計(jì)量比例的結(jié)晶狀態(tài)的水，以及與它們的結(jié)合狀態(tài)不是等量相關(guān)的水分子。水合物的例子為一個半水合物，一水合物，二水合物，三水合物等。根據(jù)本發(fā)明分子式(I)的化合物的水合鹽也是同等適用的。
本發(fā)明也包括分子式(I)的化合物的異構(gòu)體。用于本發(fā)明的異構(gòu)體的概念也被用作所有可能的異構(gòu)體的綜合命名。本發(fā)明的非限定性的異構(gòu)體的例子特別的為立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體。
因此，根據(jù)取代模式，分子通式(I)的化合物可以發(fā)生在出現(xiàn)在異構(gòu)體形式中，特別是立體異構(gòu)體，例如該立體異構(gòu)體與像和其鏡像相關(guān)(對映異構(gòu)體)，或該立體異構(gòu)體與像和其鏡像不相關(guān)(非對映異構(gòu)體)。本發(fā)明包括分子式(I)的化合物所有的立體異構(gòu)體，即包括無論是對映異構(gòu)體或是非對映異構(gòu)體，以及其各自的混合物。對映異構(gòu)體形式能夠，如非對映異構(gòu)體一樣，被用已知的方法分別分離成單一的成分。
分子式(I)的化合物也可以存在于互變異構(gòu)體中。這已為熟練的技術(shù)人員所了解，這種化合物也包含在本發(fā)明的范圍中?；プ儺悩?gòu)體的例子為，如下述的酮烯醇互變異構(gòu)體 如果R5為，如苯甲?；鶊F(tuán)，則更進(jìn)一步類型的酮烯醇互變異構(gòu)體是可能的。
分子式(I)的化合物還可以存在結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，特別是位置異構(gòu)體(取代異構(gòu)體)。這已為熟練的技術(shù)人員所了解，這種化合物也包含在本發(fā)明的范圍中。
本發(fā)明還包括分子式(I)的化合物的衍生物(舉例來說，為醚類如為烷基醚，例如甲基醚，其能夠通過互變異構(gòu)體形式(I′)和形式(I″)的烷化得到)。分子式(I)的化合物的衍生物，其根據(jù)本發(fā)明為特別優(yōu)選的，為互變異構(gòu)體形式(I′)和形式(I″)的聚乙二醇化的衍生物，特別聚亞烷基二醇醚，優(yōu)選的為聚乙二醇醚(PEG醚)。此外，化學(xué)修飾也是可能的，特別是與R1到R9取代相關(guān)(如側(cè)面基團(tuán)衍生作用)。
本發(fā)明還同等的包括分子式(I)的化合物的原藥和代謝物。上述分子式(I)的化合物的形式，其根據(jù)本發(fā)明被稱為原藥，其可以為生物活性的或?yàn)榉腔钚缘?，但能夠被轉(zhuǎn)化為合適的生物活性形式(如通過代謝作用，溶解作用或其它方式)。分子式(I)的化合物的產(chǎn)品根據(jù)本發(fā)明被稱為代謝物，其特別的為在代謝作用中由代謝作用或轉(zhuǎn)化作用所產(chǎn)生。
分子式(I)的化合物為天然產(chǎn)物，其能夠通過例如從加勒比蜜蜂的蜂膠提取物中用色譜層析去除法得到。蜂膠為微黑黃色到淡棕褐色，樹脂狀物質(zhì)能夠在指間變得柔軟，并且具有香料-香脂狀氣味，并能夠被蜜蜂通過花的蓓蕾來收集并被用在蜂巢內(nèi)作為巢壁的包被以加固蜂巢。蜂膠具有非常復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)并且其組合物依賴于當(dāng)?shù)氐闹参飬^(qū)系。蜂膠包含超過200種化學(xué)物質(zhì)，包括相對大比例部分的蜂蠟和樹脂，精煉的和芬芳的油類，以及大量的其它化學(xué)物質(zhì)，包括如類黃酮，咖啡酸衍生物以及，如果為加勒比蜂膠，還包括分子式(I)的化合物的組合物。
分子式(I)的化合物還能夠直接從不同的藤黃種(藤黃科或產(chǎn)樹脂藤黃科家族(如<重瓣克魯西>Clusia grandiflora，<一種生長于夏威夷觀賞性植物>Clusia rosea or<？>Clusia renggerioides))中的植物樹液或樹脂中分離(如從樹脂中，從植物乳膠中，從葉中，從花中等)因此，A.J.Marsaioli等在《完全應(yīng)用化學(xué)》第70，11卷第2116頁(1998)上發(fā)表的“從化學(xué)的角度看由微生物，蜜蜂和藤黃科植物樹脂和油類組成的生態(tài)系統(tǒng)”。C.M.A.de Oliveira等在植物化學(xué)50(1999)第1073-1079頁上發(fā)表的“從三種藤黃種中得到的兩種多異戊二烯化苯氧酚酮”以及A.L.M.Porto等在植物化學(xué)55(2000)第755-768頁上發(fā)表的“從藤黃種中得到的多異戊二烯化苯氧酚酮”描述了通過色譜層析方法從藤黃種(藤黃科或產(chǎn)樹脂藤黃科家族)的不同植物的樹脂或組分中起始分離得到上述分子式(I)的化合物的不同克魯西(clusianone)衍生物(樹脂與重氮甲烷在二乙醚中反應(yīng)并隨后進(jìn)行柱狀層析，該層析柱裝有硅膠和己烷/乙酸乙醚或己烷/乙醚作為洗提液(梯度柱)，隨后通過在預(yù)先準(zhǔn)備的硅膠/硝酸銀和苯/乙酸乙醚作為洗提液上進(jìn)行薄層層析)。
從藤黃科或產(chǎn)樹脂藤黃科即聚花克魯西<Clusia congestiflora>中起始分離克魯西<clusianone>本身以及其結(jié)構(gòu)的闡明都在L.E.McCandlish et al.“二環(huán)(3，3，1)壬烷-2，4，9-三酮兩種派生物的結(jié)構(gòu)。一個自然產(chǎn)品克魯西、C33H42O4及三甲基臨苯二酚酸，C18H20O6””in Acta Cryst.(1976)，B32，第1793-1801頁中有描述。
M.H.Santos等在巴西制藥科學(xué)雜志第35卷第2冊1999年7月/12月第297-301頁上發(fā)表的“Efeito de constituintes químicos extraidos do fruto deRheedia gardneriana(bacuparí)sobre bactérias 以及在Acta Cryst.(1998)，C54，第1990-1992頁上發(fā)表的“Epiclusianon由二環(huán)(3，3，1)壬烷-2，4，9-三酮派生的一種新自然產(chǎn)品”中描述了從藤黃科家族中的一種植物Rheedia gardneriana(bacuparí)的花提取物中分離epiclusianone。
F.delle Monache等在植物化學(xué)第30卷第6冊第2003-2005頁(1991)上發(fā)表的“Prenylated Benzophenones From Clusia Sandiensis”描述了通過液相色譜層析(隨后用預(yù)先準(zhǔn)備的薄層層析進(jìn)行柱狀層析)從Clusia Sandiensis的植物樹脂中起始分離不同的克魯西衍生物。
與分子式(I)的化合物的制備和分離相關(guān)的先前領(lǐng)域的上述文獻(xiàn)的全部公開內(nèi)容作為文獻(xiàn)包含于本發(fā)明中。
本申請已經(jīng)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)分子式(I)的化合物包括其生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物，表現(xiàn)出未曾預(yù)料到的藥理學(xué)效果，因此適于產(chǎn)生用來預(yù)防性和/或治療性(醫(yī)療性)處理各種類型的腫瘤或癌癥疾病以及各種類型的病毒疾病的藥物。
分子式(I)的化合物包括其生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物能夠相應(yīng)優(yōu)選的用來預(yù)防性和/或治療性(醫(yī)療性)處理疾病，優(yōu)選的為腫瘤或癌癥疾病(抑制細(xì)胞生長的)以及病毒性疾病(抗病毒組分或抑制病毒生長的)。本發(fā)明還進(jìn)一步關(guān)系到藥物學(xué)組分或藥物，特別是抑制細(xì)胞生長的抗病毒組分(抑制病毒生長的)，其包括至少一種如上所描述的分子式(I)的化合物以及/或其生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物，特別是以藥物有效量與藥物可接受的，本質(zhì)是非毒性的載體或賦形劑結(jié)合。
本發(fā)明申請人令人驚訝的發(fā)現(xiàn)分子式(I)的化合物作為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制物特別是作為拓?fù)洚悩?gòu)酶I的抑制物來與其它事物相互作用。此外，它們通常表現(xiàn)出端粒酶抑制效果。最終，分子式(I)的化合物根據(jù)本發(fā)明可以用來誘導(dǎo)在腫瘤或癌癥細(xì)胞中DNA的破壞。
根據(jù)本發(fā)明所使用的分子式(I)的化合物的拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制效果和端粒酶抑制效果顯著高于本領(lǐng)域已知的化合物。例如，分子式(I)的化合物在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出比常規(guī)治療試劑(如羥基喜樹堿)明顯更強(qiáng)的對拓?fù)洚悩?gòu)酶I的抑制效果。此外，分子式(I)的化合物也作為在MAP激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的調(diào)控物。
分子式(I)的化合物將拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制作用和端粒酶抑制作用相結(jié)合的特性說明它們具有有價值的特性并特別適合用于預(yù)防性和/或治療性(醫(yī)療性)處理各種腫瘤或癌癥疾病(原發(fā)腫瘤，轉(zhuǎn)移腫瘤，癌癥的癌前或早期階段，良性和惡性腫瘤，等)。與之對比，在本領(lǐng)域已知還沒有活性成分或藥物將拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制作用和端粒酶抑制作用同時在一個分子中。
根據(jù)本發(fā)明所使用的分子式(I)的化合物的活性成分表現(xiàn)出不盡具有抗腫瘤的效果，同時還具有抗轉(zhuǎn)移腫瘤的效果。
根據(jù)本發(fā)明所使用的分子式(I)的化合物的活性成分令人驚訝的表現(xiàn)出沒有預(yù)期到的良好的抑制細(xì)胞生長的效果，即使在已經(jīng)表現(xiàn)出對以確定的化學(xué)治療試劑有抵抗力的腫瘤中。此外，還沒有觀察到對分子式(I)的化合物的活性成分有抵抗力。而且，根據(jù)本發(fā)明所使用的分子式(I)的化合物的活性成分具有一定優(yōu)勢，即其對已經(jīng)建立的藥物或化學(xué)治療試劑沒有交叉抵抗作用。
被提及的疾病作為分子式(I)的化合物能被用于治療的腫瘤或癌癥疾病的非限定性例子為下述腸內(nèi)癌癥(結(jié)腸癌)，乳腺癌癥(乳癌)，卵巢癌，子宮癌，肺癌，胃癌，肝癌，胰腺癌，腎癌，膀胱癌，前列腺癌，睪丸癌，骨癌，皮膚癌，卡波西肉瘤，腦瘤，肌肉瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤(即成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)，淋巴瘤和白血病。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的使用下列具有分子式(Ia)，(Ib)，(Ic)和(Id)的化合物，包括它們的生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物。
根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的是使用下述分子式為(Ic)的化合物，包括其的生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物。
分子式為(Ic)的化合物為一對相互平衡共存的烯醇互變異構(gòu)體中的一個。
根據(jù)本發(fā)明對于分子式為(Ic)的化合物特別優(yōu)選的具有下列構(gòu)型。
本申請還發(fā)現(xiàn)在某些情況下，使用或給予分子式(I)的化合物以及/或它們的生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物，同時結(jié)合至少一種化學(xué)治療試劑，特別是蛋白酶抑制物，優(yōu)選的為MAP激酶抑制物是有利的。將分子式(I)的化合物以及/或它們的生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物結(jié)合蛋白酶抑制物，優(yōu)選的為MAP激酶抑制物能夠在癌癥或腫瘤疾病的治療中取得良好的結(jié)果。這種結(jié)合具有驚人的協(xié)同效果。
因此本發(fā)明還關(guān)系到一種藥物組合，特別是抑制細(xì)胞生長的組合，其包括(A)至少一個如上面所描述的分子式(I)的化合物，以及/或其生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物；以及(B)至少一個化學(xué)治療試劑，特別是蛋白酶抑制物，優(yōu)選的為MAP激酶抑制物。
本發(fā)明的由組分(A)和組分(B)結(jié)合的組合能夠被同時給予或可順序給予。藥物組合可以包括包含組分(A)和組分(B)作為其功能單元，特別是或以一種混合物或一種配制或一種混合的形式，或者是兩者分離的形式(空間上)。
蛋白激酶抑制物，正如其名稱所示，抑制效果與蛋白激酶的活性相關(guān)，即該酶能夠?qū)ⅵ?磷酸基團(tuán)從ATP轉(zhuǎn)移到酪氨酸或絲氨酸或蘇氨酸側(cè)鏈上。適合于治療特別是腫瘤和癌癥疾病的本發(fā)明的藥物組合物和本發(fā)明的組合治療為各種類型的蛋白激酶抑制物，如本領(lǐng)域已知的蛋白激酶抑制物(如特定低分子量的雜環(huán)抑制物如星形胞菌素，2′-氨基-3′-甲氧氟烷，1，4-雙氨-2，3-[2-氨基苯硫]丁二烯，SB 203580，自SmithKline Beecham公司等)。在這些例子中可以觀察到協(xié)同效應(yīng)。
特別優(yōu)選的是使用MAP蛋白激酶抑制物作為本發(fā)明的藥物組合物以及作為本發(fā)明的腫瘤和癌癥疾病的組合治療。MAP蛋白激酶抑制物，如其名稱所示，抑制效果與MAP激酶活性相關(guān)(MAP＝有絲分裂原活化蛋白)，即在有絲分裂期間具有活性的酶，其將末端的磷酸殘基從三磷酸核苷轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)牡孜锷?。通過這種方式，MAP激酶抑制物阻止有絲分裂以及癌癥或腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞分裂。適合于治療特別是腫瘤和癌癥疾病的本發(fā)明的藥物組合物和本發(fā)明的組合治療為各種類型的MAP激酶抑制物，即本領(lǐng)域已知的所有MAP蛋白激酶抑制物。根據(jù)本發(fā)明可以被使用的MAP蛋白激酶抑制物的例子在下述出版物中被作為例子涉及，其全部內(nèi)容作為文獻(xiàn)的方式被包含于此處WO99/32111 A，WO 99/64400 A，WO 98/52941 A，WO 98/52937 A，WO 97/44467 A，WO 98/27098 A，WO 98/52558 A，WO 98/52940 A，WO 99/32110 A，WO99/32463 A，WO 99/58502 A，WO 99/58523 A和WO 99/00357 A。
本申請還令人驚訝的發(fā)現(xiàn)上述分子式(I)的化合物還表現(xiàn)出在MAP蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的調(diào)控活性，即作為在MAP蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的調(diào)控物。
分子式(I)的化合物還適用于治療病毒性疾病并作為抗病毒組合物(抑制病毒生長)的活性成分(如治療皰疹病毒疾病或HIV)。如上所描述的，本發(fā)明還進(jìn)一步關(guān)系到分子式(I)的化合物，以及生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物用于預(yù)防性和/或治療性(醫(yī)療性)處理各種類型的病毒疾病。
本發(fā)明還關(guān)系到一種用于預(yù)防和/或治療人或動物身體疾病的方法，特別是各種類型的腫瘤和癌癥疾病或病毒性疾病，用分子式(I)的化合物包括其生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物，在治療有效劑量下，同時在適合時結(jié)合另一種活性成分，特別是化學(xué)治療試劑(即蛋白激酶抑制物，如MAP激酶抑制物)。
根據(jù)本發(fā)明所使用的活性組分或活性組分組合可以依賴于被治療疾病的性質(zhì)，被全身性給藥或部分給予，特別是局部給予。
根據(jù)本發(fā)明所使用的適合于給藥的活性組分或活性組分組合為所有常規(guī)的給藥形式?？赡艿慕o藥途徑的例子為口部、舌部、舌下、頰部、腸內(nèi)或腸胃外(即避開腸部管道，即靜脈內(nèi)，動脈內(nèi)，心臟內(nèi)，皮內(nèi)，皮下，經(jīng)皮，腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi))，并且口部和靜脈給藥是特別適合；口部給藥是更為優(yōu)選的。表面給藥也是可以的(如治療黑素瘤)。
根據(jù)本發(fā)明為進(jìn)行應(yīng)用，活性成分或活性成分的組合可以用已知的方式轉(zhuǎn)化成常規(guī)的劑型，例如各種類型的無包膜藥品，包膜藥品，藥丸，顆粒，氣溶劑，糖漿，乳劑，懸浮液，溶液，藥膏，油膏和凝膠，特別使用無活性的，本質(zhì)上非毒性的制藥上可適用的載體或溶劑。將活性成分或活性成分的組合引入作為進(jìn)入脂質(zhì)體“包裝物”也是可以的，即其被包埋或密封到脂質(zhì)體中，該脂質(zhì)體也可選擇性的被進(jìn)一步修飾(如用PEG進(jìn)行酯化)。在這種連接中，根據(jù)本發(fā)明所使用的活性成分或活性成分的組合可以在各種情況都以治療有效濃度存在，特別是在完全混合物中重量比從為0.0001到99％的濃度范圍內(nèi)，優(yōu)選的0.01到95％，即為達(dá)到指示的或需要的劑量范圍的有效量。然而，適當(dāng)?shù)钠x上述量也是必須的，特別是作為身體重量或給藥類型的一種功能，作為個體對藥物反應(yīng)的一種功能，作為劑型的類型以及給藥發(fā)生的時間或間隔的一種功能。因此，在一些情況下低于上述最小劑量的為充分的，然而在另一些情況下所述上部限制一定被超過。當(dāng)多量被給予時，將這些分成多個單一劑量并在一段特定的時間內(nèi)，如在一天內(nèi)分別給予是可取的。
劑型可以被延伸，如通過擴(kuò)展活性成分或活性成分組合與溶劑(舉例來說，油類如蓖麻油)和或/載體，當(dāng)適合使用乳化劑和/或分散劑時，使用這些是可行的，舉例來說在適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑作為輔助溶劑處，水可以作為稀釋劑。
根據(jù)給藥的模式，為達(dá)到治療效果，以身體重量的0.0001到500mg/kg特別是0.0001到100mg/kg，有效的為0.01到50mg/kg的劑量給予根據(jù)本發(fā)明所使用的活性成分或活性成分組合被證明是有利的。然而，適當(dāng)?shù)钠x上述量也是必須的，特別是作為身體重量或給藥類型的一種功能，作為個體對藥物反應(yīng)的一種功能，作為劑型的類型以及給藥發(fā)生的時間或間隔的一種功能。因此，在一些情況下低于上述最小劑量的為充分的，然而在另一些情況下所述上部限制一定被超過。當(dāng)多量被給予時，將這些分成多個單一劑量或作為持續(xù)給藥(舉例來說，如持續(xù)輸注)并在一段特定的時間內(nèi)，如在一天內(nèi)分別給予是可取的。在慢性病中的應(yīng)用(舉例來說，如藥品形式)是同樣可行的。
本發(fā)明的進(jìn)一步精練，修飾和變化能夠在熟練的技術(shù)人員在閱讀本說明書后在不偏離本發(fā)明范圍內(nèi)進(jìn)行確定并直接實(shí)施。
本發(fā)明可以通過下列實(shí)施例來進(jìn)行說明，但不意味著對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例從加勒比蜜蜂的蜂膠中得到的1-苯甲酰-8，8-2甲基-2-羥基-3，5，7-三羥甲基氨基甲烷-(3甲基-2-丁烯)二環(huán)[3，3，1]non-2-雙鍵-4，9-二酮(Ic’))(1-Benzoyl-8，8-dimethyl-2-hydroxy-3，5，7-tris-(3-methyl-2-butenyl)bicyclo[3.3.1]non-2-ene-4，9-dione(Ic’)<non-2-ene-4，9-dione(Ic’)) 分子式(Ic’)的化合物的生理學(xué)活性如下所描述。
分子式(Ic’)的化合物存在于分子式(Ic)和(Ic″)結(jié)構(gòu)的互變異構(gòu)平衡之中。
但是，為了簡化，下面只稱之為分子式(Ic’)的化合物。
蜂膠溶液的制備從加勒比蜜蜂的蜂巢中收集的蜂膠溶于乙醇中，并通過過濾去除不可溶的蜂蠟。干燥得到一定體積的粉末以一定的濃度重新懸浮在乙醇中。在避光室溫的條件下保存溶液。
蜂膠溶液的半制備性HPLC分離用Waters GmbH(Eschborn)(Waters the Separator Module Alliance 2690，Waters PDA 996 Detektor，Waters Millennium Chromatography Manager)提供的RP-HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分離。在40℃用梯度系統(tǒng)用Macherey-Nagel(Nucleosil100-7 C18，250×21mm)提供的分離柱進(jìn)行分離(表1)。液相由0.01M的甲酸銨溶液組成(pH＝7.00)。
表1梯度系統(tǒng)
在這種方式得到的每8毫升部分(2分鐘)被干燥并重新懸浮在乙醇中并在避光室溫的條件下保存。
每個分離部分的細(xì)胞毒性在媒介中用稀釋可比較體積進(jìn)行檢測并按下面描述的SRB實(shí)驗(yàn)來研究。其中所使用的目標(biāo)細(xì)胞為人源的腸癌細(xì)胞系。(HCT8WT)。
細(xì)胞毒性部分的純化在SRB實(shí)驗(yàn)中具有細(xì)胞毒性活性的部分要進(jìn)行進(jìn)一步純化。為此目的，梯度稀釋系統(tǒng)被用于待純化部分的極化。在SRB實(shí)驗(yàn)中對用制備性RP-HPLC得到的片段進(jìn)行更新和檢測，可以分離均質(zhì)的物質(zhì)(Ic’)。物質(zhì)(Ic’)的純度通過UV分光光度數(shù)據(jù)來顯示(

圖1b)。一個包含修飾的C18相(250mm×4.6mm)水對稱柱被選擇作為分析分離柱。結(jié)果如圖1a所示。
圖1a顯示了物質(zhì)(Ic’)在254nm，流速＝1毫升/分鐘，T＝40℃，梯度系統(tǒng)作為指示的分析性RP-HPLC(純度檢測)中的代表性色譜圖。上面的線對應(yīng)甲醇的濃度(％)，中間的線對應(yīng)水相的濃度(％，甲酸銨0.01M)。乙腈的濃度(％)維持在穩(wěn)定的5％(更下面的線)。
圖1b顯示圖1a所示的PDA分析數(shù)據(jù)。所得到的物質(zhì)(Ic’)為均質(zhì)的。在這些洗脫條件下的UV光譜展示了兩個最大值(254鈉米和308鈉米)。
結(jié)構(gòu)闡明分子式(Ic’)的化合物的最初分離和特征描述發(fā)生可以不存在任何衍生作用(舉例來說，如和重氮甲烷)。蜂膠(在加勒比海收集)的乙醇萃取物可以按照如上所描述的通過RP-HPLC來進(jìn)行純化，通過這種方式可以第一次提供分子式(Ic’)的化合物，其為非衍生的形式以進(jìn)行進(jìn)一步的NMR光譜研究，特別是在充分高的純度下(＞98％，LC-MS；用LC-PDA進(jìn)行的UV光譜研究；MS)。
為進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)構(gòu)，分子式(Ic’)的化合物被通過和重氮甲烷反應(yīng)來轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的甲基醚。O-甲基化化合物以40/60的比例被分離(RP-HPLC)。
NMR研究的結(jié)果(1H-NMR，13C-NMR，DEPT135，DEPT90，HMQC，HMBC，H，H-COSY90(gs)，1D-NOE差異光譜)如下表所示·DEPT代表通過極化轉(zhuǎn)移的無失真增強(qiáng)。
·COSY代表相關(guān)光譜。通過這種常用方法，1H，1H-COSY，也隨著其發(fā)明者的名字被稱為Jeener實(shí)驗(yàn)，其代表了在NMR的歷史中的第一個2D脈沖序列。
·HMQC代表異核多量子一致。
·HMBC代表異核多鍵相關(guān)。
·NOE代表核Overhauser效應(yīng)。
圖1c，1d和1e為分子式(Ic’)的化合物的1H-NMR光譜(測量頻率500MHz，溶劑CD3OD)。
圖1f描述了分子式(Ic’)的化合物的13C-NMR光譜(測量頻率125MHz，溶劑CD3OD)。
圖1g描述了分子式(Ic’)的化合物的13C-DEPT光譜(測量頻率125MHz，溶劑CD3OD)。CHs和CH3s點(diǎn)向上，CH2s點(diǎn)向下。
圖1h，1i，1j和1k為分子式(Ic’)的化合物的H，H-COSY光譜(測量頻率500MHz，溶劑CD3OD)。
圖1l描述了分子式(Ic’)的化合物的HMBC光譜(測量頻率125MHz，溶劑CD3OD)。
表1a化合物(Ic’)的NMR數(shù)據(jù)
H，H-COSYH6a-H7，H6e-H7，H7-H29，H7-H29’(w)＝弱，(br)＝寬；
相應(yīng)的，分子式(Ic’)或(Ic″)或(Ic)的非衍生化合物存在于酮/烯醇平衡中，其由系信號的化學(xué)轉(zhuǎn)化和2，4碳原子的13C信號的寬度來確證。

表1b對于甲基醚的NMR數(shù)據(jù)(II)
H，H-COSYH6a-H7，H7-H29 (w)＝弱

表1c對于甲基醚的NMR數(shù)據(jù)(III)
H，H-COSYH6a-H7，H6e-H7，H7-H29 (w)＝弱
絕對構(gòu)型在如上所詳細(xì)描述的NMR數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，對分子式(Ic’)或(Ic″)或(Ic)的化合物指定為下列絕對構(gòu)型是可能的 細(xì)胞培養(yǎng)六個特征明確的人源腫瘤細(xì)胞系(天然細(xì)胞系以及那些被轉(zhuǎn)化為抗性的亞克隆)以及兩個非腫瘤細(xì)胞系被用于進(jìn)一步的研究(表2)。
表2細(xì)胞系，細(xì)胞系的組織學(xué)特征及其來源
SRB實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系對于物質(zhì)的敏感度(Ic’)可以通過被稱為磺基若丹明(SRB)的實(shí)驗(yàn)來測定。這是在NCI(國家癌癥研究所，美國)已經(jīng)建立的有力并且高度可重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)方法(Skehan et al.1990)。
實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在表3中。抑制50％細(xì)胞生長的物質(zhì)(Ic’)的濃度(IC50，由半對數(shù)劑量對效果的曲線圖所決定)被指出。顯示在表3中的結(jié)果為至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值以及它們的標(biāo)準(zhǔn)偏差。對于所指示的細(xì)胞生長抑制活性沒有交叉抗性。物質(zhì)(Ic’)對于非腫瘤細(xì)胞系(纖維原細(xì)胞系3T3和MCR5)的細(xì)胞毒性被證明是非常少的。
表3在不同細(xì)胞系中物質(zhì)(Ic’)的IC50濃度測定
拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制作用的研究物質(zhì)對拓?fù)洚悩?gòu)酶I的作用效果被通過稱之為TopoI解旋實(shí)驗(yàn)來研究。此實(shí)驗(yàn)是基于螺旋型的pBR322質(zhì)粒DNA二聚物在拓?fù)洚悩?gòu)酶I的作用下發(fā)生的ATP非依賴性解旋。質(zhì)粒DNA的兩種不同的拓?fù)漕愋?，螺旋型以及未卷繞的松散型被通過瓊脂糖凝膠分離。為此目的從腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞核提取物中得到拓?fù)洚悩?gòu)酶I。
得到細(xì)胞核提取物通過Danks等修改的Sullivan的方法可以得到細(xì)胞核提取物。
物質(zhì)(Ic’)對拓?fù)洚悩?gòu)酶I的抑制作用如圖3所示(柱1對照)，需要160ng含有拓?fù)洚悩?gòu)酶I的細(xì)胞核提取物來將高度纏繞的pBR322質(zhì)粒DNA二聚物(陰性對照)轉(zhuǎn)變?yōu)樗缮⒌耐負(fù)湫?陽性對照)。物質(zhì)(Ic’)在100ug/ml的濃度下能夠100％的抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I活性。相應(yīng)的需要20倍該濃度來抑制相應(yīng)細(xì)胞系50％的腫瘤生長(IC50，圖2)。和羥基喜樹堿的體外抑制活性的數(shù)據(jù)對照表明，已經(jīng)在臨床確定應(yīng)用的羥基喜樹堿需要1000倍的IC50。圖3表明物質(zhì)(Ic’)對拓?fù)洚悩?gòu)酶I的抑制作用。
細(xì)胞周期分析到目前為止，對于物質(zhì)(Ic’)作用于細(xì)胞生長的效果已被證實(shí)為改變細(xì)胞周期。使用Tsugita M.等的一種適合的方法來進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)研究分析。
指數(shù)生長的HCT8 WT腸癌細(xì)胞被用已確定IC50濃度的物質(zhì)(Ic’)來處理24小時，然后細(xì)胞和BrdU共同孵育。用甲醇固定的細(xì)胞經(jīng)清潔劑(TritonX-100/HCl)處理以使DNA鏈變性。與熒光標(biāo)記的抗體(抗-BrdU單克隆抗體，F(xiàn)ITC-標(biāo)記)共同孵育后，加入第二個熒光染色劑(碘化丙啶)。
用Coulter流式細(xì)胞儀(Coulter EPICS XL)來測定DNA含量(碘化丙啶熒光)和BrdU的總量(FITC熒光)。實(shí)例的結(jié)果如圖4a和4b所示。
圖4a和4b表明HCT8 WT細(xì)胞的DNA對BrdU和PI的吸收，未處理(對照，圖4a)的和經(jīng)物質(zhì)(Ic’)處理的(IC50，24小時，圖4b)。圖示的結(jié)果為n＝3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。
顯然用物質(zhì)物質(zhì)(Ic’)處理會導(dǎo)致合成期的抑制。這一點(diǎn)從DNA含量的圖看的很清楚(圖4a和4b，BrdU吸收)。
DNA降解的分析研究物質(zhì)(Ic’)對DNA的降解是通過其作用于人的細(xì)胞支氣管癌(H460WT)和結(jié)腸癌(HT29 WT)作為實(shí)例來進(jìn)行的。在用物質(zhì)(Ic’)處理細(xì)胞不同的時間后，用凝膠電泳分析分離的DNA。
DNA雙鏈斷裂的測定是用14C標(biāo)記的DNA來完成的。為此，[14C]d-胸腺嘧叮標(biāo)記的細(xì)胞用不同濃度的物質(zhì)(Ic’)來處理。DNA用Chia Chiao等的適合的方法進(jìn)行分離。
在用GeneQuant分光光度計(jì)測定分離的DNA的總量和純度后，用瓊脂糖凝膠分離可比較量的DNA。通過凝膠電泳分離的DNA隨后用溴化乙啶來染色。
在透射儀上(302鈉米)，用提取的方法將在電場中沒有遷移的完整的DNA和在凝膠中遷移的片段DNA分開。分離的凝膠和DNA片段在鹽酸存在下在80℃使之液化。在加入閃爍劑后，可以用液體閃爍儀(TPI-CARB 2100RT)來測定測定放射活性。標(biāo)準(zhǔn)的放射活性用每分鐘裂變次數(shù)(cpm)來指示。
圖5表明在與支氣管癌細(xì)胞(H480 WT)孵育6個小時后，物質(zhì)(Ic’)誘導(dǎo)的雙鏈斷裂。圖5表明在[14C]d-胸腺嘧叮標(biāo)記的H460WT細(xì)胞在用物質(zhì)(Ic’)處理6個小時后所誘導(dǎo)產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂。結(jié)果代表了n＝3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和它們的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
用超過10倍的已確定的IC50濃度處理腫瘤細(xì)胞超過6個小時誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的雙鏈的斷裂，其對于腫瘤細(xì)胞來說明顯造成不能全部修復(fù)，即使在IC50濃度時也如此，從而誘導(dǎo)了細(xì)胞的死亡。
圖6表明在腫瘤細(xì)胞的DNA中誘導(dǎo)雙鏈斷裂的進(jìn)一步例子，在這個例子中為結(jié)腸腫瘤(HT29 WT)。關(guān)于支氣管癌細(xì)胞系，有顯著的大量雙鏈斷裂，其不能被腫瘤細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制所修正，最終作為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，即程序性細(xì)胞死亡的作用因素。
物質(zhì)(Ic’)對于人端粒酶的抑制活性的測定物質(zhì)(Ic’)對于人端粒酶的作用通過基于N.W.Kim等的方法，被稱為端粒重復(fù)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)(TRAP)ELISA來進(jìn)行測定。
該方法是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。這使得第一步，一定量的(GGTTAG)序列通過聚合酶的活性被結(jié)合到生物素標(biāo)記的寡核苷酸的3’末端(TS＝端粒酶底物)。第二步中，這種方式延伸的產(chǎn)物被用TS和RP(R＝反向)引物通過PCR技術(shù)擴(kuò)增。在這種方式中，以6個堿基為一“階梯”的方式增加從而產(chǎn)生產(chǎn)物(初始的尺寸等于50個核苷)。在擴(kuò)增的過程中，DNP標(biāo)記的dCTP被包含到PCR產(chǎn)物中。用三文治ELISA方法來對合成的端粒酶產(chǎn)物進(jìn)行測定和定量是端粒酶酶活性的標(biāo)準(zhǔn)。
端粒酶產(chǎn)物攜帶生物素標(biāo)記的TS引物并結(jié)合到預(yù)先包被有抗生素的微滴度板的表面上。在擴(kuò)增過程中包含一個結(jié)合有POD的抗DIG抗體結(jié)合到DNP標(biāo)記的核苷酸上。在底物TMB加入后，端粒酶的活性通過熒光光度計(jì)經(jīng)酶POD介導(dǎo)的顏色反應(yīng)的發(fā)生變得可以觀察。在這種情況下，測定的吸收值直接和端粒酶的活性成比例相關(guān)。
物質(zhì)(Ic’)對人端粒酶活性的作用效果為確保物質(zhì)(Ic’)對端粒酶的作用效果，物質(zhì)(Ic’)對DNA聚合酶的作用效果必須被排除。在用TSR8作為內(nèi)部對照的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，不同濃度水平的物質(zhì)(Ic’)的作用效果被排除。
TSR8模板的擴(kuò)增僅依賴于DNA聚合酶。這個酶的每個抑制物可以通過底物來檢測。
圖7表明用TSR8模板進(jìn)行的預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次。圖7表明即使用物質(zhì)(Ic’)的最大濃度，50ug/ml，在此實(shí)驗(yàn)中不能導(dǎo)致對Taq聚合酶明顯的抑制作用。
研究物質(zhì)(Ic’)對端粒酶抑制作用的實(shí)驗(yàn)如圖8所示。所述的濃度范圍在10到50ug/ml之間。在50ug/ml的濃度下觀察到對人端粒酶的完全抑制。圖8表明TRAP實(shí)驗(yàn)的結(jié)果用物質(zhì)(Ic’)在結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT8 WT)上取得的對人端粒酶劑量依賴性抑制作用。結(jié)果代表三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
ERK1/2的磷酸化作用(MAP蛋白激酶途徑)某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的磷酸化在細(xì)胞生長和基因表達(dá)的調(diào)控中扮演關(guān)鍵性的作用。蛋白ERK1/2(MAP蛋白激酶)屬于MAP蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
用物質(zhì)(Ic’)處理人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT8 WT)導(dǎo)致這種蛋白的磷酸化，其通過Western blot分析來檢測(圖9)。圖9表明ERK1/2蛋白的Western blot分析結(jié)果；含有對照的在更下面的線中。
用物質(zhì)(Ic’)處理導(dǎo)致蛋白ERK1/2的劑量依賴性磷酸化。即使在相應(yīng)于IC50的劑量，可以展現(xiàn)物質(zhì)(Ic’)的磷酸化作用。作為此過程的結(jié)果-目前文獻(xiàn)中解釋為活化作用-腫瘤細(xì)胞處于細(xì)胞周期停止，這通過細(xì)胞周期分析來表明(見上)。
為檢查這些發(fā)現(xiàn)，即通過物質(zhì)(Ic’)對ERK1/2的活化所得到的結(jié)果在多大程度上可被加入ERK1/2抑制物來拮抗，可以用物質(zhì)(Ic’)和特異性ERK1/2抑制物(MAP蛋白激酶抑制物)共同融合實(shí)驗(yàn)。在此例中，腫瘤細(xì)胞，舉例來說為結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT8 WT)，其在每個例子中與活性成分在不同的劑量中共同融合24小時(圖10)。圖10代表用物質(zhì)(Ic’)和特異性ERK1/2抑制物(MAP蛋白激酶抑制物)共同融合實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞毒性。HCT8 WT細(xì)胞被共同融合。顯示的點(diǎn)代表兩種活性成分之間的相應(yīng)的比率(代表性IC50的濃度的百分比)。
然而，通過這種方式進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致在任何劑量比例中沒有廢除標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞毒性。相反的，兩個活性成分在共同融合上顯著的協(xié)同效應(yīng)是明顯的。
所有的劑量組合低于二等分因此其在明確的協(xié)同效應(yīng)范圍內(nèi)。將物質(zhì)(Ic’)的IC50濃度的30％和特異性ERK1/2抑制物的IC50濃度的30％相結(jié)合導(dǎo)致對從結(jié)腸癌(HCT8 WT)分離的腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用。
權(quán)利要求
1.分子式(I)的取代的二環(huán)[3.3.1]壬烷-2，4，9三酮的應(yīng)用 其中·R1，R2，R4和R5，相同或不同，獨(dú)立的為下述基團(tuán)中之一 但其附帶限制條件為如果自由基R1或R2或R4或R5為苯?；@些自由基中的其它則不是苯?；?，·R3為氫原子，·R6和R7都同為甲基或同為氫基，R8和R9都同為甲基或同為氫基，但其附帶限制條件為如R6和R7為甲基，則R8和R9為氫基；如R8和R9為甲基，則R6和R7為氫基；以及它們的生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物，特別是產(chǎn)生用來預(yù)防性和/或治療性(醫(yī)療性)處理腫瘤或癌癥疾病以及病毒疾病的藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中的應(yīng)用，其特征為分子式(I)的組合物選自下列化合物中的基團(tuán)
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中的應(yīng)用，其特征為分子式(I)的組合物為下列分子式(Ic)的化合物
4.根據(jù)權(quán)利要求3中的所要求的應(yīng)用，其特征為分子式(Ic)的化合物具有下列特征
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中的任何一個所要求的應(yīng)用是為預(yù)防性和/或治療性處理腫瘤和/或癌癥疾病，特別是在原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移灶，和/或初癌狀態(tài)(癌癥的早期階段)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中的任何一個所要求的應(yīng)用是為預(yù)防性和/或治療性處理良性腫瘤和惡性腫瘤。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6中的任何一個所要求的應(yīng)用是為預(yù)防性和/或治療性處理腸內(nèi)癌癥(結(jié)腸癌)，乳腺癌癥(乳癌)，卵巢癌，子宮癌，肺癌，胃癌，肝癌，胰腺癌，腎癌，膀胱癌，前列腺癌，睪丸癌，骨癌，皮膚癌，卡波西肉瘤，腦瘤，肌肉瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤(即成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)，淋巴瘤和白血病。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至6中的任何一個所要求的應(yīng)用，其特征為分子式(I)的化合物被全身性給藥和/或局部給藥。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中的任何一個所要求的應(yīng)用，其特征為分子式(I)的化合物抑制和/或停止腫瘤和/或癌細(xì)胞的細(xì)胞生長和細(xì)胞分裂。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中的任何一個所要求的應(yīng)用，其特征為分子式(I)的化合物誘導(dǎo)腫瘤和/或癌細(xì)胞的DNA破壞。
11.如上所描述的分子式(I)的化合物，以及其生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物作為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制物和端粒酶抑制物的應(yīng)用。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到11中的任何一個所要求的應(yīng)用，其特征為如上所定義的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物與至少一種化學(xué)治療試劑結(jié)合使用，特別是蛋白激酶抑制物，優(yōu)選的為MAP蛋白激酶抑制物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12中所要求的應(yīng)用，其特征為如上所定義的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物，以及另外至少一種化學(xué)治療試劑或同時或依次的被使用或給藥。
14.一種制藥組合物或藥物，特別是抑制細(xì)胞生長或抑制病毒生長的組合物，包含如上所定義的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物，以及一種藥劑上可接受的，本質(zhì)為無毒的載體或賦形劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求14中所要求的制藥組合物或藥物，包含至少一種處于有效治療劑量的如上所定義的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15中所要求的制藥組合物或藥物可以全身性和/或局部使用。
17.一種制藥組合物，特別是抑制細(xì)胞生長的組合，其包括(A)至少一種如上所定義的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物；以及(B)至少一種化學(xué)治療試劑，特別是蛋白激酶抑制物，有效的為MAP蛋白激酶抑制物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17中所要求的藥物組合物，特征為組分(A)和組分(B)存在或者作為功能單元，特別是以一種混合物或一種配制或一種混合的形式，或者是兩者分離的形式(空間上)。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18中所要求的藥物組合物，其中組分(A)和組分(B)能夠被或同時性或依次性的使用或者給藥。
20.根據(jù)權(quán)利要求17到19中的任何一個所要求的藥物組合物，包含分別為治療有效量的組分(A)和組分(B)。
21.根據(jù)權(quán)利要求17到20中的任何一個所要求的藥物組合物可以全身性和/或局部使用。
22.根據(jù)如上所定義的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物用來預(yù)防性和/或治療性處理疾病。
23.根據(jù)如上所定義的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物作為活性藥物成分和/或藥物的活性藥物成分。
24.根據(jù)如上所定義的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物用于預(yù)防性和/或治療性處理腫瘤和/或癌癥疾病，特別是在原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移灶，和/或初癌狀態(tài)(癌癥的早期階段)，特別是腸內(nèi)癌癥(結(jié)腸癌)，乳腺癌癥(乳癌)，卵巢癌，子宮癌，肺癌，胃癌，肝癌，胰腺癌，腎癌，膀胱癌，前列腺癌，睪丸癌，骨癌，皮膚癌，卡波西肉瘤，腦瘤，肌肉瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤(即成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)，淋巴瘤和白血病。
25.根據(jù)如上所定義的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物，特別是權(quán)利要求22到24中的任何一個所要求的，用來抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶和/或端粒酶。
26.根據(jù)如上所定義的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物，特別是權(quán)利要求22或23中的任何一個所要求的，用來治療性處理病毒性疾病。
27.根據(jù)如上所定義的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物，特別是權(quán)利要求22到26中的任何一個所要求的，可以全身性和/或局部使用。
28.根據(jù)如上所定義的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物，作為MAP蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的調(diào)控物。
29.根據(jù)如上所定義的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性鹽，水化物，異構(gòu)體，特別是立體異構(gòu)體，互變異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，衍生物，原藥和代謝物，用來產(chǎn)生預(yù)防性和/或治療性病毒疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明是涉及取代的二環(huán)[3.3.1]壬烷－2，4，9三酮的使用，特別是克魯西(clusianone)或克魯西的衍生物作為活性藥物成分或藥劑中的活性成分，特別是用于產(chǎn)生用來預(yù)防性和/或治療性(醫(yī)療性)處理腫瘤或癌癥疾病以及病毒疾病的藥物。上述組合物可以用于細(xì)胞抑制劑的和抗病毒劑(病毒抑制劑)。特別是作為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制物和/或端粒酶抑制物以及作為MAP激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控物，從而可以在細(xì)胞水平上對腫瘤或癌細(xì)胞增殖和病毒的復(fù)制進(jìn)行干預(yù)。
文檔編號A61K38/00GK1615127SQ02827411
公開日2005年5月11日 申請日期2002年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月21日
發(fā)明者西伯 西格弗雷德, 阿克塞爾 希爾格 拉爾夫, 戴茲卡巴羅 大衛(wèi) 申請人:西伯 西格弗雷德