專利名稱：寡核苷酸螯合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及寡核苷酸螯合物、其組合物和將寡核苷酸(ON)配制為螯合物的方法以及這些ON螯合物對施用ON的用途。
背景技術(shù)：
鹽是由酸和堿的相互作用(中和)產(chǎn)生的離子化合物。鹽由陽離子和陰離子組成，所述陽離子和陰離子相互作用以便保持電中性狀態(tài)。陰離子可以是無機的(例如CD或有機的例如乙酸根(ch3coo_)。由于在含水環(huán)境中陰離子和陽離子對呈解離狀態(tài)，含溶解的鹽(電解質(zhì))的水溶液能夠?qū)щ姟９押塑账崾蔷坳庪x子并且之前已被認(rèn)為僅表現(xiàn)為鹽，其中其陽離子相對物以解離狀態(tài)存在于溶液中。對人患者施用ON通常伴隨著與存在的核苷酸序列無關(guān)的一些廣泛的副作用。這些包括血液的抗凝(凝血酶原時間或PTT時間的提高)(Kandmiml Ia等,1998,Bioorgan. Med. Chem. Let. , 8:2103 ；Sheeban 等,Blood, 1998，92:1617 ;Nicklin等，1197, Nucleosides&Nucleotides,16:1145 ;Kwoh, 2008, Antisense Drug Tech.第2版，第374頁)和皮下施用時的注射部位反應(yīng)或ISR(硬化、炎癥、觸痛和疼痛)(Webb等，1997，Lancet, 349:9059 ;Schrieber 等，2001，Gastroenterol.，120:1339 ;Seawell等,2002,J.Pharmacol. Exp. Therap. , 303:1334 ；Kwoh, 2008, Antisense Drug Tech.第 2版，第383頁；Raal等，2010, Lancet, 375:998)?？鼓饔帽徽J(rèn)為是由與凝血級聯(lián)反應(yīng)的蛋白質(zhì)的非序列特異性相互作用介導(dǎo)的。因為ON已經(jīng)顯示出具有免疫刺激特性(通過Toll樣受體或TLR-介導(dǎo)的細(xì)胞因子誘導(dǎo))，ISR通常歸因于對皮下(SC)注射時需要以小體積(通常為Icc)施用高濃度0N，這被認(rèn)為在注射部位導(dǎo)致局部炎癥。近年來隨著基于核酸的治療的出現(xiàn)，在臨床研發(fā)中基于ON的化合物的增長數(shù)量也得到增加。歷史上大多數(shù)ON給藥方案已采用必須經(jīng)胃腸道外給予的一周多次劑量或一周單次劑量，因為ON的口服生物利`用度差。因為ON的靜脈輸注通常由反應(yīng)性(發(fā)熱、寒戰(zhàn)、虛弱)進(jìn)行劑量和速率限制并且將是慢性劑量方案中的邏輯需求，最近ON的臨床應(yīng)用已使用皮下(SC)施用途徑。這引起最小的全身給藥副作用但通常伴隨著不同嚴(yán)重程度的注射部位反應(yīng)(如上所述)，這也限制了通過這種施用途徑可實現(xiàn)的給藥。因此，提供IV或SC途徑施用過程中將減輕反應(yīng)性的ON制劑將是有用和可取的。此外，雖然認(rèn)為施用ON的抗凝作用是最小的，但其對消除ON的副作用以為人和非人受試者提供更大的范圍的安全性同樣是有用的。因此，需要提供一種改善的ON制劑。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)目前的描述，現(xiàn)在提供一種包含由多價陽離子連接的兩個或更多個寡核苷酸的寡核苷酸螯合物。進(jìn)一步提供用于皮下施用的寡核苷酸制劑，該寡核苷酸制劑包含如本文所述的寡核苷酸螯合物。還公開了一種包含本文所述的寡核苷酸螯合物或寡核苷酸制劑以及載體的藥物組合物。進(jìn)一步公開了一種減少與對受試者施用寡核苷酸相關(guān)的肝或腎功能障礙的方法，所述方法包括如下步驟對受試者施用作為如本文所述的螯合物的寡核苷酸、如本文所公開的寡核苷酸制劑或如本文所公開的藥物組合物。本文公開了通過施用作為鈣螯合物或其他適當(dāng)?shù)腛N金屬螯合物的0N、本文所述的寡核苷酸制劑或本文所述的藥物組合物來阻抑、抑制或減少由ON引起的血液抗凝的方法。本文還公開了通過制備作為鈣螯合物或其他適當(dāng)?shù)腛N金屬螯合物的0N、本文所述的寡核苷酸制劑或本文所述的藥物組合物來改善通過IV輸注施用的任何ON的耐受性的
方法。
本文公開了用于阻抑或減少施用作為鈣螯合物或其他適當(dāng)?shù)腛N金屬螯合物的0N、本文所述的寡核苷酸制劑或本文所述的藥物組合物時的注射部位反應(yīng)的方法。特別地，通過皮下施用所述0N。本文公開了通過提供作為鈣螯合物或其他適當(dāng)?shù)腛N金屬螯合物的0N、本文所述的寡核苷酸制劑或本文所述的藥物組合物來阻抑金屬與通過任何途徑施用的任何ON螯合的方法。本文公開了通過施用作為鈣螯合物或其他適當(dāng)?shù)腛N金屬螯合物的0N、本文所述的寡核苷酸制劑或本文所述的藥物組合物來減少任何ON的血清半衰期的方法。本文公開了通過施用作為鈣螯合物或其他適當(dāng)?shù)慕饘衮衔锏?N、本文所述的寡核苷酸制劑或本文所述的藥物組合物來減少血清蛋白質(zhì)與任何ON相互作用的方法。特別地，通過IV輸注對受試者施用該寡核苷酸螯合物、制劑或組合物。本文還公開了一種寡核苷酸制劑，其中在寡核苷酸使用時給寡核苷酸提供來自下列任何一種的二價金屬陽離子源作為ON螯合物鈣、鎂、鈷、鐵、錳、鋇、鎳、銅和/或鋅。因此本文描述了包含鈣的寡核苷酸制劑；包含鎂的寡核苷酸制劑；包含鈷的寡核苷酸制劑；包含鐵(2+)的寡核苷酸制劑；包含錳的寡核苷酸制劑；包含銅的寡核苷酸制劑；包含鋅的寡核苷酸制劑。本文公開了單獨或組合使用以下任何金屬陽離子制備ON金屬螯合物的方法鈣、鎂、鈷、鐵、猛、鋇、鎳、銅和/或鋅。還公開了一種制備如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制劑或本文所述的藥物組合物的方法，所述方法包括將任何寡核苷酸鈉鹽溶解在藥學(xué)上可接受的水性賦形劑中，并且逐漸地將二價金屬鹽溶液加入到溶解的寡核苷酸中，以使該寡核苷酸螯合物保持溶解性。本文公開了一種在受試者體內(nèi)使用寡核苷酸鈉鹽螯合以下二價金屬陽離子的方法丐、鎂、鈷、鐵、猛、鋇、鎳、銅、鋅、鎘、萊、鉛、鈹、銀、錯和/或任何其他金屬、過渡金屬、后過渡金屬、能夠以2+或3+電荷狀態(tài)存在的鑭系元素或錒系元素。本文還公開了一種通過制備作為鈣螯合物或其他適當(dāng)?shù)腛N金屬螯合物的0N、本文所述的寡核苷酸制劑或本文所述的藥物組合物來改善任何ON在溶液中的穩(wěn)定性的方法。特別地，公開了一種使寡核苷酸在水溶液中穩(wěn)定的方法。本文涵蓋多價陽離子是二價陽離子。本文涵蓋二價陽離子是呈2+電荷狀態(tài)的堿土金屬。本文涵蓋二價陽離子是呈2+電荷狀態(tài)的過渡或后過渡金屬。本文涵蓋二價陽離子是呈2+電荷狀態(tài)的鑭系金屬。本文涵蓋二價陽離子是呈2+電荷狀態(tài)的錒系金屬。二價陽離子可以是，單獨或組合的鈣、鎂、鈷、鐵、錳、鋇、鎳、銅和/或鋅。特別地，·本文所述的螯合物可以包含兩種或更多種不同的二價金屬陽離子。在進(jìn)一步的實施方案中，該螯合物包含至少一種雙鏈寡核苷酸。在另一個實施方案中，該螯合物包含至少一種具有一個硫代磷酸鍵的寡核苷酸。該螯合物還可以包含至少一種完全硫代磷酸化的寡核苷酸。該螯合物還可以包含至少一種具有一個2’修飾核糖的寡核苷酸。該螯合物還可以包含至少一種每個核糖經(jīng)2’ 0-甲基化的寡核苷酸。在一個實施方案中，該螯合物或制劑適于皮下施用，適于至少以下施用途徑眼內(nèi)、口服、腸溶、吸入、皮膚注射、肌內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射、鞘內(nèi)輸注、氣管內(nèi)、靜脈注射、靜脈輸注和局部施用。特別地，吸入施用可以是氣霧劑。進(jìn)一步涵蓋寡核苷酸由SEQ ID NO:3至14組成。進(jìn)一步涵蓋在添加金屬鹽之前溶解的寡核苷酸濃度是0. 01-100mg/mlo特別地，加入到溶解的寡核苷酸中的金屬鹽的比例可以是每IOOmg寡核苷酸為0. l-40mg 二價鹽。進(jìn)一步涵蓋寡核昔酸終濃度是0. l-lOOmg/ml。在進(jìn)一步的實施方案中，該金屬鹽是以下中的至少一種鹽酸鹽、葡萄糖酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、天冬氨酸鹽、延胡索酸鹽、抗壞血酸鹽、苯甲酸鹽、異抗壞血酸鹽和丙酸鹽。在另一個實施方案中，該金屬鹽溶液包含以下中的至少一種鈣、鎂、鈷、鐵(2+)、錳、銅和/或鋅。本文還涵蓋螯合物是鈣螯合物；鎂螯合物；或混合的鎂/鈣螯合物。還提供了如本文所述的多價陽離子在制備寡核苷酸螯合物中的用途。另外提供了如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制劑或本文所述的藥物組合物用于阻抑或減少對受試者施用寡核苷酸的抗凝作用的用途。提供了如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制劑或本文所述的藥物組合物用于阻抑或減少所述皮下施用寡核苷酸的受試者中的皮下注射部位反應(yīng)的用途。還提供了如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制劑或本文所述的藥物組合物用于改善通過IV輸注施用時受試者中寡核苷酸的耐受性的用途。還提供了如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制劑或本文所述的藥物組合物用于減少對受試者通過IV輸注施用時寡核苷酸的血清蛋白質(zhì)相互作用的用途。進(jìn)一步提供如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制劑或本文所述的藥物組合物用于減少受試者中的寡核苷酸的血清半衰期的用途。
還提供了如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制劑或本文所述的藥物組合物用于減少與在受試者中施用寡核苷酸相關(guān)的肝或腎功能障礙的用途。還提供了如本文所述的寡核苷酸螯合物、本文所述的寡核苷酸制劑或本文所述的藥物組合物用于使寡核苷酸在水溶液中穩(wěn)定的用途。表述“抗凝”意指正常血凝集或血塊形成的抑制。表述“螯合”意指通過另一種分子從游離溶液反應(yīng)中掩蔽或移除反離子(負(fù)或正)，所述另一種分子能夠與反離子結(jié)合形成螯合的絡(luò)合物。表述“二價金屬陽離子”是指以2+電荷狀態(tài)自然存在并且包括堿土金屬(根據(jù)IUPAC命名法的第2族元素)、過渡金屬、后過渡金屬、類金屬或鑭系元素的任何金屬陽離子。表述“三價金屬陽離子”是指以3+電荷狀態(tài)自然存在并且包括過渡金屬、后過渡金屬、類金屬、鑭系元素或錒系元素的任何金屬陽離子。


現(xiàn)在將參照附圖圖1示出ON的一般生理化學(xué)特征。A)通過高效液相色譜共分離REP 2006和具有確定序列的21mer硫代磷酸ON。B)通過質(zhì)譜鑒定21mer ON中的種類。C)通過質(zhì)譜鑒定REP 2006 ON中的種類。圖2示出通過熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸ON形成ON-鈣螯合物，所述熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸 ON 為A)各種大小 6mer(REP 2032-FL)、IOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或 2 ’0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL ；SEQ ID NO: 4)的熒光標(biāo)記的簡并ON。通過使用簡并寡核苷酸證明ON螯合物形成的非序列依賴性質(zhì)，但也使用序列特異性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到證明。通過在溶液中將遞增濃度的ACS級氯化鈣與FITC-標(biāo)記的寡核苷酸結(jié)合并且通過如實施例1所述的熒光偏振的增長監(jiān)測寡核苷酸螯合物的形成證明ON-鈣螯合物的形成。值表示重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖3示出通過熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸ON形成ON-鎂螯合物，所述熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸 ON 為A)各種大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或 2’0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL,SEQ ID NO:4)的熒光標(biāo)記的簡并ON。通過使用簡并寡核苷酸證明ON螯合物形成的非序列依賴性質(zhì)，但也使用序列特異性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到證明。通過在溶液中將遞增濃度的ACS級氯化鎂與FITC-標(biāo)記的寡核苷酸結(jié)合并且通過如實施例1所述的熒光偏振的增長監(jiān)測寡核苷酸螯合物的形成證明ON-鎂螯合物的形成。值表示重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖4示出通過熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸ON形成ON-鈷螯合物，所述熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸 ON 為A)各種大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或2，0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL,SEQ ID NO:4)的熒光標(biāo)記的簡并ON。通過使用簡并寡核苷酸證明ON螯合物形成的非序列依賴性質(zhì)，但也使用序列特異性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到證明。通過在溶液中將遞增濃度的ACS級氯化鈷與FITC-標(biāo)記的寡核苷酸結(jié)合并且通過如實施例1所述的熒光偏振的增長監(jiān)測寡核苷酸螯合物的形成證明ON-鈷螯合物的形成。值表示重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖5示出通過熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸ON形成ON-鐵螯合物，所述熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸 ON 為A)各種大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或2，0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL ；SEQ ID NO:4)的熒光標(biāo)記的簡并ON。通過使用簡并寡核苷酸證明ON螯合物形成的非序列依賴性質(zhì)，但也使用序列特異性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到證明。通過在溶液中將遞增濃度的ACS級氯化鐵與FITC-標(biāo)記的寡核苷酸結(jié)合并且通過如實施例1所述的熒光偏振的增長監(jiān)測寡核苷酸螯合物的形成證明ON-鐵螯合物的形成。值表示重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖6示出通過熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸ON形成ON-錳螯合物，所述熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸 ON 為A)各種大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或 2’0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL ；SEQ ID NO:4)的熒光標(biāo)記的簡并ON。通過使用簡并寡核苷酸證明ON螯合物形成的非序列依賴性質(zhì)，但也使用序列特異性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到證明。通過在溶液中將遞增濃度的ACS級氯化錳與FIT C-標(biāo)記的寡核苷酸結(jié)合并且通過如實施例1所述的熒光偏振的增長監(jiān)測寡核苷酸螯合物的形成證明ON-錳螯合物的形成。值表示重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖7示出通過熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸ON形成ON-鋇螯合物，所述熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸 ON 為A)各種大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或 2’0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL ；SEQ ID NO:4)的熒光標(biāo)記的簡并ON。通過使用簡并寡核苷酸證明ON螯合物形成的非序列依賴性質(zhì)，但也使用序列特異性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到證明。通過在溶液中將遞增濃度的ACS級氯化鋇與FITC-標(biāo)記的寡核苷酸結(jié)合并且通過如實施例1所述的熒光偏振的增長監(jiān)測寡核苷酸螯合物的形成證明ON-鋇螯合物的形成。值表示重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖8示出通過熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸ON形成ON-鎳螯合物，所述熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸 ON 為A)各種大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或 2’0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL ；SEQ ID NO:4)的熒光標(biāo)記的簡并ON。通過使用簡并寡核苷酸證明ON螯合物形成的非序列依賴性質(zhì)，但也使用序列特異性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到證明。通過在溶液中將遞增濃度的ACS級氯化鎳與FITC-標(biāo)記的寡核苷酸結(jié)合并且通過如實施例1所述的熒光偏振的增長監(jiān)測寡核苷酸螯合物的形成證明ON-鎳螯合物的形成。值表示重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖9示出通過熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸ON形成ON-銅螯合物，所述熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸 ON 為A)各種大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或 2’0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL ；SEQ ID NO:4)的熒光標(biāo)記的簡并ON。通過使用簡并寡核苷酸證明ON螯合物形成的非序列依賴性質(zhì)，但也使用序列特異性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到證明。通過在溶液中將遞增濃度的ACS級氯化銅與FITC-標(biāo)記的寡核苷酸結(jié)合并且通過如實施例1所述的熒光偏振的增長監(jiān)測寡核苷酸螯合物的形成證明ON-銅螯合物的形成。值表示重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖10示出通過熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸ON形成ON-鋅螯合物，所述熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸 ON 為A)各種大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或 2，0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL ；SEQ ID NO:4)的熒光標(biāo)記的簡并ON。通過使用簡并寡核苷酸證明ON螯合物形成的非序列依賴性質(zhì)，但也使用序列特異性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到證明。通過在溶液中將遞增濃度的ACS級氯化鋅與FITC-標(biāo)記的寡核苷酸結(jié)合并且通過如實施例1所述的熒光偏振的增長監(jiān)測寡核苷酸螯合物的形成證明ON-鋅螯合物的形成。值表示重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖11示出通過熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸ON形成ON-鎘螯合物，所述熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸 ON 為A)各種大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或 2，0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL ；SEQ ID NO:4)的熒光標(biāo)記的簡并ON。通過使用簡并寡核苷酸證明ON螯合物形成的非序列依賴性質(zhì)，但也使用序列特異性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到證明。通過在溶液中將遞增濃度的ACS級氯化鎘與FITC-標(biāo)記的寡核苷酸結(jié)合并且通過如實施例1所述的熒光偏振的增長監(jiān)測寡核苷酸螯合物的形成證明ON-鎘螯合物的形成。值表示重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖12示出通過熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸ON形成ON-汞螯合物，所述熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸 ON 為A)各種大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或 2，0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL ；SEQ ID NO:4)的熒光標(biāo)記的簡并ON 。通過使用簡并寡核苷酸證明ON螯合物形成的非序列依賴性質(zhì)，但也使用序列特異性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到證明。通過在溶液中將遞增濃度的ACS級氯化汞與FITC-標(biāo)記的寡核苷酸結(jié)合并且通過如實施例1所述的熒光偏振的增長監(jiān)測寡核苷酸螯合物的形成證明ON-汞螯合物的形成。值表示重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖13示出通過熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸ON形成ON-鉛螯合物，所述熒光標(biāo)記的簡并硫代磷酸 ON 為A)各種大小 6mer(REP 2032-FL) UOmer (REP 2003-FL)、20mer (REP2004-FL)、40mer(REP 2006-FL)和 B)利用硫代磷酸化(REP 2006-FL)、硫代磷酸化+2’0 甲基核糖(REP 2107-FL)或 2，0 甲基核糖(REP 2086-FL)和不同序列(poly C-REP 2031-FL ；SEQ ID NO:4)的熒光標(biāo)記的簡并ON。通過使用簡并寡核苷酸證明ON螯合物形成的非序列依賴性質(zhì)，但也使用序列特異性寡核苷酸(REP 2031 ；SEQ ID NO:4)得到證明。通過在溶液中將遞增濃度的ACS級氯化鉛與FITC-標(biāo)記的寡核苷酸結(jié)合并且通過如實施例1所述的熒光偏振的增長監(jiān)測寡核苷酸螯合物的形成證明ON-鉛螯合物的形成。值表示重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖14A示出不依賴ON序列的ON的一般化學(xué)性質(zhì)。無論序列如何，任何ON作為聚合物存在，其同時具有疏水和親水活性。硫代磷酸化(該圖中的化學(xué)結(jié)構(gòu)所示)用于增加該ON聚合物的疏水性，但不影響親水性。圖14B將二價和三價金屬陽離子的寡核苷酸螯合的性質(zhì)概念化。金屬陽離子(以灰色實心圓圈表示)通過磷酸二酯鍵中兩個或三個非橋氧或硫原子之間的金屬離子橋(以橢圓表示)連接ON聚合物的親水性表面。圖15示出在二價金屬陽離子存在下的不同ON和二價金屬陽離子濃度的ON的溶液行為的模型。A)低二價/三價金屬陽離子、低ON濃度產(chǎn)生二聚體或低階ON螯合物。B)增加二價/三價金屬陽離子濃度在溶液中產(chǎn)生更完全的ON螯合物形成。C)在二價或三價金屬存在下隨著金屬濃度的增加進(jìn)一步增加ON濃度能夠產(chǎn)生更高階的ON螯合物。(A)至(C)中所有螯合物在水溶液中是可溶的，由于其具有仍暴露在含水環(huán)境的親水性表面因此保持溶解度。D)在足夠的ON和金屬濃度時，現(xiàn)在所有親水性表面被限制在該ON螯合物內(nèi)，僅留下暴露在含水環(huán)境的疏水性表面。這導(dǎo)致ON螯合物的沉淀。圖16示出熒光-ON螯合物的溶液行為對熒光偏振的影響。隨著金屬濃度的增加，ON螯合物形成的大小(和質(zhì)量)也增加(見圖15)并且因此在溶液中翻滾更慢。該絡(luò)合物在溶液中的這種較慢翻滾導(dǎo)致熒光偏振增加和mP值增加。

圖17示出如通過熒光偏振所測量，用氯化鈣或硫酸鈣形成ON螯合物。A)用REP 2055-FL(SEQ ID NO:6)和 REP 2056_FL(SEQ ID NO:7)形成 ON 螯合物。B)用 REP2033-FL(SEQ ID NO: 5)和REP 2029_FL(SEQ ID NO: 2)形成ON螯合物。值表示重復(fù)測量的
平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖18示出如通過熒光偏振所測量，用氯化鈣或硫酸鈣形成ON螯合物。A)用REP2028-FL沒有形成ON螯合物和用REP 2057_FL(SEQ ID NO:8)形成ON螯合物。B)用REP2120-FL和REP 2030-FL形成ON螯合物。值表示重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖19示出如通過熒光偏振所測量，用氯化鈣或硫酸鈣形成ON螯合物。A)用REP 2129-FL(SEQ ID N0:12)和 REP 2126_FL(SEQ ID NO:9)形成 ON 螯合物。B)用 REP2128-FL(SEQ ID NO: 11)和 REP 2127_FL(SEQ IDNO: 10)形成 ON 螯合物。值表示重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖20示出如通過熒光偏振所測量，用氯化鈣或硫酸鈣形成ON螯合物。A)用REP2139-FL(SEQ ID NO: 13)和REP 2006-FL形成ON螯合物。B)用 REP 2045-FL和 REP 2007-FL
形成ON螯合物。值表示重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖21示出如通過熒光偏振所測量，用氯化鎂或硫酸鎂形成ON螯合物。A)用REP 2055-FL(SEQ ID NO:6)和 REP 2056_FL(SEQ ID NO:7)形成 ON 螯合物。B)用 REP2033-FL(SEQ ID NO:5)和 REP 2029_FL(SEQ ID NO: 12)形成 ON 螯合物。值表示重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖22示出如通過熒光偏振所測量，用氯化鎂或硫酸鎂形成ON螯合物。A)用REP2028-FL(SEQ ID NO: 11)沒有形成 ON 螯合物，且用 REP 2057_FL(SEQ ID NO:8)形成 ON 螯合物。B)用REP 2120-FL和REP 2030_FL(SEQ ID NO: 3)形成ON螯合物。值表示重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖23示出如通過熒光偏振所測量，用氯化鎂或硫酸鎂形成ON螯合物。A)用REP 2129-FL(SEQ ID N0:12)和 REP 2126_FL(SEQ ID NO:9)形成 ON 螯合物。B)用 REP2128-FL(SEQ ID NO: 11)和 REP 2127_FL(SEQ IDNO: 10)形成 ON 螯合物。值表示重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖24示出如通過熒光偏振所測量，用氯化鎂或硫酸鎂形成ON螯合物。A)用REP2139-FL(SEQ ID NO: 13)和REP 2006-FL形成ON螯合物。B)用 REP 2045-FL和REP 2007-FL
形成ON螯合物。值表示重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖25示出如通過熒光偏振所測量，在氯化鈣或氯化鎂存在下形成兩種不同的雙鏈 ON 螯合物。通過 REP 2055-FL(SEQ ID NO:6)和 REP 2033_FL(SEQ ID NO: 5)雜交以及REP 2057-FL(SEQ ID NO:8)和 REP 2056_FL(SEQ ID NO: 7)雜交制備雙鏈 ON。值表示三次
重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖26示出僅在二價金屬陽離子(Mg2+和Ca2+)存在下而不是在一價陽離子(Na+、K+或NH4+)存在時，形成不同的ON螯合物。值表示三次重復(fù)測量的平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖27示出向人血液 添加不同大小(REP 2004，REP 2006)和不同化學(xué)成分(REP2006，REP 2107)的各種濃度的ON的抗凝作用。通過使用簡并寡核苷酸(REP 2004，REP2006，REP2107)證明該相互作用的非序列依賴方式，但也使用序列特異性的寡核苷酸(REP2031 ;SEQ ID N0:4)得到證明。采用公認(rèn)的臨床實驗室測試方法，通過測量凝血酶原時間(PTT)并將其與血液中生理鹽水存在下的PTT進(jìn)行比較來監(jiān)測這些化合物存在下的血液抗凝。存在和不存在藥物時的PTT的比值產(chǎn)生歸一化比值(NR)。NR為I表明正常血液凝集活性并且NR大于I表明血液凝集活性已減弱(抗凝)。圖28示出通過添加CaCl2阻抑寡核苷酸的抗凝作用。將REP2055 (具有序列(AC) 20的40mer硫代磷酸；SEQ ID NO:6)以2. 5mM添加至血液，該濃度誘導(dǎo)顯著的血液抗凝。將REP 2055與CaCl2的各種組合相結(jié)合并且使用公認(rèn)的臨床實驗室測試方法測定添加的每種濃度的CaCl2的作用。使用公認(rèn)的測試方法，通過測量凝血酶原時間(PTT)并將其與血液中生理鹽水存在下的PTT進(jìn)行比較來監(jiān)測這些化合物存在下的血液抗凝。存在和不存在藥物時的PTT的比值產(chǎn)生歸一化比值(NR)。NR為I表明正常血液凝集活性并且NR大于I表明血液凝集活性已減弱(抗凝)。圖29示出在患有慢性肝病的患者中長期ON治療對總血清鈣的鈣螯合作用。未接受礦物質(zhì)補充劑的患者如(A)所示,而接受補充劑同時經(jīng)歷ON治療的患者如(B)所示。
具體實施例方式本文提供了以下證明，ON螯合不同的二價金屬陽離子，包括鈣、鎂、鈷、鐵、錳、鋇、鎳、銅、鋅、鎘、汞和鉛。進(jìn)一步證明這些二價陽離子的螯合導(dǎo)致形成由通過金屬陽離子連接的兩個或更多個ON組成的ON螯合物，并且例如，但不限于，在長度在6和80之間的核苷酸的0N，并且在磷酸二酯或硫代磷酸寡核苷酸存在下發(fā)生。螯合還同樣伴隨在核糖含有2’修飾的或不含修飾的寡核苷酸發(fā)生。此外，金屬陽離子的螯合不依賴于所存在的核苷酸的序列，但依賴于所有寡核苷酸共同的生理化學(xué)特征(見圖14A)。本文提出如下發(fā)現(xiàn)，在含有任何簡單的二價金屬陽離子(例如但不限于，Ca2+、Mg2+、Fe2+)的水溶液中寡核苷酸不是作為鹽存在，而是作為ON的螯合的絡(luò)合物存在。這些絡(luò)合物由寡核苷酸二聚物或更高階分子組織組成，其中ON通過二價金屬離子橋在其磷酸二酯主鏈相連(見圖14B)。在具體的ON和金屬陽離子濃度時，這些螯合的絡(luò)合物在水溶液中是穩(wěn)定的和可溶的，并且有效地從溶液相互作用中掩蔽ON螯合物中的任何二價陽離子。這種螯合物形成同樣有可能用帶3+或更多電荷的簡單金屬陽離子發(fā)生(如圖14B所示)。因此ON用作二價陽離子螯合劑并且不與二價陽離子形成鹽。重要地是，寡核苷酸螯合物的形成不用一價陽離子例如Na+、K+或NH4+發(fā)生，并且因此不大可能用任何一價陽離子發(fā)生。因此，術(shù)語“寡核苷酸鹽”明確地僅限于具有一價陽離子或具有不與寡核苷酸形成螯合物的陽離子的寡核苷酸鹽，并且不正確地用于描述以具有二價金屬陽離子(或甚至三價金屬陽離子)的溶液或粉末形式存在的寡核苷酸。本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)清晰地教導(dǎo)了僅作為鈉鹽的ON的施用。這通過在臨床試驗中施用大量作為鈉鹽的寡核苷酸進(jìn)行例證，其中包括Fominirisen (ISIS 2922)、Mipomersen(ISIS 301012)、Trecovirsen(GEM 91)、Custirsen(0GX-011/ISIS 112989)、Genasense(G3139)和 Aprinocarsem(ISIS3531/LY 900003) (Geary 等，2002，Clin.Pharmacokinetics, 41:255-260 ；Yu 等，2009，Clin.Pharmacokinetics,48:39-50 ；Sereni 等，1999，J. Cl in. Pharmacol.，39 : 47-54 ;Chi 等，2005，J. Nat. Cane.1nst. , 97:1287-1296 ;Marshall 等，2004，Ann. Oncol. , 15:1274-1283 ;Grossman 等，2004, Neuro-OncoI, 6:32-40)。本文還提供如下證明，如通過由加入氯化鈣來恢復(fù)血液中正常的游離鈣而逆轉(zhuǎn)寡核苷酸誘導(dǎo)的抗凝所表明，由寡核苷酸引起的血液的抗凝是由寡核苷酸對鈣的螯合而導(dǎo)致的。本文還提供如下證明，如通過注射制備為鈣螯合物的ON抑制注射部位反應(yīng)(ISR)所表明，用皮下注射寡核苷酸所觀察的注射部位反應(yīng)(硬化、炎癥、觸痛和疼痛)至少部分是由于鈣和可能其他二價陽離子(例如鎂)在注射部位被寡核苷酸局部螯合。熒光偏振是一種常見的用于檢驗分子間相互作用的方法。在該技術(shù)中，用熒光標(biāo)簽(例如FITC)標(biāo)記誘餌(即任何0N)。在溶液中，由于布朗運動誘餌分子自由地翻滾，這導(dǎo)致當(dāng)誘餌受到正確波長的光激發(fā)時的差偏振熒光發(fā)射。使用足夠分子量(至少與誘餌的大小相同)的配體，誘餌和配體間的相互作用引入大量絡(luò)合物在溶液中翻滾的抑制。由于這種溶液中抑制的翻滾，熒光發(fā)射在激發(fā)后變得顯著偏振。因此使用這種技術(shù)，可以在溶液中測量相互作用而對任何結(jié)合配偶體無物理限制。將熒光偏振報道為無量綱mP，其與反應(yīng)中所結(jié)合的誘餌分子的分?jǐn)?shù)成正比。例如，若很少部分的誘餌分子由特定的配體結(jié)合，則將存在很小的熒光偏振，并從而有很小的mP值。在譜的另一端，若大部分誘餌分子由特定的配體(或與更高濃度的配體)結(jié)合，則將存在大量的熒光偏振，并從而有大的mP值。以這種方式，可通過在固定量的熒光標(biāo)記的誘餌存在下改變配體的濃度來產(chǎn)生特定誘餌-配體相互作用的結(jié)合等溫線。本文采用不同的熒光標(biāo)記的ON以檢驗在一價和二價陽離子存在下其絡(luò)合物的形成。雖然通過熒光偏振監(jiān)測絡(luò)合物的形成要求這些ON經(jīng)熒光標(biāo)記，但是將標(biāo)記在3’端附著于ON以便不干擾ON的含氮堿基或磷酸二酯主鏈?zhǔn)怯袉栴}的。此外通過剛性3碳連接基團使熒光標(biāo)簽遠(yuǎn)離0N,以進(jìn)一步排除溶液中正常ON行為的任何擾動。因此采用含熒光標(biāo)記ON的使用熒光偏振在本文觀察的任何ON絡(luò)合物的形成是未標(biāo)記ON(無論絡(luò)合或未絡(luò)合)的溶液行為的準(zhǔn)確代表。術(shù)語寡核苷酸(ON)指核糖核酸(RNA)和/或脫氧核糖核酸(DNA)和/或其類似物的寡聚物或聚合物。該術(shù)語包括由天然存在的核堿基、糖和共價核苷間(主鏈)鍵組成的寡核苷酸以及具有類似地發(fā)揮作用的非天然存在的部分的寡核苷酸。由于其理想的特性，例如，增強的細(xì)胞攝取、對靶核酸增強的親和力和核酸酶存在下增強的穩(wěn)定性，與其天然形式相比，這種修飾的或取代的寡核苷酸通常是優(yōu)選的。在本申請中，術(shù)語“簡并寡核苷酸”意指在每一個位置具有一個擺動(wobble) (N)，例如NNNNNNNNNN的單鏈寡核苷酸。將每一個堿基合成為一個擺動，如此這種ON實際上以不同的隨機產(chǎn)生的相同長度和生理化學(xué)性質(zhì)的序列的群存在。例如，對于40個堿基長度的ON簡并物，群中任何特定 序列將理論上代表總部分的1/44°或8. 3X 10_25。鑒于I摩爾=6. 022X IO23個分子，并且迄今沒有合成已超過2毫摩爾的簡并物的事實，所以具有存在的特定序列的任何寡核苷酸在任何制劑中有效地存在不超過I次。因此在這種制劑中觀察的任何絡(luò)合物的形成必須是由于寡核苷酸的非序列依賴(或不依賴于序列)的生理化學(xué)性質(zhì)，因為具有確定序列的任何特定的寡核苷酸(在制備中是唯一的)不能預(yù)期有助于來自其具體核苷酸序列的任何活性。作為這個概念的進(jìn)一步說明，實施例1通過高效液相色譜和質(zhì)譜將REP2006 (具有簡并硫代磷酸化序列的40mer ON)與確定序列的21mer的特征相比較,并且清晰地顯示具有相似大小和化學(xué)修飾(即硫代磷酸化)的任何ON將具有高度相似(若不相同)的不受所存在的核苷酸序列影響的生理化學(xué)性質(zhì)。寡核苷酸可以包括各種修飾，例如，穩(wěn)定化修飾，因此并且可以包括在磷酸二酯鍵和/或在糖和/或在堿基上的至少一種修飾。例如，寡核苷酸可以包括但不限于，一個或多個硫代磷酸鍵、二硫代磷酸鍵和/或甲基磷酸鍵。不同的化學(xué)相容的修飾鍵可以組合，例如，其中合成條件是化學(xué)相容的修飾。雖然修飾的鍵是有用的，但是寡核苷酸可以包括其中寡核苷酸聚合物的一般生理化學(xué)性質(zhì)基本不受影響的磷酸二酯鍵。另外有用的修飾包括但不限于，在糖的2’ -位的修飾，例如2’ -0烷基修飾(例如2’ -0-甲基修飾)、2’ -氨基修飾、2’ -鹵代修飾(例如2’ -氟代)；無環(huán)核苷酸類似物。本領(lǐng)域還已知其他修飾，并且可以用于例如鎖核苷酸。特別地，整個寡核苷酸具有修飾的鍵，例如，硫代磷酸；具有3’-和/或5’ -帽；包括末端3’ -5’鍵；寡核苷酸是或者包括由被連接基團接合的兩個或更多個寡核苷酸序列組成的多聯(lián)體。還提供了一種藥物ON組合物，其使用治療有效量的藥理學(xué)上可接受的如本文所述的寡核苷酸螯合物來防止寡核苷酸誘導(dǎo)的抗凝，該螯合物使用以下任何金屬陽離子制備鈣、鎂、鈷、錳、鐵、銅和/或鋅。該ON螯合物可以使用如上所述的兩種或更多種不同的陽離子制備。特別地，該藥物組合物被批準(zhǔn)用于對人或非人動物(例如非人靈長類動物)施用。還提供了一種藥物ON組合物，其防止伴隨皮下施用的注射部位反應(yīng)，所述皮下施用含有治療有效量的藥理學(xué)上可接受的如本文所述的ON螯合物，該ON螯合物使用以下任何金屬陽離子制備鈣、鎂、鈷、錳、鐵、銅和/或鋅。該ON螯合物也可以使用如上所述的兩種或更多種不同的陽離子制備。特別地，該藥物組合物被批準(zhǔn)用于對人或非人動物(例如非人靈長類動物)施用。還提供了一種藥物ON組合物，其改善IV輸注的耐受性，所述IV輸注含有治療有效量的藥理學(xué)上可接受的ON螯合物，該ON螯合物使用以下任何金屬陽離子制備鈣、鎂、鈷、錳、鐵、銅和/或鋅。該ON螯合物也可以使用如上所述的兩種或更多種不同的陽離子制備。特別地，該藥物組合物被批準(zhǔn)用于對人或非人動物(例如非人靈長類動物)施用。還提供了一種藥·物ON組合物，其使用治療有效量的藥理學(xué)上可接受的ON螯合物防止寡核苷酸誘導(dǎo)的鈣、鎂、鐵、錳、銅或鋅的缺乏，該ON螯合物使用以下任何金屬陽離子制備鈣、鎂、鈷、錳、鐵、銅和/或鋅。該ON螯合物也可以使用如上所述的兩種或更多種不同的陽離子制備。特別地，該藥物組合物被批準(zhǔn)用于對人或非人動物(例如非人靈長類動物)施用。還提供了一種藥物ON組合物，其具有改善的儲存穩(wěn)定性，其含有治療有效量的藥理學(xué)上可接受的ON螯合物，該ON螯合物使用以下任何金屬陽離子制備鈣、鎂、鈷、錳、鐵、銅和/或鋅。該ON螯合物也可以使用如上所述的兩種或更多種不同的陽離子制備。特別地，該藥物組合物被批準(zhǔn)用于對人或非人動物(例如非人靈長類動物)施用。還提供了一種藥物ON組合物，其具有降低的血清半衰期或減少的與血清蛋白質(zhì)的相互作用，其含有治療有效量的藥理學(xué)上可接受的ON螯合物，該ON螯合物使用以下任何金屬陽離子制備丐、鎂、鈷、猛、鐵、銅和/或鋅。該ON螯合物也可以使用如上所述的兩種或更多種不同的陽離子制備。特別地，該藥物組合物被批準(zhǔn)用于對人或非人動物(例如非人靈長類動物)施用。此外，上述組合物可以包括生理上和/或藥學(xué)上可接受的載體、佐劑、媒介物和/或賦形劑。載體的特征可取決于施用途徑。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體、佐劑、媒介物和/或賦形劑”是指可以對受試者施用，并入本發(fā)明的組合物中，并且不破壞其藥理學(xué)活性的載體、佐劑、媒介物和/或賦形劑?？捎糜诒疚乃龅乃幬锝M合物中的藥學(xué)上可接受的載體、佐劑、媒介物和賦形劑包括但不限于下列離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化遞藥系統(tǒng)(“SEDDS”)、以藥物劑型使用的表面活性劑(例如吐溫或其他相似的聚合遞送基質(zhì))、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、緩沖物質(zhì)(例如磷酸鹽)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、鹽或電解質(zhì)(例如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽)、硅膠、三硅酸鎂、聚乙烯卩比咯烷酮、基于纖維素的物質(zhì)、聚乙二醇、羥甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂、環(huán)糊精(例如a-、￠-和Y-環(huán)糊精)或化學(xué)修飾的衍生物(例如羥基烷基環(huán)糊精，包括2-和3-羥丙基-環(huán)糊精的)或其他溶解的衍生物也可以用于增強本發(fā)明組合物的遞送。本文描述的組合物可以含有如下所述的其他治療劑，并且可以，例如，根據(jù)藥物配制領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的技術(shù)，通過采用常規(guī)的固體或液體媒介物或稀釋劑，以及適用于預(yù)期施用方式的類型的藥物添加劑(例如，賦形劑、黏合劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、調(diào)味劑等)進(jìn)行配制。本文描述的組合物可以通過任何合適的方式施用，例如，口服，例如片劑、膠囊劑、顆粒劑或粉末的形式；舌下；口含；胃腸外，例如通過皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或胸骨內(nèi)(intrastemal)注射或輸注技術(shù)(例如，作為無菌可注射水或非水溶液或懸浮液)；經(jīng)鼻，例如通過吸入噴霧；局部，例如乳膏或軟膏形式；或直腸，例如栓劑形式；以含有無毒、藥學(xué)上可接受的媒介物或稀釋劑的劑量單位制劑。本發(fā)明組合物可以，例如，以適合即時釋放或延長釋放的形式施用。即時釋放或延長釋放可以通過使用合適的藥物組合物實現(xiàn)，或，特別是在延長釋放的情況下，通過使用裝置(例如皮下植入物或滲透泵)實現(xiàn)。因此，上述組合物可以適于通過以下任何途徑施用眼內(nèi)、口服、腸溶、吸入、皮膚注射、皮下注射、肌內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射或輸注、氣管內(nèi)、靜脈注射或輸注或局部施用。用于口服施用的示例性組合物包括懸浮液，其可含有例如，用于提供大量藻酸或藻酸鈉作為懸浮劑的微晶纖維素、作為增稠劑的甲基纖維素和甜味劑或調(diào)味劑例如本領(lǐng)域已知的那些；并且即時釋放片劑可以含有，例如，微晶纖維素、磷酸二鈣、淀粉、硬脂酸鎂和/或乳糖和/或其他賦形劑、黏合劑、填充劑、崩解劑、稀釋劑和潤滑劑，例如本領(lǐng)域已知的那些。本發(fā)明的組合物也可以經(jīng)由舌下和/或口含施用通過口腔遞送。模制片、壓制片或凍干片是可以使用的示例性形式。示例性組合物包括用快速溶解的稀釋劑例如甘露糖醇、乳糖、蔗糖和/或環(huán)糊精配制本發(fā)明的組合物的那些。在這種制劑中也可以包括高分子量的賦形劑例如纖維素(avicel)或聚乙二醇(PEG)。這種制劑也可以包括有助于使粘膜附著的賦形劑，例如羥基丙基纖維素(HPC)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羧甲基纖維素鈉(SCMC)、馬來酸酐共聚物(例如，Gantrez)和控制釋放的試劑，例如聚丙烯酸共聚物(例如，Carbopol934)。為了方便加工和使用，還可以添加潤滑劑、助流劑、調(diào)味齊[J、著色劑和穩(wěn)定劑。本文描述的化合物的有效量可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員確定，并且包括用于成人的示例性劑量即每天約0. l -500mg/kg體重的活性化合物，可以以單劑量或單次分劑量施用，例如每天從I至5次。應(yīng)理解，對任何特定受試者的具體劑量水平和劑量頻率可以改變并且將取決于多種因素，包括所采用的具體化合物的活性、該化合物的代謝穩(wěn)定性和活動長度、種類、受試者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食、施用的方式和時間、排泄和清除的速率、藥物組合以及特定病癥的嚴(yán)重程度。對于治療的優(yōu)選的受試者包括經(jīng)受血管生成依賴性或血管生成相關(guān)病狀的動物，更優(yōu)選地哺乳動物例如人和家養(yǎng)動物例如狗、貓
坐寸o該藥物組合物也可以含有其他增強活性的活性因子和/或活性劑。用于施用的藥物組合物和制劑可以包括皮膚藥貼、軟膏、洗劑、霜劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體、粉末和氣霧劑。常規(guī)的藥物載體、水溶液、粉末或油性基質(zhì)、增稠劑等可以是必要的或需要的。其他制劑包括其中ON與局部遞送劑(例如脂質(zhì)、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑和表面活性劑)混合的那些。優(yōu)選的脂質(zhì)和脂質(zhì)體包括中性(例如二油酰基磷?；鵇OPE乙醇胺、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿DMPC、二硬脂酰磷脂酰膽堿)、負(fù)(例如，二肉豆蘧酰磷脂酰甘油DMPG)和陽離子(例如，二油?；募装北鵇0TAP、二油?；柞；掖及稤0TMA)和其他的遞送劑或分子。ON可以包封在脂質(zhì)體內(nèi)或可以形成絡(luò)合物，其中特別是陽離子脂質(zhì)體。可替代地，ON可以絡(luò)合至脂質(zhì)，特別是陽離子脂質(zhì)。優(yōu)選的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、油酸單甘油酯、甘油二月桂酸酯、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環(huán)庚烷-2-酮、?；鈮A、?；憠A或C1,烷基酯(例如肉豆蘧酸異丙酯IPM)、甘油單酯、甘油二酯或其藥學(xué)上可接受的鹽。通過參照以下的實施例，將會更容易理解本公開。實施例1簡并ON的表征圖1A詳述了同時注入柱中的兩種寡核苷酸制劑通過HPLC (使用疏水柱)的分離。這些中的第一種被稱為內(nèi)標(biāo)，并且是具有具體確定序列的21mer硫代磷酸寡核苷酸，第二種是REP 2006(40mer簡并硫代磷酸寡核苷酸)。僅基于其生理化學(xué)特性(即大小和疏水性)將這兩個種類分離為不同的確定的峰；存在于這些ON每一個中的核苷酸序列對其生理化學(xué)特性無重大影響，并且因此對其分離無影響。因此，僅由于這兩種ON聚合物大小的不同，與REP 2006比較，該內(nèi)標(biāo)作為具有較小保留時間的嚴(yán)格確定的峰從柱中洗脫。請注意REP2006峰的任何一側(cè)的肩是由于在生成較長的寡核苷酸中典型的失效序列。盡管REP 2006的不均勻序列性質(zhì)，它由HPLC解析為充分確定類似作為21mer特定序列的峰，其說明了 REP2006制劑中所有種類的共同的生理化學(xué)性質(zhì)，盡管存在非常大量的不同序列。REP 2006和21-mer峰經(jīng)HPLC分離后，這些可以進(jìn)行質(zhì)譜分析(MS)以鑒定存在于這些確定峰內(nèi)的種類(圖1B 和 1C)。
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在圖1B中，21mer被解析為麗為7402. 6Da的單一種類，與具有確定序列的該PS-ON—致。但是，REP 2006的MS分析(圖1C)揭示存在非常大量的種類其質(zhì)量范圍具有近乎完美的正態(tài)分布，與其完全地簡并性質(zhì)一致。這個質(zhì)量范圍是從(最小的種類)到A40 (最大的種類)并且這些種類的普遍隨著種類數(shù)量的增加(峰強度)非常小，因為它們的質(zhì)量接近質(zhì)量范圍的中心。這是因為越來越大量的不同序列將導(dǎo)致相似的質(zhì)量。在HPLC分離過程中存在于REP 2006的所有不同的ON種類在疏水柱上具有相同保留時間的事實清晰地證明相同大小和相同化學(xué)修飾(即硫代磷酸化)的所有ON將具有高度相似的(若不完全相同)生理化學(xué)性質(zhì)并且因此，可以認(rèn)為不依賴存在于特定ON分子中的核苷酸的序列關(guān)于任何應(yīng)用或?qū)傩灾泄δ芟嗨?。因此，用任何特定簡并ON (例如REP 2003, REP 2004)觀察的任何ON螯合物形成不可能依賴于存在的寡核苷酸的序列并且必須依賴于任何ON的保守生理化學(xué)性質(zhì)。實施例1ION與不同二價金屬陽離子形成螯合物通過如上所述的熒光偏振(FP)檢驗寡核苷酸銨鹽與各種二價金屬陽離子的相互作用。在寡核苷酸合成過程中，使用完善的試劑和合成方案通過剛性3碳連接基團在3’端將每一種寡核苷酸綴合至異硫氰酸熒光素(FITC)。這些寡核苷酸從合成中裂解并且作為銨鹽離開。在該實施例中使用的寡核苷酸在表I中描述。激I實施例1中使用的ON
權(quán)利要求
1.一種寡核苷酸螯合物，其包含由多價陽離子連接的兩種或更多種寡核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸螯合物，其中所述多價陽離子是ニ價金屬陽離子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的寡核苷酸螯合物，其中所述多價陽離子是呈2+電荷狀態(tài)的堿土金屬。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的寡核苷酸螯合物，其中所述ニ價金屬陽離子是呈2+電荷狀態(tài)的過渡金屬。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的寡核苷酸螯合物，其中所述ニ價金屬陽離子是呈2+電荷狀態(tài)的鑭系金屬。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的寡核苷酸螯合物，其中所述ニ價金屬陽離子是呈2+電荷狀態(tài)的后過渡金屬。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的寡核苷酸螯合物，其中所述ニ價金屬陽離子是鈣、鎂、鈷、鐵(2+)、猛、銅或鋅。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的寡核苷酸螯合物，其中所述螯合物包含兩種或更多種不同的ニ價金屬陽離子。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的寡核苷酸螯合物，其中所述螯合物包含至少ー種雙鏈寡核苷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的寡核苷酸螯合物，其中所述螯合物包含至少ー種具有一個硫代磷酸鍵的寡核苷酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的寡核苷酸螯合物，其中所述螯合物包含至少ー種完全硫代磷酸化的寡核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的寡核苷酸螯合物，其中所述螯合物包含至少ー種具有ー個2’修飾核糖的寡核苷酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的寡核苷酸螯合物，其中所述螯合物包含至少一種每個核糖均經(jīng)2’ O-甲基化的寡核苷酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項所述的寡核苷酸螯合物，其適于皮下施用。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項所述的寡核苷酸螯合物，其適于以下施用途徑中的至少眼內(nèi)、ロ服、腸溶、吸入、皮膚注射、肌內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射、鞘內(nèi)輸注、氣管內(nèi)、靜脈內(nèi)注射、靜脈輸注和局部施用。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的寡核苷酸螯合物，其中所述吸入施用是氣霧劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的寡核苷酸螯合物，其中所述寡核苷酸由SEQID NO:3至14組成。
18.一種用于皮下施用的寡核苷酸制劑，所述寡核苷酸制劑包含根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的寡核苷酸螯合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的制劑，其還適于皮下施用。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的制劑，其中所述制劑還適于以下施用途徑中的至少ー種眼內(nèi)、ロ服、腸溶、吸入、皮膚注射、皮下注射、肌內(nèi)注射、顱內(nèi)注射、顱內(nèi)輸注、腹腔內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射、鞘內(nèi)輸注、氣管內(nèi)、靜脈注射、靜脈輸注和局部施用。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的寡核苷酸制劑，其中所述吸入施用是氣霧劑。
22.—種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的寡核苷酸螯合物或權(quán)利要求18至21中任一項所述的寡核苷酸制劑以及載體。
23.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的寡核苷酸螯合物、根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項所述的寡核苷酸制劑或根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物的方法，所述方法包括將任何寡核苷酸鈉鹽溶解在藥學(xué)上可接受的水性賦形劑中，并且逐漸地將ニ價金屬鹽溶液加入到所述溶解的寡核苷酸中，以使所述寡核苷酸螯合物保持溶解性。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中在加入所述金屬鹽之前所述溶解的寡核苷酸濃度是 0. 01-100mg/ml。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中加入到所述溶解的寡核苷酸中的金屬鹽比例是姆IOOmg寡核苷酸為0. l-40mg ニ價鹽。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述寡核苷酸終濃度是0.1-lOOmg/mlo
27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述金屬鹽是以下中的至少ー種鹽酸鹽、葡萄糖酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、天冬氨酸鹽、延胡索酸鹽、抗壞血酸鹽、苯甲酸鹽、異抗壞血酸鹽和丙酸鹽。
28.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述金屬鹽溶液包含以下中的至少ー種鈣、鎂、鈷、鐵(2+)、猛、銅和鋅。
29.—種阻抑或減少對受試者施用寡核苷酸的抗凝作用的方法，所述方法包括對所述受試者施用作為根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的螯合物的所述寡核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項所述的寡核苷酸制劑或根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物的步驟。
30.一種阻抑或減少對受試者施用寡核苷酸的皮下注射部位反應(yīng)的方法，所述方法包括對所述受試者施用作為根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的螯合物的所述寡核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項所述的寡核苷酸制劑或根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物的步驟。
31.ー種對受試者通過IV輸注施用時改善寡核苷酸的耐受性的方法，所述方法包括對所述受試者施用作為根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的螯合物的所述寡核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項所述的寡核苷酸制劑或根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物的步驟。
32.—種對受試者通過IV輸注施用時減少寡核苷酸的血清蛋白質(zhì)相互作用的方法，所述方法包括對所述受試者施用作為根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的螯合物的所述寡核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項所述的寡核苷酸制劑或根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物的步驟。
33.一種減少受試者體內(nèi)寡核苷酸的血清半衰期的方法，所述方法包括對所述受試者施用作為根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的螯合物的所述寡核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項所述的寡核苷酸制劑或根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物的步驟。
34.一種減少與對受試者施用寡核苷酸相關(guān)的肝臟或腎功能障礙的方法，所述方法包括對所述受試者施用作為根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的螯合物的所述寡核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項所述的寡核苷酸制劑或根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物的步驟。
35.一種使寡核苷酸在水溶液中穩(wěn)定的方法,所述方法包括制備作為根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的螯合物的所述寡核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項所述的寡核苷酸制劑或根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物。
36.根據(jù)權(quán)利要求23至35中任一項所述的方法，其中所述螯合物是鈣螯合物。
37.根據(jù)權(quán)利要求23至35中任一項所述的方法，其中所述螯合物是鎂螯合物。
38.根據(jù)權(quán)利要求23至35中任一項所述的方法，其中所述螯合物是混合的鎂/鈣螯合物。
39.多價陽離子在生產(chǎn)寡核苷酸螯合物中的用途。
40.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的寡核苷酸螯合物、根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項所述的寡核苷酸制劑或根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物用于阻抑或減少對受試者施用所述寡核苷酸的抗凝作用的用途。
41.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的寡核苷酸螯合物、根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項所述的寡核苷酸制劑或根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物用于阻抑或減少所述皮下施用寡核苷酸的受試者的皮下注射部位反應(yīng)的用途。
42.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的寡核苷酸螯合物、根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項所述的寡核苷酸制劑或根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物用于改善通過IV輸注施用時受試者中所述寡核苷酸的耐受性的用途。
43.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的寡核苷酸螯合物、根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項所述的寡核苷酸制劑或根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物用于減少對受試者通過IV輸注施用時寡核苷酸的血清蛋白質(zhì)相互作用的用途。
44.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的寡核苷酸螯合物、根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項所述的寡核苷酸制劑或根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物用于減少受試者中所述寡核苷酸的血清半衰期的用途。
45.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的寡核苷酸螯合物、根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項所述的寡核苷酸制劑或根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物用于減少與在受試者中施用所述寡核苷酸相關(guān)的肝或腎功能障礙的用途。
46.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的寡核苷酸螯合物、根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項所述的寡核苷酸制劑或根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物用于使寡核苷酸在水溶液中穩(wěn)定的用途。
47.根據(jù)權(quán)利要求40至46中任一項所述的用途，其中所述寡核苷酸是寡核苷酸鈣鹽。
48.根據(jù)權(quán)利要求40至46中任一項所述的用途，包括寡核苷酸鈣螯合物。
49.根據(jù)權(quán)利要求40至46中任一項所述的用途，包括寡核苷酸鎂螯合物。
50.根據(jù)權(quán)利要求40至46中任一項所述的用途，包括混合的鈣/鎂螯合物。
全文摘要
本公開描述了無論大小或修飾，任何寡核苷酸(ON)與多種二價2+金屬陽離子的廣泛有效的螯合。該螯合作用對二價(或更高價)的陽離子具有特異性，并且導(dǎo)致不表現(xiàn)得像鹽的寡核苷酸螯合物的形成。本文描述了一種使用任何ON和二價金屬陽離子制備的ON螯合物的新型組合物以及在施用寡核苷酸過程中通過使用ON螯合物阻抑抗凝和或皮下注射部位反應(yīng)和或改善寡核苷酸耐受性的方法。
文檔編號A61K31/712GK103052405SQ201180035946
公開日2013年4月17日 申請日期2011年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月20日
發(fā)明者安德魯·瓦利恩特, 米歇爾·巴齊內(nèi) 申請人:里普利科股份有限公司