專利名稱：一種治療脊髓損傷的方法和治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療脊髓損傷(SCI)的新方法和治療劑。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及通過(guò)向SCI忠者的脊髓的損傷部位局部注射CNS神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞而治療脊髓損傷的方法和活性成分是CNS神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的治療劑。
背景技術(shù)：
脊髓損傷引起嚴(yán)重的癥狀截癱(雙下肢麻痹)或四肢癱瘓或甚至呼吸肌麻痹兼四肢癱瘓，因此輪椅和臥床不起的生活是不可避免的。至今仍未發(fā)現(xiàn)治療SCI的有效療法。由于瞬間的交通或運(yùn)動(dòng)事故而被剝奪手和腳自由的患者極渴望活動(dòng)他或她自己的手和腳并通過(guò)恢復(fù)損傷的神經(jīng)通路而再次行走。
自19世紀(jì)末期以來(lái)，人們已相信哺乳動(dòng)物CNS通路根本不能再生或者很少再生，即使有，也無(wú)明顯的功能[例如Ra’mon y Cajal，Degeneration and Regeneration in the Nervous System，1959，Hafner，New York(1928)]。但是，過(guò)去二十年的研究披露哺乳動(dòng)物CNS通路的功能上的明顯再生是可能的，因而否定了全世界認(rèn)為的不能再生的觀念。
一種關(guān)于CNS環(huán)境的假說(shuō)于最近出現(xiàn)并逐漸成為一個(gè)教條。它主張哺乳動(dòng)物CNS的環(huán)境不允許軸突生長(zhǎng)，因而必需使環(huán)境允許誘導(dǎo)軸突的再生。Schwab和他的合作者發(fā)現(xiàn)了CNS白質(zhì)中與髓磷脂相關(guān)的生長(zhǎng)抑制因子，并推測(cè)所述因子導(dǎo)致哺乳動(dòng)物CNS不允許再生。事實(shí)上，他們報(bào)道由抗體導(dǎo)致的因子的中和誘導(dǎo)橫切之后錐體束的再生，且該束的外延越過(guò)整個(gè)成年大鼠的損傷部位[Nature，343(18)，269(1990)]。除了他們的報(bào)道之外，還進(jìn)行了多種嘗試使CNS環(huán)境允許誘導(dǎo)成年大鼠脊髓的再生移植外周神經(jīng)節(jié)、雪旺氏細(xì)胞、嗅覺(jué)鞘樣細(xì)胞(OEC，對(duì)嗅神經(jīng)和嗅球具有特異性的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)。Cheng和他的合作者報(bào)道在除去成年大鼠脊髓節(jié)段之后通過(guò)在空的脊髓間隙中橋接神經(jīng)節(jié)發(fā)生功能恢復(fù)(Science，273(26)，510(1996)]。Guest和他的合作者報(bào)道通過(guò)移植雪旺氏細(xì)胞，即PNS的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞而發(fā)生脊髓的再生[Exp.Neurol.，148，502(1997)]。Li和他的合作者報(bào)道在部分橫切頸上脊髓之后通過(guò)將培養(yǎng)的OEC移植到損傷部位發(fā)生錐體束的再生和功能恢復(fù)[Science，277(26)，2000(1997)]。
但是通過(guò)這些嘗試使環(huán)境允許再生的投射數(shù)量小且長(zhǎng)度短(至多10mm)，且大部分是異常的，達(dá)不到適當(dāng)?shù)哪繕?biāo)。因此功能恢復(fù)程度小，因而后肢不能完全支持體重。為了使SCI患者從輪椅上解放出來(lái)并用他們自己的腳再次行走，重要的是開(kāi)發(fā)一種新能夠重建類似于正常的神經(jīng)投射的治療方法。
本發(fā)明的目的是提供一種新的在數(shù)量(投射神經(jīng)元的數(shù)量)、長(zhǎng)度(軸突的范圍)、通路和末端方面實(shí)現(xiàn)恢復(fù)類似于正常的神經(jīng)投射的方法，并使SCI患者能夠再次行走。本發(fā)明還提供所述方法的治療劑。預(yù)期本發(fā)明能減少患者和他們的家庭護(hù)理者的生理和心理負(fù)擔(dān)，并節(jié)約沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)和社會(huì)福利成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于我們的假設(shè)，即局部損傷癥狀而不是CNS的整體不允許環(huán)境導(dǎo)致軸突再生失敗。所述假設(shè)與目前所持觀點(diǎn)相當(dāng)不同，但與我們的脊髓損傷研究的發(fā)現(xiàn)一致我們發(fā)現(xiàn)被橫切的CNS通路中顯著的再生自發(fā)地發(fā)生在小于一個(gè)月齡的大鼠被急速切割之后。在2-3個(gè)月齡的成年大鼠中，自發(fā)性再生不發(fā)生，推測(cè)因?yàn)槠銫NS組織比年幼動(dòng)物堅(jiān)硬，因而橫切導(dǎo)致?lián)p傷部位的水腫。但是，當(dāng)將胚胎大鼠脊髓組織移植到損傷部位時(shí)，類似于正常投射的軸索再生被誘導(dǎo)。因此，我們推測(cè)CNS環(huán)境不是整體不允許再生，而再生失敗是由于局部條件惡化，即使生長(zhǎng)軸突能夠發(fā)現(xiàn)正確通路和目標(biāo)的軸突指導(dǎo)線索紊亂導(dǎo)致的。似乎很有可能有多種因素使CNS環(huán)境允許破壞軸突指導(dǎo)線索的一致性，從而限制軸突再生的數(shù)量和范圍，導(dǎo)致異常投射。根據(jù)我們的推測(cè)，我們嘗試通過(guò)移植從新生大鼠脊髓收集的培養(yǎng)的混合的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)改善損傷部位的局部條件，期望恢復(fù)損傷部位的微環(huán)境。在完全橫切成年大鼠胸節(jié)段水平的脊髓之后將神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞移植到損傷部位。移植的動(dòng)物從完全截癱恢復(fù)到幾乎正常行走。再生的投射在數(shù)量、范圍、通路和末端方面類似于正常。本發(fā)明通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物CNS再生的新認(rèn)識(shí)來(lái)實(shí)現(xiàn)。與CNS神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞妨礙軸突再生的常規(guī)觀念完全相反，我們使用這種細(xì)胞成功地實(shí)現(xiàn)脊髓的神經(jīng)修復(fù)。神經(jīng)連接恢復(fù)和功能復(fù)原的程度大大高于根據(jù)常規(guī)觀念進(jìn)行嘗試的程度。
本發(fā)明提供一種通過(guò)將CNS神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞移植到損傷的人或其它哺乳動(dòng)物的脊髓而治療脊髓損傷的方法。用于移植的細(xì)胞包括除了II型星形膠質(zhì)細(xì)胞之外的培養(yǎng)的CNS神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的至少一種。本發(fā)明還提供適用于所述治療脊髓損傷的方法的治療劑。
所述治療劑包含至少一種除了I型星形膠質(zhì)細(xì)胞之外的培養(yǎng)的CNS神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞作為活性成分，并可以包含任何醫(yī)療允許的賦形劑。本發(fā)明的進(jìn)一步特征和優(yōu)點(diǎn)將在以下“本發(fā)明的最佳實(shí)施方式”中變得清晰。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式CNS神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞由I型和II型星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和它們的祖細(xì)胞組成。本發(fā)明的治療劑包含至少一種除了I型星形膠質(zhì)細(xì)胞之外的培養(yǎng)的CNS神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞作為活性成分；它們可以是多于2種CNS神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的混合的細(xì)胞。所述的CNS神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞優(yōu)選包括所述三種細(xì)胞即I型星形膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞、II型星形膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞和O4祖細(xì)胞中的至少一種。最適宜的治療劑主要包含II型星形膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞，但可以包含I型星形膠質(zhì)細(xì)胞、II型星形膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。此外，它們可以包含雪旺氏細(xì)胞和嗅覺(jué)鞘樣神經(jīng)膠質(zhì)。
用于本發(fā)明的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的來(lái)源無(wú)限制；可以使用自體的或同種異體的或異種的CNS神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。其中優(yōu)選自體的細(xì)胞和同種異體的細(xì)胞。對(duì)于臨床應(yīng)用，可以從患者自身?yè)p傷的脊髓中收集自體的細(xì)胞?？梢詮牧鳟a(chǎn)的胚胎或腦/心臟死亡的尸體中收集同種異體的細(xì)胞?？梢詮呢i、猴或某些其它哺乳動(dòng)物的CNS中收集異種細(xì)胞。由于CNS是免疫學(xué)豁免部位，異種細(xì)胞可以在施用少量免疫抑制藥物時(shí)存活。
CNS神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的來(lái)源優(yōu)選胚胎、新生兒或幼小的哺乳動(dòng)物，但可以是年老的動(dòng)物。優(yōu)選但不是必須地從它們的脊髓中進(jìn)行收集。任何其它CNS部分，例如大腦皮層、腦干或全腦可以是供應(yīng)來(lái)源。來(lái)源于胚胎干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也可以是供應(yīng)來(lái)源。神經(jīng)干細(xì)胞分成成人型、胚胎型和神經(jīng)上皮型。它們不僅可以從胚胎或新生兒中收集，也可以從成人中收集。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)常規(guī)的生物技術(shù)，使用刺激劑EGF、bFGF、CNTF、視黃酸或T3由這些來(lái)源制備[(Genes Dev.，10，3129-3140(1996)，Neuron，18，81-93(1997)，J.Neurosci.，18，3620-3629(1998))。
任何細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以用于制備神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。例如，用蛋白酶(如胰蛋白酶)處理在無(wú)菌中切除的脊髓或大腦皮層以制備單細(xì)胞或小細(xì)胞群。然后將它們接種于陪替氏培養(yǎng)皿并在含有血清的培養(yǎng)基中于CO2恒溫箱中培養(yǎng)一定的時(shí)間。在培養(yǎng)期間，神經(jīng)元早早死亡而混合的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞存活。關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)，可以使用含有10-20％胎牛血清、F-10培養(yǎng)基或RPMI1640或某些其它培養(yǎng)基的Dulbecco’s MEM(DMEM)。培養(yǎng)基每3-4天更換，并保持在大約30-40℃下。
過(guò)了幾天，星形膠質(zhì)細(xì)胞由于其旺盛的增殖潛能而變成占絕大多數(shù)的細(xì)胞，如果需要的話可以通過(guò)使用不含血清的培養(yǎng)基而增加少突膠質(zhì)細(xì)胞。Percoll密度梯度法或粘合劑差異法有效地分離少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。
可以通過(guò)制備在培養(yǎng)基或適宜的緩沖溶液如PBS中的培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的懸浮液而制備適于應(yīng)用的本發(fā)明的治療劑。細(xì)胞懸浮液的培養(yǎng)基可以包含醫(yī)學(xué)上允許的添加劑，除非它們抑制細(xì)胞活性。應(yīng)用的細(xì)胞密度的范圍為103-106細(xì)胞/μL，優(yōu)選104-105細(xì)胞/μL。
所述治療脊髓損傷的方法是將有效量的懸浮液注射到損傷部位。所述方法適用于人和其它哺乳動(dòng)物，用于部分或全部橫切。對(duì)損傷的位置沒(méi)有限制髓質(zhì)、頸、胸、腰或骶骨節(jié)段中的任何部分。所述的方法適用于呼吸麻痹、四肢癱瘓、截癱，而不管其嚴(yán)重程度。
所述的方法最好用于由跌落事故或運(yùn)動(dòng)事故導(dǎo)致的脊髓損傷，但不一定應(yīng)用于這些外傷性事故。例如它也可以用于腦血管導(dǎo)致的錐體束損傷。所述治療可以優(yōu)選進(jìn)行急性治療，即在24小時(shí)之內(nèi)，優(yōu)選8小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行治療。但是，所述的治療也可以在慢性階段進(jìn)行，例如損傷后一周、5年或者甚至大于10年進(jìn)行。后者的依據(jù)是發(fā)現(xiàn)相當(dāng)數(shù)量的投射神經(jīng)元在切斷軸突之后存活數(shù)個(gè)月(大鼠為數(shù)個(gè)月，對(duì)應(yīng)于人則多于10年)。因此似乎軸突的再生是可能的，條件是損傷部位的局部條件得到改善。
可以使用任何方法將培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的懸浮液施用于損傷部位，只要它是注射安全和可靠的。例如，通過(guò)椎板切除術(shù)暴露脊髓，然后可以在外科顯微鏡下使用微量調(diào)節(jié)注射器髓內(nèi)注射懸浮液。當(dāng)獲得高清度MRI圖像時(shí)，可以不用椎板切除術(shù)注射細(xì)胞懸浮液，如利用腰穿刺技術(shù)進(jìn)行注射。
待注射的CNS神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量取決于損傷的程度。通常對(duì)于成年患者它的總量范圍為103-107細(xì)胞，優(yōu)選105-107細(xì)胞。
在注射細(xì)胞之前，可以施用免疫抑制藥物如環(huán)孢菌素、他克莫司(FK505)、環(huán)磷酰胺(cyclophosamid)、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤或咪唑立賓。它在移植異種細(xì)胞時(shí)是必需的。
實(shí)施例在以下的工作實(shí)施例中更為完整地解釋本發(fā)明，所述實(shí)施例不限制本發(fā)明的范圍。
工作實(shí)施例1制備從新生大鼠的脊髓中收集的培養(yǎng)的混合的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞并分析它們的組成無(wú)菌下從1-2日齡的EGFP-轉(zhuǎn)基因SD大鼠中切除脊髓[EGFP增強(qiáng)的綠色熒光蛋白，SD＝Sprague-Dawley系；指FEBS Letter，407，313-319，1997]。通過(guò)胰蛋白酶和DNase處理將它解離成單細(xì)胞和小細(xì)胞群。以在補(bǔ)充10％的胎牛血清、青霉素100單位/mL、兩性霉素B2.5μg/mL、鏈霉素100μg/mL的DMEM培養(yǎng)基中的5×105細(xì)胞/75cm2的密度將它們接種于陪替氏培養(yǎng)皿，并在常規(guī)條件下培養(yǎng)。細(xì)胞密度對(duì)應(yīng)于取自3-4個(gè)脊髓/皿的物質(zhì)。在第2、6和10天，加入相同組成的DMEM培養(yǎng)基。2周后細(xì)胞達(dá)到融合。用胰蛋白酶-EDTA(由GIBCO/BRL、0.25％胰蛋白酶、1mM EDTA制備)將它們離解，將其再接種(1皿→1皿)并培養(yǎng)。每3-4天進(jìn)行一次培養(yǎng)基更換。在開(kāi)始培養(yǎng)后的第3-4周，用胰蛋白酶-EDTA離解細(xì)胞，并用DMEM培養(yǎng)基(1皿提供50μL)將其制成4-5×104細(xì)胞/μL的懸浮液。在工作實(shí)施例2中施用所述細(xì)胞懸浮液。
培養(yǎng)的混合的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的組成由抗原特異性標(biāo)記分子分析并列在表1中。應(yīng)用Neuroglia，Helmut Kettenmann等人，OxfordUniversity Press(1995)所述的分類。
從大鼠脊髓中收集的培養(yǎng)的混合的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的組成細(xì)胞類型 抗原的表達(dá)充足率Vim1Ran2 A2B5 O4 GFAP (％)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的直系祖細(xì)胞 + + + -- 5I型星形膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞+ + - -- 25I型星形膠質(zhì)細(xì)胞- + - -+ 502A祖細(xì)胞 + - + -- 0II型星形膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞 + - + -+ 45II型星形膠質(zhì)細(xì)胞 - - + -+ 0O4祖細(xì)胞 - - + +- 15橈骨神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞 + - - -- 3(RC2+)小膠質(zhì)細(xì)胞(ED1+) - - - -- 21Vim-波形蛋白工作實(shí)施例2將神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞注射到損傷脊髓的損傷部位在胸下節(jié)段快速地完全橫切成年SD大鼠(♀，2個(gè)月大)的脊髓。用哈密頓微量調(diào)節(jié)注射器，以4-5×104細(xì)胞(1μL)每個(gè)部位的數(shù)量將在工作實(shí)施例1中制備的細(xì)胞懸浮液注射到橫斷面嘴側(cè)和尾側(cè)的兩個(gè)部位。用Basso，Beattie和Bresnahan[J.Neurotrauma 121-21(1995)]開(kāi)發(fā)的BBB度量評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)。簡(jiǎn)言之，得分0和21分別表示癱瘓大鼠的運(yùn)動(dòng)和正常運(yùn)動(dòng)。得分1至8集中在不能站立或支持重量的大鼠的肢體運(yùn)動(dòng)。得分9至13描述能夠站立然后以不同程度的后前肢協(xié)調(diào)行走的大鼠。得分14至20描述作為腳放置、趾間隙、尾位置和軀干穩(wěn)定性漸漸得到改善的良好的行走大鼠。
在開(kāi)始時(shí)，用神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞注射處理的脊髓損傷的大鼠完全截癱和無(wú)尿，具有濕潤(rùn)和骯臟的肛門與生殖器區(qū)域。在外科手術(shù)后3-4天，它們開(kāi)始移動(dòng)后肢。一周后，后肢變得能夠支持體重。2周后觀察到有后-前肢協(xié)調(diào)的行走。3周后它們能夠以類似于正常動(dòng)物的方式行走。BBB得分從0升高到大于15。通過(guò)示蹤法檢查的再生的軸突在數(shù)量、范圍和通路方面類似于正常的投射。它們終于正常目標(biāo)并形成突觸。
工作實(shí)施例3制備從成年大鼠的損傷的脊髓中收集的培養(yǎng)的混合的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的懸浮液在胸下節(jié)段橫切60天大的EGFP-轉(zhuǎn)基因成年SD大鼠的脊髓[參考FEBS Letter，407，313-319，1997]。將動(dòng)物飼養(yǎng)一個(gè)月。在外科手術(shù)后一個(gè)月，在無(wú)菌下切除2-3個(gè)包括損傷部位的節(jié)段，并用蛋白酶處理以以類似于工作實(shí)施例1所述的方式制備單細(xì)胞或小細(xì)胞群。將這些細(xì)胞或細(xì)胞群以5×106細(xì)胞(取自一只或二只大鼠的物質(zhì))/皿的密度接種于陪替氏培養(yǎng)皿(75cm2)，并在常規(guī)條件下在補(bǔ)充10％胎牛血清、青霉素100單位/mL、兩性霉素B2.5μg/mL、鏈霉素100μg/mL的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在第2、6和10天加入相同組成的DMEM培養(yǎng)基。然后每3-4天進(jìn)行培養(yǎng)基更換。來(lái)源于成年的物質(zhì)的細(xì)胞增殖大大慢于來(lái)源于新生兒的物質(zhì)，且細(xì)胞在3-4周后達(dá)到融合。如所述地用胰蛋白酶-EDTA將它們離解，將其再接種(1皿→1皿)，并再培養(yǎng)2周。在培養(yǎng)開(kāi)始后5-6周，收集細(xì)胞，并以類似于工作實(shí)施例1所述的方式制備密度為4-5×104細(xì)胞/μL的懸浮液。來(lái)源于成年大鼠損傷脊髓的培養(yǎng)的混合的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的懸浮液用于注射到工作實(shí)施例4的損傷部位。
工作實(shí)施例4將來(lái)源于成年大鼠的損傷的脊髓的培養(yǎng)的混合的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞注射到脊髓損傷部位。
在胸下節(jié)段快速地完全橫切成年SD大鼠(♀，2個(gè)月大)的脊髓。以類似于實(shí)施例2所述的方法將實(shí)施例3制備的細(xì)胞懸浮液注射到損傷部位。然后動(dòng)物從完全截癱恢復(fù)到如實(shí)施例2中的行走。
對(duì)比實(shí)施施1將培養(yǎng)的I型星形膠質(zhì)細(xì)胞注射到損傷部位以類似于先前的Wang JJ等人(Effects of astrocytesimplantation into the hemisected adult rat spinal cord.Neuroscience 65，973-981，1995)的研究的方式制備來(lái)源于新生大鼠大腦皮層的I型星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液。在胸下節(jié)段快速地完全橫切成年SD大鼠(♀，2個(gè)月大)的脊髓，并用哈密頓微量調(diào)節(jié)注射器，以4-5×104細(xì)胞(1μL)每個(gè)部位的數(shù)量將細(xì)胞懸浮液注射到橫斷面嘴側(cè)和尾側(cè)的兩個(gè)部位。所述的方法類似于工作實(shí)施例2所述的方法。在開(kāi)始時(shí)，大鼠如實(shí)施例2那樣完全截癱和無(wú)尿，具有濕潤(rùn)和骯臟的肛門與生殖器區(qū)域，而功能恢復(fù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)差于工作實(shí)施例2。一周后發(fā)生微小的后肢運(yùn)動(dòng)，但體重支持從未發(fā)生。BBB度量的評(píng)價(jià)總是小于8分。
比較實(shí)施例2將活化的培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞注射到損傷部位我們制備巨噬細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液，并通過(guò)以類似于先前SchwartzM等人(Implantation of stimulated homologous macrophagesresults in partial recovery of paraplegic rats，1998)的研究的方式共培養(yǎng)坐骨神經(jīng)節(jié)段而進(jìn)行培養(yǎng)和活化。在胸下節(jié)段快速地完全橫切成年SD大鼠(♀，2個(gè)月大)的脊髓，并用哈密頓微量調(diào)節(jié)注射器，以4-5×104細(xì)胞(1μL)每個(gè)部位的數(shù)量將細(xì)胞懸浮液注射到橫斷面嘴側(cè)和尾側(cè)的兩個(gè)部位。所述的方法類似于工作實(shí)施例2所述的方法。在開(kāi)始時(shí)，大鼠如工作實(shí)施例2那樣完全截癱和無(wú)尿，具有濕潤(rùn)和骯臟的肛門與生殖器區(qū)域，而功能恢復(fù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)差于工作實(shí)施例2。一周后發(fā)生微小的后肢運(yùn)動(dòng)，但體重支持從未發(fā)生。BBB度量的評(píng)價(jià)總是小于8分。結(jié)果非常類似于對(duì)比實(shí)施例2的結(jié)果。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供一種通過(guò)將培養(yǎng)的混合的CNS神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞注射到損傷部位而治療脊髓損傷的方法。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)修復(fù)在數(shù)量(投射神經(jīng)元的數(shù)量)、長(zhǎng)度(軸突的范圍)、通路和末端方面幾乎難以與正常大鼠區(qū)分的神經(jīng)連接。從完全截癱快速恢復(fù)至不僅支持體重而且進(jìn)行后前肢協(xié)調(diào)行走的程度。盡管存在多種治療脊髓損傷的努力，但這種突破是迄今未實(shí)現(xiàn)的，且它提供了目前不存在的有效治療策略。當(dāng)開(kāi)發(fā)出有效治療時(shí)，它將減少患者和他們的家庭護(hù)理者的醫(yī)療和心理負(fù)擔(dān)，并節(jié)約沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)和社會(huì)福利成本。
權(quán)利要求
1.一種用于治療脊髓損傷的治療劑，所述治療劑包含作為活性成分的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，所述神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞包括選自除了I型星形膠質(zhì)細(xì)胞之外的培養(yǎng)的CNS神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的至少一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的治療劑，其中所述的CNS神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞包括選自I型和II型星形膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的治療劑，其中所述的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞主要包含II型星形膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的治療劑，其中所述的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是來(lái)源于脊髓的混合的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之任一項(xiàng)的治療劑，其中所述的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是自體的或同種異體的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4之任一項(xiàng)的治療劑，其中所包含的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量為103-106細(xì)胞/μL。
7.一種通過(guò)向人或其它哺乳動(dòng)物的損傷的脊髓局部注射有效劑量的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞而治療脊髓損傷的方法，所述神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞包括選自除I型星形膠質(zhì)細(xì)胞之外的培養(yǎng)的CNS神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是來(lái)源于脊髓的混合的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的治療劑，其中所述的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是自體的或同種異體的。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9之任一項(xiàng)的方法，其中所述損傷的脊髓是成人身體的部分，而所述培養(yǎng)的CNS神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的注射總數(shù)為103-107。
全文摘要
一種用于治療脊髓損傷的治療劑，所述治療劑包含作為活性成分的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，所述神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞包括作為CNS膠質(zhì)細(xì)胞的I型星形膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞和II型星形膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞和04祖細(xì)胞；和一種特征在于通過(guò)將有效劑量的上述治療劑局部給藥而治療脊髓損傷的方法。
文檔編號(hào)A61K35/12GK1545416SQ0281643
公開(kāi)日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2002年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月23日
發(fā)明者川口三郎, 西尾健資, 資 申請(qǐng)人:川口三郎, 西尾健資