專利名稱：脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脆弱擬桿菌的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是危害人類健康最嚴(yán)重的一類疾病，在歐美一些國家，癌癥的死亡率僅次于心血管系統(tǒng)疾病而居第二位。我國隨著人口老齡化，腫瘤的發(fā)病率和死亡率都有所增力口，城市居民惡性腫瘤的死亡率已居死因第一位。20世紀(jì)初，人們發(fā)現(xiàn)保加利亞的長壽老人比例在同地區(qū)中最高,腫瘤的發(fā)病率也相對較低。原來,保加利亞人有每天飲用酸奶的習(xí)慣。研究發(fā)現(xiàn)，保加利亞酸奶中含有的益生菌能促進(jìn)胃中失誤殘?jiān)姆纸夂臀眨€能分解乳蛋白，抑制腸胃中致病菌的生長。近年來，越來越多的研究表明益生菌對于腫瘤有一定的拮抗作用，并逐漸揭示其作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)益生菌拮抗腫瘤的機(jī)制主要有:優(yōu)化腸道菌群的組合，抑制產(chǎn)生致癌因子的腐敗菌生長；產(chǎn)生抗誘變物質(zhì)和抗癌物質(zhì)；增強(qiáng)宿主的免疫系統(tǒng)，預(yù)防慢性復(fù)發(fā)性炎癥；結(jié)合蛋白性致突變物質(zhì)和致癌物質(zhì)；影響腫瘤細(xì)胞基因和酶的表達(dá)。結(jié)腸癌是常見的惡性消化道腫瘤之一，據(jù)2012年的統(tǒng)計(jì)資料顯示，全世界每年結(jié)腸癌的新增病例數(shù)高達(dá)120萬，每年約有60.87萬患者死于結(jié)腸癌。而在我國，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率也呈不斷上升趨勢。所以，如何做好結(jié)腸癌的預(yù)防工作以及降低其發(fā)病率和死亡率已經(jīng)成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界研究方向之一。脆弱擬桿菌iBacteroides fragilis)作為一種革蘭氏染色陰性、桿狀、兩端鈍圓而濃染，有莢膜、無芽胞、無動力的專性厭氧細(xì)菌，分產(chǎn)腸毒素型和非產(chǎn)腸毒素型。脆弱擬桿菌作為人及動物腸道正常菌群的一部分，主要存于結(jié)腸中，此外，呼吸道、胃腸道及泌尿生殖道粘膜也可定植生長。目前研究較多的是脆弱擬桿菌作為一種條件致病菌，當(dāng)宿主粘膜受損時，可侵犯粘膜下層，引起感染，也可經(jīng)血液流動，引起身體其它器官如腸道、腹腔、肝、肺、腦組織化膿性感染并伴發(fā)膿腫和引起急慢性腹瀉等。此外，其對結(jié)腸、直腸癌的發(fā)生也有促進(jìn)作用。然而，脆弱擬桿菌并非只是一種條件致病菌。1991年張季階發(fā)表了《一種無毒脆弱擬桿菌的分離鑒定》，報導(dǎo)了關(guān)于1983年9月從一個發(fā)育良好的嬰兒糞便中分離出量大而又較純的細(xì)菌，經(jīng)以系列的鑒定、基礎(chǔ)試驗(yàn)和臨床應(yīng)用觀察，屬于脆弱擬桿菌群中的一株無毒菌，是人體的益生菌，定名為BF839菌株。由此，研究發(fā)現(xiàn)了，脆弱擬桿菌也是一種益生菌。但是，脆弱擬桿菌作為一種益生菌，并且在制備防治結(jié)腸癌組合物的相關(guān)應(yīng)用，目前尚未有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用，所述的脆弱擬桿菌保藏單位名稱為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2013年3月12日，保藏編號為CGMCCN0.728Q,分類命名為 Bacteroides fragilis0為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
提供脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用。其中，所述組合物為至少含有防治結(jié)腸癌的脆弱擬桿菌的食品或藥物組合物。其中，所述組合物選自奶粉、干酪、凝乳、酸奶酪、冰激凌、奶基發(fā)酵食品、發(fā)酵谷類食品、嬰兒食品或?qū)櫸锸称分械娜我庖环N。其中，所述組合物為丸劑、片劑、顆粒制劑、膠囊、口服液或者管飼制劑。其中，所述組合物 為含有所述脆弱擬桿菌的液體細(xì)菌懸浮液。其中，所述脆弱擬桿菌在所述組合物中的含量為KTlOiciCfu /mL。本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明發(fā)掘了脆弱擬桿菌新的用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明，脆弱擬桿菌在體內(nèi)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了抗腫瘤效應(yīng)，抑制腫瘤生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，延長生存期，對于防治結(jié)腸癌具有很好的效果；而且脆弱擬桿菌安全無毒，藥理作用強(qiáng)，從而預(yù)示了脆弱擬桿菌具有很好的食用和藥用前景。脆弱擬桿菌作為一種益生菌，可用于制備防治結(jié)腸癌的食品或藥物組合物，為臨床提供一種適合人體服食的保健及預(yù)防良品。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，這些實(shí)施例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1脆弱擬桿菌菌液的制備 (O由嬰兒糞便中分離脆弱擬桿菌
按“正常菌群檢查法”稱取0.5克大便，置于先裝有4.5ml生理鹽水的試管中，以此連續(xù)稀釋成10_卜10_6，由高稀積度向低稀積度滴到Bd培養(yǎng)基平板上，置于厭氧產(chǎn)氣盒中加厭氧產(chǎn)氣袋進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。置37°C，2 7天后開罐檢查。選取單一菌落進(jìn)行純培養(yǎng)、染色鏡檢、培養(yǎng)特性、生理生化檢測。(2)脆弱擬桿菌的增菌培養(yǎng)及菌液制備
選取純化后的單個菌落接種于改良的胰蛋白胨肉湯中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，所得菌液離心沉淀，轉(zhuǎn)速3000r/min,離心15min,去上清,沉淀物用生理鹽水洗漆后,沉淀物用生理鹽水稀釋，用麥?zhǔn)媳葷峁茏鼍鷶?shù)測定，稀釋至IO8 cfu /ml, IO9 cfu /ml, IO10 cfu /ml，保存?zhèn)溆谩?shí)施例2脆弱擬桿菌毒力實(shí)驗(yàn)
采用實(shí)施例1制備的脆弱擬桿菌菌液進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):
(O小鼠急性毒力實(shí)驗(yàn)
取體重22±2克C57BR/C小鼠(雌雄各半)60只，分成高劑量組、低劑量組和對照組，各組20只。高劑量組每只小鼠每天灌胃IO12 cfu /ml菌液0.5ml，低劑量組每天灌胃IO9 cfu/ml菌液0.5ml，對照組每天灌胃0.5ml生理鹽水。連續(xù)觀察14天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:小鼠正常生長，未見死亡，LD50測不出。(2)大鼠毒力實(shí)驗(yàn)
取150±20克SD大鼠30只(雌雄各半)，分為3組:高低劑量組和對照組。高劑量組每只大鼠每天灌胃1012cfu/ml菌液2ml,低劑量組每天灌胃109cfu/ml菌液2ml,對照組每天灌胃2ml生理鹽水。連續(xù)觀察14天，14天后抽靜脈血測血象、肝腎功。取胃腸肝脾組織做病理切片電鏡觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:均未見明顯異常。(3)恒河猴毒力實(shí)驗(yàn)
取恒河猴10只(雌雄各半)，分為2組:高低劑量組和對照組。高劑量組每只恒河猴每天口服1012cfu/ml菌液100ml,低劑量組每天口服109cfu/ml菌液100ml。連續(xù)觀察60天。14天、30天、45天、60天后分別抽靜脈血測血象、肝腎功，測心電圖。取胃腸肝脾組織做病理切片電鏡觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:均未見明顯異常。 實(shí)施例3脆弱擬桿菌對于結(jié)腸癌的預(yù)防作用 采用實(shí)施例1制備的脆弱擬桿菌菌液進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):
動物模型建立:將60只ICR小鼠隨機(jī)分為2大組，即:生理鹽水組(10只)和模型組(50只)。將1，2- 二甲肼(DMH)溶于生理鹽水中，使其終濃度為20mg/kg，用0.25mol/L NaOH調(diào)整pH至6.5，腹腔注射予小鼠。I周后，在模型組的飲水中添加右旋葡聚糖苷鈉(DSS)，濃度為20g/L，給予小鼠連續(xù)飲用7天。在小鼠出現(xiàn)第二次血便時，及給予DMH后的第9周，按體質(zhì)量隨機(jī)將模型小鼠分為4組，即:模型組(20只)和脆弱擬桿菌組:高劑量組(IO9Cfu/ml)、中劑量組(108cfu/ml)、低劑量組(107cfu/ml)。脆弱擬桿菌菌液灌胃，每天I次,每次
0.5ml,共 11 周。評價指標(biāo):實(shí)驗(yàn)第20周，乙醚麻醉小鼠。剪開小鼠腹腔，在冰浴中從肛門向上截取結(jié)腸8cm，用生理鹽水沖洗后，濾紙吸干，稱體質(zhì)量。記錄結(jié)腸腫瘤數(shù)目，取結(jié)腸約Icm做病
理檢查。結(jié)果:模型組小鼠在第20周，50%的小鼠出現(xiàn)脫肛，而脆弱擬桿菌三個劑量組未見脫肛小鼠。模型組有超過80%的小鼠結(jié)腸出現(xiàn)了一個或者多個腫瘤，結(jié)腸充血增厚。而脆弱擬桿菌低劑量組僅有3只出現(xiàn)結(jié)腸腫瘤，高中劑量組僅有I只出現(xiàn)。病理結(jié)果表明，模型組細(xì)胞排列紊亂、浸潤性生長，邊界模糊，診斷為腺瘤樣增生；脆弱擬桿菌三個劑量組粘膜缺失，炎癥細(xì)胞廣泛浸潤，呈典型炎癥改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脆弱擬桿菌成功地將小鼠結(jié)腸停留在炎癥狀態(tài)，阻止了結(jié)腸炎向結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)變。由此可見，脆弱擬桿菌對結(jié)腸癌有很好的預(yù)防作用。實(shí)施例4脆弱擬桿菌對于結(jié)腸癌的治療作用 采用實(shí)施例1制備的脆弱擬桿菌菌液進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):
BALB/c小鼠30只，每只鼠背部皮下接種CT26細(xì)胞(1*105細(xì)胞/只)，接種次日將小鼠隨機(jī)分為2組，每組15只。第一組為生理鹽水組，每天灌胃0.5ml生理鹽水；第二組為脆弱擬桿菌組，灌胃脆弱擬桿菌菌液，每只灌胃量0.5ml*109cfu/ml，共30天。觀察用藥30天時腫瘤大小，荷瘤鼠生存期，部分小鼠處死進(jìn)行原位細(xì)胞凋亡分析(TU NEL)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:脆弱擬桿菌組結(jié)腸腫塊明顯小于生理鹽水組，平均生存時間明顯長于生理鹽水組。脆弱擬桿菌組小鼠腫瘤細(xì)胞(CT26)凋亡陽性數(shù)明顯高于生理鹽水對照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脆弱擬桿菌在體內(nèi)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了抗腫瘤效應(yīng)，抑制腫瘤生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，延長生存期。說明了脆弱擬桿菌對于結(jié)腸癌有很好的治療作用。
權(quán)利要求
1.脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用，其特征在于:所述組合物為至少含有能防治結(jié)腸癌的脆弱擬桿菌的食品或藥物組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用，其特征在于:所述組合物選自奶粉、干酪、凝乳、酸奶酪、冰激凌、奶基發(fā)酵食品、發(fā)酵谷類食品、嬰兒食品或?qū)櫸锸称分械娜我庖环N。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用，其特征在于:所述組合物為丸劑、片劑、顆粒制劑、膠囊、口服液或者管飼制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用，其特征在于:所述組合物為含有所述脆弱擬桿菌的液體細(xì)菌懸浮液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用，其特征在于:所述脆弱擬 桿菌在所述組合物中的含量為IO8IOiciCfu /mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及脆弱擬桿菌的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及脆弱擬桿菌在制備防治結(jié)腸癌組合物中的應(yīng)用，本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明，脆弱擬桿菌在體內(nèi)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了抗腫瘤效應(yīng)，抑制腫瘤生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，延長生存期，對于防治結(jié)腸癌具有很好的效果。本發(fā)明發(fā)掘了脆弱擬桿菌新的用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域，預(yù)示了脆弱擬桿菌具有很好的食用和藥用前景。脆弱擬桿菌作為一種益生菌，可用于制備防治結(jié)腸癌的食品或藥物組合物，為臨床提供一種適合人體服食的保健及預(yù)防良品。
文檔編號A61K35/74GK103142656SQ20131008570
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者智發(fā)朝, 白楊, 劉洋洋 申請人:廣州知光生物科技有限公司