專利名稱：用于控制沙門氏菌的利生菌的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的參考本專利申請(qǐng)為1992年7月29日提交的申請(qǐng)序號(hào)07/921,173的部分繼續(xù)，前申請(qǐng)內(nèi)容在此引入作為參考。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及使用限定性利生菌(probiotics)控制沙門氏菌(Salmonella)在家養(yǎng)動(dòng)物、包括家禽特別是雞中的移生。
盡管經(jīng)過研究人員和公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)的努力，在過去20年中人類沙門氏菌病的發(fā)病率仍然升高了。每年報(bào)道感染該病的實(shí)際病例數(shù)超過四萬。然而，據(jù)傳染病中心估計(jì)，在美國(guó)每年人類沙門氏菌感染的真實(shí)發(fā)病率可能高達(dá)二至四百萬。包括家禽在內(nèi)的動(dòng)物性食品仍是人類沙門氏菌感染的主要來源?，F(xiàn)有技術(shù)說明考慮到沙門氏菌在環(huán)境中的廣泛存在，不可能完全保護(hù)家禽不與沙門氏菌接觸。因此，研究人員繼續(xù)研究新的方法，用于增加接觸沙門氏菌的家禽對(duì)其移生的抗性。這些研究集中于對(duì)疫苗的評(píng)價(jià)、構(gòu)建保護(hù)性的正常腸內(nèi)菌群和鑒定可抑制沙門氏菌生長(zhǎng)和移生的食品添加物。宿主的免疫力在抗沙門氏菌中的作用尚不清楚，而且同樣不能肯定是否刺激免疫反應(yīng)可有效地增加對(duì)沙門氏菌移生的抗性。實(shí)驗(yàn)性的疫苗并未被證實(shí)總是有效的。
許多文獻(xiàn)報(bào)道，正常腸內(nèi)微生物群系可增加對(duì)沙門氏菌移生的抗性。給雛雞口服接種微生物菌群的厭氧菌培養(yǎng)物被證明可有效地降低沙門氏菌的移生，而以上厭氧微生物來自成雞盲腸內(nèi)容物和糞便，并被稱為利生菌(probiotic，定義為服用后有利于動(dòng)物的細(xì)菌培養(yǎng)物)[Snoeyenboset al.，Avian Dis.，23904-913，(1979)，Schneitz et al.，ActaPathol.Microbiol.Scand.Sect.B.，89；109-116，(1981)，andStavric et al.，J.Food Prot.，48778-782，(1985)]。與此相反，阻止上述盲腸厭氧菌在雛雞體內(nèi)被移生的家禽飼養(yǎng)實(shí)踐，會(huì)使雛雞對(duì)沙門氏菌的移生更加敏感[Pivnick et al.，J.Food Prot.，44909-916，(1981)]。上述利生菌可能通過在雛雞腸道內(nèi)的迅速移生而減少沙門氏菌的移生(Pivnick et al.，ibid)，通過競(jìng)爭(zhēng)腸壁的附著位點(diǎn)(Snoeyenbos et al.，ibid)，或通過產(chǎn)生具有抑菌或殺菌作用的短鏈揮發(fā)性的脂肪酸[Barnes et al.，J.Hyg.Camb.，82263-283，(1979)and Am.J.Clin.Nutr.，332426-2433，(1980)，Corrier et al.，Avian Dis.，34668-676，(1990) and Avian Dis.，34617-625，(1990)，and Hinton et al.，Avian Dis.，34626-633，(1990)]，以抑制腸病原體的生長(zhǎng)。
然而，包含幾百種不同微生物混合種群的正常微生物菌群培養(yǎng)物被證實(shí)可有效地抑制沙門氏菌的生長(zhǎng)。在歐洲的一些國(guó)家，已廣泛使用微生物混合培養(yǎng)物構(gòu)建日齡雛雞體內(nèi)正常腸內(nèi)菌群，用以控制沙門氏菌的繁殖。然而，由于上述培養(yǎng)混合物中存在的微生物數(shù)目和種類還未確定，這一系統(tǒng)在美國(guó)尚未得到廣泛的認(rèn)可。導(dǎo)致這一方法廣泛使用受阻的一個(gè)原因是培養(yǎng)產(chǎn)物的組成不能標(biāo)準(zhǔn)化，因此培養(yǎng)產(chǎn)物不能在貯存和在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)在組成和效力上不變。同樣，由于開始的材料通常是成禽的腸容物，這些物質(zhì)可能含有病原性病毒、細(xì)菌或寄生蟲，它們可能危害雛雞的健康。還有，美國(guó)食物和藥品局最近要求所有非限定性培養(yǎng)物必須通過審批。
最近已有報(bào)道，在雛雞的飼料或飲水中加入乳糖和其它乳糖制品可以增強(qiáng)對(duì)沙門氏菌移生的抗性[Oyofo et al.，Avian Dis.，33531-534，(1989)and Poultry Sci.，681357-1360，(1989)，Corrier et al.，ibid，and Hinton et al.，ibid.]。飲食中的乳糖可增加盲腸內(nèi)容物的酸性和影響腸內(nèi)正常菌群的生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)物。補(bǔ)充乳糖的飲食，通過增加某些正常腸內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)生的如乙酸、丙酸、丁酸等短鏈易揮發(fā)性脂肪酸的抑菌作用，而可能同樣增強(qiáng)對(duì)沙門氏菌移生的抗性[Corrier et al.，ibid，Hinton et al.，ibid]。
當(dāng)給雛雞同時(shí)提供飲食中的乳糖和在含乳糖培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的盲腸厭氧菌培養(yǎng)物時(shí)，雛雞對(duì)沙門氏菌繁殖的抗性進(jìn)一步增加[Corrier et al.and Hinton et al.，ibid]。
發(fā)明概述我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一種對(duì)控制或抑制沙門氏菌在家禽中的移生有效的限定性利生菌或細(xì)菌組合物，該利生菌包括生物學(xué)基本純的細(xì)菌的限定性種群或培養(yǎng)物。它們包括下列菌株糞腸球菌(Enterococcus faecalis)，faecium腸球菌(Enterococcus faecium)，avium腸球菌(Enterococcus avium)，lacfis乳酸球菌(Lactococcus lactis)，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，大腸桿菌(Escherichia coli)，弗氏檸檬酸菌(Citrobacter freundii)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)，丙酸桿菌屬(Propionibacterium)，雙歧桿菌屬(或乳酸桿菌屬)(Bifidobacterium(orLactobacillus)，真細(xì)菌屬(Eubacterium)，韋永球菌屬(Veillonella)，和梭形桿菌屬(Fusobacterium)以及屬于腸桿菌科的其它細(xì)菌和一類未知的稱為OAGPB-5的菌株。
在使用中，給受試家禽服用有效量的利生菌，用于抑制沙門氏菌的移生。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過在利生菌中摻入乳糖可能獲得增強(qiáng)的抑制沙門氏菌作用。上述利生菌也可能與常用的飼料結(jié)合，以提供一種可供家禽攝食的新的飼料產(chǎn)品。
本發(fā)明亦涉及以成年動(dòng)物糞便、盲腸或大腸內(nèi)容物中分離利生菌的一種新方法，以用于有效地控制或抑制沙門氏菌在包括家禽在內(nèi)的家畜中的移生。將糞便、盲腸或大腸容物與營(yíng)養(yǎng)物或培養(yǎng)基混合，并在無氧條件下不稀釋地溫育(即批培養(yǎng))。經(jīng)過這一初步的溫育，所得的培養(yǎng)物須在連續(xù)流動(dòng)條件下直至獲得穩(wěn)態(tài)，之后的穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物可收獲作為利生菌使用。
按照這一發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種用于控制沙門氏菌在家禽中的移生的改進(jìn)的方法和組成物。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的在于提供可能易于標(biāo)準(zhǔn)化的厭氧菌限定性培養(yǎng)物，用于控制沙門氏菌在家禽的移生。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種改進(jìn)的方法，用于分離細(xì)菌組合物作為利生菌使用，以供控制沙門氏菌在家畜特別是家禽中的移生。
本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)在后面的說明中將是顯而易見的。
發(fā)明詳述服用本發(fā)明中的利生菌可有效地控制沙門氏菌在家禽中的移生，包括減少家禽群體中平均沙門氏菌濃度和(或)降低被沙門菌病原體移生的家禽百分率。本發(fā)明可能用于任何一種家禽，包括但不限于諸如雞、火雞、鴨、鵪鶉和鵝的家禽。給家禽服用后，利生菌可為家禽提供持久的保護(hù)用于抗多種沙門氏菌特別是鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌。
利生菌來自無沙門氏菌雞的盲腸。如在實(shí)施例1中詳細(xì)描述的，將雞的盲腸回收，接種到合適的培養(yǎng)基中，在分批培養(yǎng)中在無氧條件下溫育。接著該培養(yǎng)物以特定的培養(yǎng)基交換速率在連續(xù)流動(dòng)的培養(yǎng)條件下溫育直至獲得穩(wěn)態(tài)或平衡。當(dāng)回收并給家禽服用后，此生成的穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物作為利生菌在控制處理后禽類的沙門氏菌移生上顯示了顯著的有效性。
通過分析，從穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物中回收到29種基本上純化的細(xì)菌分離物，包括15種兼性和14種專性厭氧菌。培養(yǎng)物中細(xì)菌的組成確定如下I.兼性厭氧菌，革蘭氏陰性球菌(1)第一糞腸球菌株，(2)第二糞腸球菌株，(3)第一faecium腸球菌株，(4)第二faecium腸球菌株，(5)第三faecium腸球菌株，(6)avium腸球菌株，(7)第三糞腸球菌株，II.兼性厭氧菌，革蘭氏陽(yáng)性球桿菌(8)lactis乳酸球菌，(9)第一乳酸桿菌株，III.兼性厭氧菌，革蘭氏陰性桿菌(10)第一大腸桿菌株，(11)弗氏檸檬酸菌，(12)一種屬于腸桿菌科的細(xì)菌，(13)一種假單胞菌屬的菌種，(14)液化沙雷氏菌，
(15)第二大腸桿菌株，IV.專性厭氧菌，革蘭氏陽(yáng)性桿菌(16)第一丙酸桿菌種，(17)第二丙酸桿菌種，(18)第二乳酸桿菌株，(19)第一雙歧桿菌株或第三乳酸桿菌株，(20)第三丙酸桿菌株，(21)第一真細(xì)菌株，(22)第二真細(xì)菌株，(23)一種未知的稱為OAGPB-5的細(xì)菌株，(24)第三真細(xì)菌株，(25)第二雙歧桿菌株或第四乳酸桿菌株，(26)第三雙歧桿菌株或第五乳酸桿菌株，(27)第四丙酸桿菌株，V.專性厭氧菌，革蘭氏陰性桿菌(28)一種韋永球菌屬菌種，VI.專性厭氧菌，革蘭氏陰性桿菌(29)一種梭形桿菌屬菌種。
包括上述所有29種細(xì)菌的利生菌組合物，已在布達(dá)佩斯條約下存入美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，American Type CltureColleetion)(12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852，USA)，作為排除競(jìng)爭(zhēng)培養(yǎng)物，CF3，指定的保存編號(hào)為ATCC 55515。單獨(dú)菌株的特性將在實(shí)施例1和例2中進(jìn)行特征描述。
所得的穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物可直接作為利生菌使用，或貯存待用。對(duì)于后者，可按需要以混合物貯存，或者可能分離出單獨(dú)菌株、貯存，然后再重新組合。
按照優(yōu)選實(shí)施方案，利生菌由實(shí)施例1和例2中的穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物產(chǎn)出的細(xì)菌組成。而在可選性的實(shí)施方案中，許多細(xì)菌可能從已知的或標(biāo)準(zhǔn)的菌株中獲得，或者從家禽回收的分離物中獲得。例如，但不僅限于，一種或更多的菌株，包括腸球菌、乳酸球菌、大腸桿菌、檸檬酸菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬、丙酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、真細(xì)菌屬、韋永球菌屬、梭形桿菌屬或特別是乳酸桿菌屬，可能替代實(shí)施例中貯存利生菌中相同屬或種的菌株。在使用已知菌株的貯存培養(yǎng)物時(shí)，為加強(qiáng)功效，這些細(xì)菌可通過家禽體內(nèi)(培養(yǎng))以適應(yīng)家禽，更優(yōu)選的是將其與來自穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物的其它細(xì)菌一起使用，然后將其從家禽的糞便或盲腸內(nèi)容物中回收和分離。當(dāng)使用家禽分離物時(shí)，使用本領(lǐng)域中常規(guī)技術(shù)或按DeLoach所述[U.S.專利申請(qǐng)序號(hào)07/822,505]，可能從成年家禽的糞便或盲腸內(nèi)容物中分別分離和回收細(xì)菌，其內(nèi)容在此引入作為參考。
同樣可以預(yù)測(cè)，在利生菌少于上述所有的29種菌株的情況下，本發(fā)明仍可能實(shí)施，從利生菌中去除一、二或三種細(xì)菌可能只引起效力的輕微下降。例如，并不僅限于此，假單胞菌屬或多余的菌株，即那些屬于存在多菌株或菌種的屬的菌株，可以去除而不顯著降低效力。然而，按照優(yōu)選實(shí)施方案，利生菌對(duì)沙門氏菌移生的最佳控制作用是在所有29種菌株均包括的情況下獲得的。
按照Nurmi等人的技術(shù)(美國(guó)專利4,689,226，其內(nèi)容在此引入作為參照)，同樣可能任選本發(fā)明中的一些細(xì)菌株，用做有能力吸附至受試家禽消化道上皮細(xì)胞的細(xì)菌。
本發(fā)明同樣涉及一種新方法，用于獲得利生菌以有效地控制或抑制沙門氏菌在多種家畜中的移生，其中包括但不僅限于家禽以及馬、豬和牛。與其說使用已知的貯存培養(yǎng)物或純化的細(xì)菌分離物產(chǎn)生利生菌，不如說我們無意中發(fā)現(xiàn)一種可能直接從成年靶動(dòng)物的糞便、盲腸和(或)大腸內(nèi)容物中生產(chǎn)穩(wěn)定的限定性利生菌的方法。按照這一方法，首先使用糞便、盲腸或大腸內(nèi)容物作為成批培養(yǎng)的接種物，然后在特定的培養(yǎng)基交換和pH條件連續(xù)流動(dòng)培養(yǎng)，直至達(dá)到穩(wěn)態(tài)或平衡。所得的穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物可回收作為利生菌使用。其中盲腸內(nèi)容物被定義為包括盲腸內(nèi)緣中的物質(zhì)以及整個(gè)盲腸本身，包括其所屬的如粘膜層的各部分。
成批培養(yǎng)階段可在任何常規(guī)的發(fā)酵容器中進(jìn)行。然而，優(yōu)選使用無稀釋作用的恒化器(即不加入新鮮培養(yǎng)基和不取走失效的培養(yǎng)基)，以避免培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入后面的進(jìn)程以及減少對(duì)培養(yǎng)物潛在的污染。動(dòng)物盲腸或大腸內(nèi)容物及其糞便收集后可作為接種物。與合適的培養(yǎng)基混合并在無氧條件下溫育。這一成批培養(yǎng)物應(yīng)連續(xù)溫育(1)約6～18小時(shí)，優(yōu)選12～18小時(shí)左右，或(2)直到光密度(在600nm測(cè)量)至少達(dá)到約1.0左右，和(或)(3)pH達(dá)到4.2左右后約2小時(shí)以內(nèi)；達(dá)到上述時(shí)間時(shí)，成批培養(yǎng)應(yīng)終止，并開始連續(xù)培養(yǎng)。如果使用上述條件(1)或者特別是條件(2)確定溫育期，優(yōu)選使用本領(lǐng)域常規(guī)的pH調(diào)節(jié)劑控制培養(yǎng)物的pH值在5.5左右。另外，如果不采取這一pH控制，以避免某些細(xì)菌的死亡，優(yōu)選成批培養(yǎng)物保持pH值不低于4.2左右。
在結(jié)束上述成批培養(yǎng)階段后，接著馬上開始在恒化器中的持續(xù)培養(yǎng)，并持續(xù)補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基和取走失效的肉湯培養(yǎng)基。合適的恒化器可能易于確定，例如包括Wang所述的反應(yīng)器[Fermentation and EnzymeTechnology，John Wiley & Sons，New York，1979，pages 98-137，該內(nèi)容在此引入作為參考]。令人驚奇的是，在特定的稀釋或培養(yǎng)基的周轉(zhuǎn)率和特定的pH值下，連續(xù)培養(yǎng)中的混合物生長(zhǎng)，可以使培養(yǎng)物達(dá)到一個(gè)平衡或穩(wěn)態(tài)。根據(jù)接種源所使用的動(dòng)物、特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，開始存在的細(xì)菌數(shù)目可能減少至一個(gè)含有相對(duì)少數(shù)生物學(xué)基本純化的細(xì)菌的穩(wěn)定培養(yǎng)物，并可能易于確定。例如，當(dāng)使用家禽時(shí)，開始約有500種細(xì)菌存在于接種物中，在穩(wěn)定培養(yǎng)物中可能減少至約10到40種細(xì)菌。這一階段合適的條件包括周轉(zhuǎn)率在0.029到0.10小時(shí)-1左右，優(yōu)選0.0416小時(shí)-1左右，pH值在4.7至6.5左右，優(yōu)選5.5左右。
溫度和所用培養(yǎng)基對(duì)于大批和連續(xù)培養(yǎng)并非關(guān)鍵因素，并可能易于確定。合適的溫度可能在約26℃至47℃之間變化。含有不同能量來源的多種合適的培養(yǎng)基同樣可以使用。雖然對(duì)此沒有限制，但優(yōu)選的能量來源包括葡萄糖、半乳糖，以及特別是乳糖。
當(dāng)培養(yǎng)物pH、OD600和易揮發(fā)性脂肪酸濃度保持近似不變時(shí)，培養(yǎng)物可認(rèn)為已呈現(xiàn)穩(wěn)態(tài)。一但達(dá)到穩(wěn)態(tài)，培養(yǎng)物可在任何時(shí)候回收，并按所述使用。理想的是，同樣也應(yīng)該對(duì)穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物加以鑒定或限定，通過使用本領(lǐng)域常規(guī)的方法，對(duì)其中的細(xì)菌種群進(jìn)行分離和檢驗(yàn)。一經(jīng)分離，細(xì)菌使用常規(guī)的技術(shù)可能無限期地貯存，并按所述的方法用于以后的使用，例如，可按本發(fā)明以前相關(guān)的、序號(hào)為07/921,173的專利申請(qǐng)(1992年7月29日提交)中所述的方法進(jìn)行。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，使用分離的或生物學(xué)純化的細(xì)菌作為初始接種物同樣可能使用上述的成批/連續(xù)培養(yǎng)的方法。
按本方法產(chǎn)出的穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物可以任意地加以篩選以選擇顯示最高效價(jià)的組合物，用于抑制沙門氏菌在適用動(dòng)物上的移生。在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，上述篩選可在體內(nèi)用沙門氏菌攻擊而進(jìn)行，其內(nèi)容在實(shí)施例3和例4中加以敘述。簡(jiǎn)單地講，可按在此所述的方法給未感染沙門氏菌的動(dòng)物喂服穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物。當(dāng)經(jīng)過一段時(shí)間，通常是喂服后2或3天，足夠培養(yǎng)物在消化道內(nèi)確立之后，用活的沙門氏菌培養(yǎng)物攻擊動(dòng)物，潛伏一段時(shí)間后，接著處死動(dòng)物，動(dòng)物的盲腸內(nèi)容物用于分析沙門氏菌的移生。有效抑制沙門氏菌移生可用平均沙門氏菌濃度(CFU)的減少或動(dòng)物被移生百分率的降低表示，并將處理的動(dòng)物組與未處理的對(duì)照組比較。
我們同樣發(fā)現(xiàn)，按照本發(fā)明或經(jīng)其它任何方法產(chǎn)生的利生菌，通過分析盲腸中易揮發(fā)性脂肪酸的成份譜，同樣可能實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)的準(zhǔn)確篩選。這一技術(shù)并不需要通常的沙門氏菌攻擊。為了評(píng)估任一培養(yǎng)物的效價(jià)，可給適用的動(dòng)物喂服培養(yǎng)物，并如前所述使培養(yǎng)物在消化道內(nèi)確立。處理后約2-3天，優(yōu)選3天，處死動(dòng)物，測(cè)定盲腸內(nèi)容物中丙酸和所有揮發(fā)性脂肪酸(乙酸加丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸)的濃度。測(cè)定上述酸可能使用的技術(shù)為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，包括Corrier等人所述的氣-液色譜法(Avian Dis.，34617-625，1990)，其內(nèi)容在此引入作為參考。當(dāng)(1)盲腸內(nèi)容物中丙酸濃度超過或等于10mmol/g時(shí)，和(或)(2)總的揮發(fā)性脂肪酸的濃度超過未處理對(duì)照組接近100％或更多時(shí)，顯示可作為利生菌以抑制沙門氏菌移生的效價(jià)。盡管允許在第二天以后測(cè)定丙酸的濃度，但如果以總揮發(fā)性脂肪酸濃度的測(cè)定為基準(zhǔn)，則第3天以后的測(cè)定會(huì)使抑菌效價(jià)的預(yù)測(cè)值偏低。
就上述的含29種菌株的利生菌，按本法生產(chǎn)的穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物可能直接作為利生菌使用或貯存待以后使用。類似地，培養(yǎng)物中所包括的細(xì)菌也可能被分離和鑒定；而且，已知或標(biāo)準(zhǔn)化的菌株，或從相同適用動(dòng)物中分離的細(xì)菌，它們都可能替代上述穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物中同屬或同種的細(xì)菌。
在合適的培養(yǎng)基中，使用本領(lǐng)域常規(guī)的無氧培養(yǎng)技術(shù)，通過對(duì)細(xì)菌成批或連續(xù)培養(yǎng)，可能生產(chǎn)大量的本發(fā)明的利生菌。其中，連續(xù)培養(yǎng)具有特別的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榉€(wěn)態(tài)培養(yǎng)物非常穩(wěn)定并可能無限地保持穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)的狀態(tài)。大規(guī)模培養(yǎng)的接種物可能是穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物的樣品或菌種、貯存的培養(yǎng)物或生物學(xué)基本純化的細(xì)菌分離物。細(xì)菌可能聯(lián)合培養(yǎng)，或者為了易于標(biāo)準(zhǔn)化而在不同的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再聯(lián)合培養(yǎng)。對(duì)于后一種技術(shù)，在聯(lián)合培養(yǎng)前每種細(xì)菌的終濃度應(yīng)在108至109個(gè)細(xì)菌/毫升。然而，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的濃度并非關(guān)鍵而且可能改變。
通常，當(dāng)在成批培養(yǎng)中進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，培養(yǎng)物在收獲前應(yīng)溫育約16-72小時(shí)，優(yōu)選24-48小時(shí)。然而，我們發(fā)現(xiàn)無論如何，成批培養(yǎng)應(yīng)持續(xù)直至達(dá)到以下的發(fā)酵參數(shù)(1)乙酸濃度高于或等于約20mM，(2)丙酸濃度高于或等于10mM，(3)丁酸加異丁酸濃度高于或等于15mM。
本發(fā)明中利生菌的使用不受特定的生產(chǎn)方法的影響；上述任何一種方法產(chǎn)生的利生菌可以用同一方法使用。細(xì)菌培養(yǎng)物產(chǎn)生后，可以單獨(dú)或聯(lián)合直接給受試動(dòng)物服用?？晒┻x擇的是，利生菌可能進(jìn)一步地與合適的載體配制，包括但不僅限用乳糖、脫脂乳，或者與少量的食物結(jié)合作為預(yù)先混合物使用。培養(yǎng)物可能凍干以用于穩(wěn)定貯存和易于管理。該凍干培養(yǎng)物可能直接給動(dòng)物服用，或可選地，在使用前重建。應(yīng)特別注意，可使用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)將一種或所有細(xì)菌包入膠囊，包括、但不限于使用藻酸鹽凝膠使其膠囊化。不希望被理論所限定，相信使用這種方法包裹，可以防止一些細(xì)菌將上部腸道內(nèi)乳酸的濃度降至不希望的水平。膠囊化同樣可保護(hù)細(xì)菌并使其到達(dá)盲腸，而該處乳酸的利用是合乎需要的。
本發(fā)明的利生菌可能與其它生物學(xué)基本純化的細(xì)菌聯(lián)用，這些純化的細(xì)菌，特別是那些產(chǎn)生乳酸或揮發(fā)性脂肪酸的細(xì)菌，作為利生菌已用于有效控制家畜或家禽中沙門氏菌。并不僅限于此，其它合適的細(xì)菌可包括胨鏈球菌屬或DeLoach所述的細(xì)菌[U.S.Patent application serialno.07 1822，505](其內(nèi)容在此引入作為參考)。本領(lǐng)域常規(guī)或已知的、用于處理家畜或家禽的其它佐劑，特別是用于抑制腸道病原菌的佐劑，可加到利生菌中。合適的佐劑包括，例如，對(duì)抗革蘭氏陽(yáng)性菌無效的抑球蟲劑。特別優(yōu)選添加乳糖。
本領(lǐng)域常規(guī)的非治療水平的抗生素同樣可以給動(dòng)物或家禽使用。這些抗生素可以與利生菌聯(lián)合或分別服用。亦或，這些抗生素可以治療水平給家禽的蛋使用，但在孵化后約3天內(nèi)其水平降至非治療水平。
雖然本發(fā)明的利生菌主要通過與動(dòng)物飼料或飲水聯(lián)用后被攝取而施用于導(dǎo)入消化道，可展望也可以通過本領(lǐng)域常規(guī)的方法經(jīng)口腔或鼻腔噴霧制劑的形式直接給動(dòng)物服用利生菌。還有其它可選的方法，包括直接灌注到胃腸道中或經(jīng)泄殖腔施用。對(duì)于后者，利生菌可能直接噴在家禽的肛門上或給到禽欄底部的鋪草上，在家禽的正?；顒?dòng)過程中與肛門區(qū)接觸。一但接觸到肛門區(qū)，利生菌可通過逆向蠕動(dòng)而導(dǎo)入泄殖腔。
可在動(dòng)物一生的任何時(shí)期施用利生菌。然而，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，給約1至14天齡的新孵出家禽服用利生菌。
與不經(jīng)處理的動(dòng)物比較，服用有效量的利生菌可以基本抑制沙門氏菌在處理后動(dòng)物中的移生。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員可以容易地確定合適的使用量，并隨動(dòng)物的年齡和大小稍有改變。
以下的實(shí)施例僅試圖進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制權(quán)利要求書中各權(quán)項(xiàng)的范圍。
實(shí)施例1利生菌的制備初始接種初始接種物可從3只10周齡用于焙烤的無沙門氏菌小雞中獲得，這些雞孵化后用不含藥物的飼料或飲水飼養(yǎng)。將雞處死后，無菌條件下取出盲腸并迅速移至無氧容器中(Coy Laboratory Proclucts，Ann Arbor，MI)。將每個(gè)盲腸剪成若干碎塊，并浸漬于實(shí)驗(yàn)室用攪拌器中(Tekmar，Cincinnati，OH)。浸漬的盲腸組織和內(nèi)容物混合在一起并被充分勻漿，之后加入甘油至終濃度為20％，最終的盲腸勻漿混合物于-70℃冷凍直至使用。解凍10ml的冷凍盲腸勻漿物，并在100ml Viande Levure(VL)肉湯培養(yǎng)基中于39℃無氧溫育，并作為種菌用于下面的連續(xù)流動(dòng)(CF)培養(yǎng)。
連續(xù)流動(dòng)裝置。成批和連續(xù)流動(dòng)培養(yǎng)階段均在BioFlo III發(fā)酵器(NewBrunswick Scientific Co.，Edison，NJ)中的1150ml的恒化器中進(jìn)行。當(dāng)培養(yǎng)物在連續(xù)流動(dòng)條件下生長(zhǎng)時(shí)，可使用下列的參數(shù)--稀釋速率0.0416-1(相應(yīng)的流動(dòng)速率為0.80ml/分鐘和整個(gè)容器周轉(zhuǎn)時(shí)間為24小時(shí))，--溫度為39℃，和--攪動(dòng)速度為200rpm。用穩(wěn)定的無O2的CO2氣流充滿容器以保持無氧條件。
連續(xù)流動(dòng)條件下盲腸微生物的生長(zhǎng)。恒化器內(nèi)充滿1050ml無菌的Viande Levure(VL)肉湯培養(yǎng)基和接種100ml的種菌，在成批培養(yǎng)中于39℃、200rpm攪拌速率下無氧溫育。成批培養(yǎng)6小時(shí)后，開動(dòng)營(yíng)養(yǎng)物泵，培養(yǎng)物在連續(xù)流動(dòng)條件下溫育。在連續(xù)流動(dòng)培養(yǎng)后約5天可獲得穩(wěn)態(tài)條件。當(dāng)培養(yǎng)物pH、OD600和揮發(fā)性脂肪酸濃度保持近似不變時(shí)，認(rèn)為達(dá)到穩(wěn)態(tài)條件。
無菌收集經(jīng)過5天和61天培養(yǎng)后的連續(xù)流動(dòng)培養(yǎng)物樣品，并鋪種于補(bǔ)充5％牛血的胰化蛋白 瓊脂、McConkey瓊脂和疾病控制中心血瓊脂(CDCBA)。胰化蛋白 瓊脂和McConkey瓊脂平皿在空氣中于37℃溫育7天。CDCBA平皿在含80％氮?dú)狻?0％氫氣和10％二氧化碳?xì)怏w的無氧室中(Coy Laboratory Products，Ann Arbor，MI)于37℃溫育7天。由15種兼性和14種專性厭氧菌組成的29種細(xì)菌分離物，代表10個(gè)不同種屬的細(xì)菌，在連續(xù)流動(dòng)培養(yǎng)的第5天以及第61天時(shí)進(jìn)行鑒定。29種細(xì)菌分離物可使用本領(lǐng)域常規(guī)的生化、酶促過程和抗微生物敏感性檢測(cè)方法加以鑒定(Holdeman et al.，1977，Anaerobe Laboratory Manual，4th ed.，Virginia Polytechnic Institute and State University，Blacksburg，VA；Farmer et al.，1985，J.Clin.Microbiol.，2146-76；Lennette et al.，1985，Clinical Microbiology，4 th ed.，American Society for Microbiology，Washington，D.C.；and Devriseet al.，1987，Int.J.Syst.Bacteriol.，37257-259，每項(xiàng)內(nèi)容在此引入作為參考)。其結(jié)果在實(shí)施例2中描述。
上述細(xì)菌鑒定為I.兼性厭氧菌，革蘭氏陽(yáng)性球菌(1)糞腸球菌標(biāo)為菌株M，(2)糞腸球菌標(biāo)為菌株N，(3)faecium腸球菌 標(biāo)為菌株Y，(4)faecium腸球菌 標(biāo)為菌株Z，(5)facium腸球菌標(biāo)為菌株X，(6)avium腸球菌(7)糞腸球菌標(biāo)為菌株O，II.兼性厭氧菌，革蘭氏陽(yáng)性球桿菌(8)laetis乳酸球菌亞種雙裂桿菌(diacetylactis)，(9)一種乳酸桿菌屬的菌種(菌株編號(hào)1)，
III.兼性厭氧菌，革蘭氏陰性桿菌(10)大腸桿菌，標(biāo)為菌株CC-3A，(11)弗氏檸檬酸菌株，標(biāo)為菌株CC-3，(12)一種屬于腸桿菌科的細(xì)菌(暫定為腸桿菌種、大腸肝菌或cryocrescens柯洛伊克爾菌)，(13)一種假單胞菌屬的菌種，(14)液化沙雷氏菌，(15)大腸桿菌，標(biāo)為菌株CC-3B，IV.專性厭氧菌，革蘭氏陽(yáng)性桿菌(16)一種丙酸桿菌屬的菌種(菌株編號(hào)1，暫定為詹氏丙酸桿菌或特氏丙酸桿菌)，(17)一種丙酸桿菌屬的菌種(菌株編號(hào)2，暫定為顆粒丙酸桿菌)，(18)一種乳酸桿菌屬的菌種(菌株編號(hào)2)，(19)一種雙歧桿菌屬的菌種(菌株編號(hào)1)，或一種乳酸桿菌屬的菌種(菌株編號(hào)3)，(20)一種丙酸桿菌屬的菌種(菌株編號(hào)3)，(21)一種真細(xì)菌屬的菌種(菌株編號(hào)1)，(22)一種真細(xì)菌屬的菌種(菌株編號(hào)2)，(23)一種未知的細(xì)菌標(biāo)為菌株OAGPB-5，(24)一種真細(xì)菌屬的菌種(菌株編號(hào)3)，(25)一種雙歧桿菌屬的菌種(菌株編號(hào)2)或一種乳酸桿菌的菌種(菌株編號(hào)4)，(26)一種雙歧桿菌屬的菌種(菌株編號(hào)3)或一種乳酸桿菌的菌種(菌株編號(hào)4)，(27)一種丙酸桿菌屬的菌種(菌株編號(hào)4)，V.專性厭氧菌，革蘭氏陰性球菌(28)一種韋永球菌屬的菌種，和VI.專性厭氧菌，革蘭氏陰性桿菌(29)一種梭形桿菌屬的菌種。
連續(xù)流動(dòng)培養(yǎng)物，具有由29種細(xì)菌分離物組成的特征，表現(xiàn)出在混合培養(yǎng)中共存生長(zhǎng)、在酸性條件下具有生存性(pH5.0至6.5)，以及產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸(VFA)作為發(fā)酵終產(chǎn)物。
利生菌的組合物，包括上述所有的29種細(xì)菌株，已在布達(dá)佩斯條約下，存入美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(12301，Parklawn Drive，羅克維爾，MD 20852，美國(guó))，作為排除競(jìng)爭(zhēng)培養(yǎng)物，CF3，指定的保存編號(hào)為ATCC55515。
實(shí)施例2細(xì)菌的特征描繪氣液色譜.從CDCBA所得的29種細(xì)菌中的每種菌株，被接種至蛋白胨酵母(PY)和PY+1％葡萄糖(PYG)肉湯培養(yǎng)基中，接著于37℃無氧溫育2天。使用標(biāo)準(zhǔn)步驟提取揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)和非揮發(fā)性脂肪酸(NVFAs)，接著使用GowMac氣液色譜(GLC)檢測(cè)。GLC通過VFAs和NVFAs的商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品加以標(biāo)定。其結(jié)果由表1A-C顯示。
細(xì)胞、菌群、培養(yǎng)的特征描繪。兼性厭氧菌1-15的革蘭氏反應(yīng)和細(xì)胞的形態(tài)使用革蘭氏染色法加以測(cè)定，細(xì)菌在涂片前已在血瓊脂中于空氣中37℃溫育24小時(shí)。細(xì)菌的活動(dòng)性使用含四唑鹽的軟瓊脂(0.4％)流動(dòng)培養(yǎng)基測(cè)定。從血瓊脂中取菌接種于流動(dòng)培養(yǎng)基中，并在空氣中37℃溫育24小時(shí)。每個(gè)測(cè)定進(jìn)行兩次。
為確定培養(yǎng)特性，細(xì)菌1-9接種于2份血瓊脂、2份MacConkey瓊脂、2份疊氮化鈉血瓊脂和2份膽汁七葉苷瓊脂平皿。將1份血瓊脂、1份MacConkey瓊脂、1份疊氮化鈉血瓊脂和1份膽汁七葉苷瓊脂平皿在空氣中37℃溫育。1份血瓊脂和1份MacConkey瓊脂平皿在含80％氮?dú)狻?0％氫氣和10％二氧化碳的氣體中37℃溫育。1份疊氮鈉血瓊脂和1份膽汁七葉苷瓊脂平皿在空氣中于45℃溫育2天。在溫育后的第1和第2天記錄細(xì)菌的生長(zhǎng)能力、菌群特性和血瓊脂上溶血類型、MacConkey瓊脂上乳糖反應(yīng)和膽汁七葉苷瓊脂上七葉苷水解反應(yīng)。每個(gè)測(cè)定進(jìn)行兩次。
為確定革蘭氏陰性兼性厭氧菌的培養(yǎng)特征，可重復(fù)上述相同的過程，但省去疊氮化鈉血瓊脂和膽汁七葉苷瓊脂平皿。
對(duì)于專性厭氧菌16-29，使用革蘭氏染色測(cè)定細(xì)菌的革蘭氏反應(yīng)和細(xì)胞形態(tài)，細(xì)菌涂片前已在富含血紅素和甲萘醌的腦和心臟血浸漬的瓊脂(CDCBA)上、在含80％氮?dú)狻?0％氫氣和10％二氧化碳空氣中于37℃溫育2天。為測(cè)定細(xì)菌活動(dòng)性，從CDCBA上取菌至所用的、商業(yè)性預(yù)先造成無氧的無菌(PRAS)培養(yǎng)基中，并于37℃無氧溫育2天。
為確定細(xì)菌的培養(yǎng)特性，細(xì)菌16-29接種于2份CDCBA和2份MacConkey瓊脂平皿中。1份CDCBA和1份MacConkey瓊脂平皿在空氣中37℃溫育，1份CDCBA和MacConkey瓊脂平皿于37℃無氧溫育。溫育后1、3、5天記錄細(xì)菌的生長(zhǎng)能力、菌群特性和CDCBA上的溶血類型。
以上結(jié)果在表2A-C中顯示。
過氧化氫酶、氧化酶和硝酸鹽還原測(cè)定。對(duì)于兼性厭氧菌1-9，在血瓊脂上于空氣中37℃溫育2天后，菌群可用于進(jìn)行過氧化氫酶和氧化酶的測(cè)定。過氧化氫酶和氧化酶測(cè)定用的試劑分別為3％H2O2和1％四甲基對(duì)苯二胺二鹽酸鹽溶液。兩種酶反應(yīng)記錄為陽(yáng)性或陰性。每個(gè)測(cè)定進(jìn)行兩次。同樣的程序用于測(cè)定革蘭氏陰性的兼性厭氧菌10-15，只是培養(yǎng)物只溫育24小時(shí)。
對(duì)于專性厭氧菌16-29，在CDCBA上于37℃無氧溫育2天后，菌群用于進(jìn)行過氧化氫酶和氧化酶的測(cè)定。兩種酶測(cè)定的試劑與上相同。用于兩種酶測(cè)定的細(xì)菌在加入試劑前先在空氣中暴露30分鐘。所有反應(yīng)記錄為陽(yáng)性或陰性。每個(gè)測(cè)定進(jìn)行兩次。
使用兩種方法檢測(cè)兼性厭氧菌1-15中的硝酸鹽還原酶。對(duì)于硝酸鹽瓊脂法，在含0.1％KNO3的瓊脂上接種來自血瓊脂已于空氣中37℃溫育24小時(shí)的細(xì)菌。于37℃溫育24小時(shí)后，使用試劑A和B(N，N′-二甲基萘胺和對(duì)氨基苯磺酸)測(cè)定。對(duì)于無氧的血瓊脂-紙片法，在血瓊脂上劃種細(xì)菌后，將一浸漬0.4％KNO3溶液的圓紙片放在劃種細(xì)菌密集的區(qū)域。平皿于37℃無氧溫育24小時(shí)后，將試劑A和B加在測(cè)定紙片上。為確定已被還原的硝酸鹽是否超過現(xiàn)存的硝酸鹽，將鋅粉加至經(jīng)測(cè)定試劑處理過的紙片上。所有反應(yīng)記錄為陰性或陽(yáng)性。每個(gè)測(cè)定進(jìn)行兩次。
對(duì)于專性厭氧菌16-29，使用以上的無氧血瓊脂-紙片法測(cè)定硝酸鹽還原酶，只是用CDCBA代替血瓊脂。
結(jié)果顯示于表3A-C。
有氧碳水化合物利用測(cè)定。對(duì)于兼性厭氧菌1-9，來自葡萄糖、半乳糖醇、乳糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷和蔗糖的酸性產(chǎn)物，使用1％的底物，在酚紅液體培養(yǎng)基中加以測(cè)定。用德拉姆管測(cè)定葡萄糖培養(yǎng)液中的產(chǎn)氣量。將已在空氣中37℃溫育24小時(shí)的、來自血瓊脂的受檢細(xì)菌接種于每個(gè)管中。培養(yǎng)液在空氣中于37℃溫育2天。觀察每管的顏色變化。管為紅色記錄為陰性，管呈黃色記錄為陽(yáng)性。每個(gè)測(cè)定進(jìn)行兩次。
用同樣的過程測(cè)定革蘭氏陰性兼性厭氧菌10-15，但只分析葡萄糖、乳糖和蔗糖。
將三糖鐵(TSI)瓊脂接種來自已在血瓊脂中37℃溫育24小時(shí)的、所有兼性厭氧菌1-15的培養(yǎng)物。在空氣中37℃溫育24小時(shí)后，TSI瓊脂反應(yīng)記錄為陽(yáng)性或陰性。每個(gè)測(cè)定進(jìn)行兩次。
對(duì)于兼性厭氧菌1-9，從血瓊脂中接種至Voges-Proskauer液體培養(yǎng)基中，接著在空氣中于37℃溫育24小時(shí)。加入試劑A和B(40％KOH和α-萘酚)。反應(yīng)記錄為陽(yáng)性或陰性。每個(gè)測(cè)定進(jìn)行兩次。
對(duì)于革蘭氏陰性兼性厭氧菌10-15，從血瓊脂平皿中接種至2份甲基紅-Voges Proskauer液體培養(yǎng)管(A和B)，接著在空氣中37℃溫育24小時(shí)。對(duì)于甲基紅測(cè)定，將1份甲基紅染料溶液加入A管。對(duì)于Voges-Proskauer測(cè)定，將試劑A和B(40％KOH和α-萘酚)加入管B。反應(yīng)用陽(yáng)性或陰性記錄。每個(gè)測(cè)定進(jìn)行兩次。
結(jié)果顯示于表3A-C。
氨基酸利用和尿素酶測(cè)定。革蘭氏陰性兼性厭氧菌10-15測(cè)定賴氨酸脫羧酶和尿素酶，細(xì)菌1-15測(cè)定吲哚的生成。用賴氨酸鐵瓊脂(LIA)檢測(cè)賴氨酸脫羧酶。從血瓊脂平皿中取菌接種至LIA，并在空氣中37℃溫育24小時(shí)。反應(yīng)用陽(yáng)性或陰性記錄。每個(gè)測(cè)定進(jìn)行兩次。
使用兩種方法檢測(cè)從色氨酸產(chǎn)生的吲哚。從血瓊脂中取菌接種至色氨酸液體培養(yǎng)基，并在空氣中37℃溫育24小時(shí)，接著與Ehrlich′s試劑反應(yīng)。使用厭氧瓊脂-紙片法，在血瓊脂平皿上劃種細(xì)菌，接著將一張紙片放在瓊脂表面。該血瓊脂平皿于37℃無氧溫育24小時(shí)，接著用1％對(duì)二甲胺基肉桂醛(P-dimethylaminocinnamal dehyde)測(cè)定紙片。所有結(jié)果用陽(yáng)性或陰性記錄。色氨酸液體培養(yǎng)基測(cè)定重復(fù)兩次，而厭氧瓊脂-紙片法一次。
從血瓊脂平皿中取菌接種至尿素瓊脂，接著在空氣中37℃溫育24小時(shí)。反應(yīng)用陽(yáng)性或陰性記錄。測(cè)定重復(fù)兩次。
這些結(jié)果也顯示于表3A-C。
商業(yè)性API 20E系統(tǒng)。革蘭氏陰性兼性厭氧菌10-15還用20種化學(xué)反應(yīng)(表4)加以評(píng)估，按廠家說明使用一種商業(yè)反應(yīng)系統(tǒng)(AnalytabProducts，Plainview，NY)。測(cè)定重復(fù)兩次。
結(jié)果顯示于表4。
碳水化合物發(fā)酵、明膠液化和氨基酸利用測(cè)定。將血瓊脂上兼性厭氧菌1-15的稠密懸液接種于商業(yè)性的預(yù)先造成無氧的無菌(PRAS)液體培養(yǎng)基中(表5)。該液體培養(yǎng)基在空氣中37℃溫育5天，在接種后第1、3、5天，用pH計(jì)測(cè)定每份培養(yǎng)物的pH值。培養(yǎng)物的pH≤6.5記為陽(yáng)性，而培養(yǎng)物pH≥6.6為陰性。精氨酸培養(yǎng)基用增加的pH值評(píng)估，而明膠培養(yǎng)基則用液化作用評(píng)估。每個(gè)測(cè)定進(jìn)行一次。
對(duì)于專性厭氧菌16-29可重復(fù)相同過程，僅接種物來自CDCBA上生長(zhǎng)的細(xì)菌，以及所有溫育均在無氧條件下。
結(jié)果顯示于表5A-C和3A-C。
商業(yè)性的API Rapid STREP系統(tǒng)測(cè)定。使用商業(yè)性的鑒定腸球菌和鏈球菌系統(tǒng)評(píng)估兼性厭氧菌1-9的20種生化特性，測(cè)定按廠家說明(Analytab Products，Plainview，NY)。簡(jiǎn)而言之，將已在血瓊脂中于空氣37℃溫育24小時(shí)的菌落懸浮至3ml的無菌蒸餾水中，以提供與McFarland 5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)相同的細(xì)菌懸液。在每個(gè)器皿中接種細(xì)菌，然后在空氣中37℃溫育24小時(shí)。溫育24小時(shí)后，加入試劑以測(cè)定羥基丁酮的生成、馬尿酸鹽水解作用和吡咯烷酮基-2-萘酰胺(Pyrrolidonyl-2-naphthylamide)的酶催化反應(yīng)、α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶和亮氨酸芳胺酶。在室溫下溫育10分鐘后以陽(yáng)性或陰性記錄反應(yīng)。七葉苷水解、精氨酸二水解酶，以及從核糖、阿拉伯糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、海藻糖、菊粉、蜜三糖、淀粉和糖原來的酸性產(chǎn)物均以陽(yáng)性或陰性記錄。每個(gè)測(cè)定進(jìn)行兩次。
結(jié)果顯示于表6。
商業(yè)性APESTAPH Trac系統(tǒng)測(cè)定。使用商業(yè)性的系統(tǒng)評(píng)估兼性厭氧菌1-9的19種生化性質(zhì)(表7)，測(cè)定按廠家說明(Analytab Products，Plainview，NY)。簡(jiǎn)而言之，將已在血瓊脂中于空氣37℃溫育24小時(shí)的菌落懸浮于3ml無菌蒸餾水中，以提供與McFarland 5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)相同的細(xì)菌懸液。每個(gè)器皿中接種細(xì)菌，并在空氣中37℃溫育24小時(shí)。溫育24小時(shí)后，加入試劑以測(cè)定羥基丁酮生成、堿性磷酸酶、硝酸鹽還原酶和α-甲基-葡萄糖苷的酶促化反應(yīng)，以及精氨酸二水解酶、葡萄糖、果糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、N-乙酰氨基葡萄糖、蜜三糖、蔗糖、海藻糖、尿素酶、木糖醇和木糖。反應(yīng)用陽(yáng)性或陰性記錄。每個(gè)測(cè)定進(jìn)行兩次。
結(jié)果顯示于表7。
商業(yè)性APIZYM系統(tǒng)測(cè)定。使用商業(yè)性半定量酶系統(tǒng)評(píng)估所有兼性厭氧菌1-15對(duì)19種底物的酶活性，測(cè)定按廠家說明(Analytab Products，Plainview，NY)。簡(jiǎn)而言之，將已在血瓊脂中于空氣37℃溫育24小時(shí)的菌落懸浮于3ml無菌蒸餾水中，以提供與McFarland 5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)相同的細(xì)菌懸液。每個(gè)器皿中接種細(xì)菌懸液。在暗處于37℃溫育24小時(shí)后，每個(gè)器皿中加入試劑A和B，然后在室溫條件下反應(yīng)進(jìn)行5分鐘。反應(yīng)的顏色深淺與廠家的示意圖比較，并定級(jí)如下0＝無顏色改變，痕跡量＝＜5納摩爾(nmol)，1＝5nmol，2＝10nmol，3＝20nmol，4＝30nmol和5≥40nmol。
對(duì)于專性厭氧菌16-29，或重復(fù)上述過程，只是接種物來自CDCBA上無氧生長(zhǎng)的細(xì)菌。
結(jié)果顯示于表8A-C。
商業(yè)性的Presumpto平皿I、II和III。對(duì)于專性厭氧菌16-29，從CDCBA上接種細(xì)菌至Presumpto平皿I、II和III上，接著于37℃無氧溫育2天。測(cè)定進(jìn)行和結(jié)果記錄均按廠家說明(表9)。每個(gè)測(cè)定進(jìn)行兩次。
結(jié)果顯示表9A-D。
抗菌劑敏感性測(cè)定。用標(biāo)準(zhǔn)的圓盤-擴(kuò)散法測(cè)定兼性厭氧菌1-15對(duì)表10顯示的所選抗微生物試劑的抗菌劑敏感性。結(jié)果用抗性的(R)或敏感性的(S)(包括中等敏感性的)記錄。每個(gè)測(cè)定進(jìn)行一次。
對(duì)于專性厭氧菌16-29重復(fù)上述過程，只是使用CDCBA并且對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行無氧溫育。
結(jié)果顯示于10A-C。
結(jié)果。測(cè)定結(jié)果由表1-10顯示。所有細(xì)菌按標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物和生化標(biāo)準(zhǔn)加以鑒定。
實(shí)施例3用焙烤用(Broiler)雛雞的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)沙門氏菌.從家禽中分離的原代鼠傷寒沙門氏菌得自國(guó)立獸醫(yī)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室，Ames，IA 50010，在我們實(shí)驗(yàn)室中被選擇新生霉素(NO)和萘啶酮酸(NA)耐受性，并在含25mg NO和20mg NA/ml的培養(yǎng)基中維持生長(zhǎng)。攻擊用接種菌由隔夜培養(yǎng)物制備而來，此培養(yǎng)物已在胰化酪蛋白大豆液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移過三次，并經(jīng)無菌磷酸緩沖液逐步稀釋至濃度為4×104cfu/1.0mL。攻擊接種物中活菌的濃度在亮綠瓊脂(BGA)平皿上經(jīng)菌落計(jì)數(shù)證實(shí)。在實(shí)驗(yàn)研究中。用于培養(yǎng)攻擊后對(duì)NO-NA耐受的雛雞分離物的培養(yǎng)基中含有25mg NO和20mg NA/mL，以抑制其它細(xì)菌和非耐受性沙門氏菌的生長(zhǎng)。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。得自商業(yè)孵卵場(chǎng)的當(dāng)日孵出的雄性焙烤用雛雞，放置于以松木屑做墊料的有底層的雞籠中。給雛雞維持連續(xù)的光照，并供給自由攝取的飼水，以及不含藥物的谷物和大豆飼料，這些飼料含有或超過由國(guó)立研究會(huì)(1984)推薦的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)成份的水平。將運(yùn)輸雛雞盒子的紙襯和隨機(jī)選取的3份25g飼料樣品在緩沖性蛋白胨水、亞硒酸鹽胱氨酸液體培養(yǎng)基和如前所述的BGA平皿中(Andrews et al.，1978，Isolationand Identification of Salmonella.InBacteriological AnalyticalManual，5th ed.，Assoc.Off.Anal.Chem.，Washington，D.C.，Chapter6，1-24)依次培養(yǎng)，并檢測(cè)沙門氏菌屬的細(xì)菌。在紙內(nèi)襯或飼料中不可檢出spp.沙門氏菌。將雛雞隨機(jī)分成兩組，在其第一次飼水中提供1)沒有處理(對(duì)照)，或2)特定的細(xì)菌培養(yǎng)物(CC)。CC取自實(shí)施例1中連續(xù)流動(dòng)培養(yǎng)外流物，含有大約108厭氧菌cfu/ml，并以1∶5的比例加入飲水中(1份CC；4份水)。給處理組的雛雞提供18小時(shí)處理過的飲水，而且每只雛雞估計(jì)可飲用10ml經(jīng)CC處理的飲水。18個(gè)小時(shí)后，取走剩余的處理過的飲水并換成新鮮的自來水。第三天，CC處理后兩天及沙門氏菌攻擊前，每組隨機(jī)取10只雛雞并無痛苦拉頸處死。盲腸內(nèi)容物中丙酸類揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的濃度和總VFA(乙酸+丙酸+丁酸+異丁酸+戊酸+異戊酸)的濃度由以前報(bào)導(dǎo)的氣液色譜法測(cè)定(Corrier et al.，1990，Avian Dis.，34617-625)。按推薦的評(píng)估盲腸細(xì)菌新制備培養(yǎng)物效價(jià)的方法，所有剩余的雛雞均用嗉囔管飼法給104cfu的鼠傷寒沙門氏菌加以攻擊(Mead et al.，1989，J.Food Protect.，52500-502)。在10天大小，每組取20只雛雞，無痛苦處死，從每只雞中無菌取出盲腸內(nèi)容物，并按下文所述的方法評(píng)估鼠傷寒沙門氏菌的移生。從上述的10日齡處死的雞中隨機(jī)取10份腸內(nèi)容物，并用前述的方法測(cè)定VFA的濃度。以上試驗(yàn)設(shè)計(jì)在4個(gè)不同的試驗(yàn)中加以重復(fù)，即使用新孵出的雛雞和在連續(xù)流動(dòng)培養(yǎng)中分別持續(xù)5天(試驗(yàn)1)、26天(試驗(yàn)2)、40天(試驗(yàn)3)和61天(試驗(yàn)4)的特定盲腸細(xì)菌。在試驗(yàn)2、3、4過程中測(cè)定VFA′s在盲腸內(nèi)容物中的濃度，而在實(shí)驗(yàn)1中不測(cè)定。
與對(duì)照組比較，試驗(yàn)2、3、4在第3天和第10天時(shí)，處理組雛雞的盲腸內(nèi)容物中丙酸濃度顯著升高(p＜0.005)(表11)。另外，3日齡處理組雞的盲腸丙酸濃度增加與10日齡處理組雞盲腸內(nèi)容物中沙門氏菌數(shù)目的log10值下降之間存在著顯著的相關(guān)性(p＜0.005)(r＝-0.99)。
在第3天，與對(duì)照組比較，處理組雞盲腸內(nèi)容物中總VFA′s的濃度顯著增加(p＜0.01)(表12)。另外，3日齡處理組雞中總VFA濃度的增加與10日齡處理組雞盲腸內(nèi)容物中沙門氏菌數(shù)目的log10值降低之間存在著顯著相關(guān)(p＜0.01)(r＝-0.67)。在第10天，對(duì)于試驗(yàn)3和4，與對(duì)照組比較，處理組雞盲腸中總VFA′s的濃度顯著升高(p＜0.05)。
鼠傷寒沙門氏菌在盲腸中的繁殖。如上所述，無菌條件下取走每只雞一部分盲腸，用剪刀剪碎，并在30ml的亞硒酸鹽-胱氨酸液體培養(yǎng)基中于37℃溫育24小時(shí)。溫育后將培養(yǎng)液劃種于BGA平皿上，溫育24小時(shí)并檢測(cè)典型性鼠傷寒沙門氏菌的菌落。將1份來自剩余盲腸的內(nèi)容物(0.2g)依次以1∶100、1∶1000和1∶10000稀釋并平鋪至BGA平皿上。平皿于37℃溫育24小時(shí)，鼠傷寒沙門氏菌的cfu的數(shù)目使用自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀(Biotran III，New Brunswick Scientific，Edison，NJ)確定。典型的沙門氏菌菌落還用三糖鐵瓊脂和賴氨酸鐵瓊脂(DefcoLaboratories，Detroit，MI)上的生化測(cè)定加以證實(shí)，以及使用沙門氏菌0抗血清，組13，因子1、4、12、15(Difco Laboratories，Detroit，MI)做鼠傷寒沙門氏菌的血清學(xué)鑒定。沙門氏菌的菌群平皿接種數(shù)用每克盲腸內(nèi)容物中l(wèi)og10沙門氏菌數(shù)表示。若盲腸容物在1∶100稀釋下沙門氏菌培養(yǎng)為陰性，而在亞硒酸鹽-胱氨酸培養(yǎng)時(shí)呈陽(yáng)性，則將其log10沙門氏菌/g盲腸容物的值規(guī)定為1.50。亞硒酸鹽-胱氨酸的培養(yǎng)物在BGA平皿上為陰性則log10沙門菌值規(guī)定為0。
為評(píng)估CC處理后對(duì)沙門氏菌攻擊抗性的效價(jià)按以前所述的方法計(jì)算“保護(hù)系數(shù)”(PF)(Pivnick and Nurmi，1982，The Nurmi Concept andits Rolein the Control of Salmonellae in Poultry，InDevelopmentsin Food Microbiology，Davies(ed.)，Applied Sciences Publishers，London，41-70；Mead etal.，1989，J.Food Protect.，52500-502)。PF＝(對(duì)照組log10沙門氏菌的均值/處理組log10沙門氏菌的均值)。
用χ方分析(chi-square)分析各組間鼠傷寒沙門氏菌培養(yǎng)陽(yáng)性雛雞在數(shù)目上的差異。各組均值的差異用Student′s t檢驗(yàn)確定。相關(guān)的顯著性和所有統(tǒng)計(jì)過程均按文獻(xiàn)所述進(jìn)行(Snedecor and Cochran，1967，Statistical Mefhods，6th ed.，Iowa Atate University Press，Ames，IA)。
與對(duì)照組比較，處理組雞盲腸內(nèi)容物中鼠傷寒沙門氏菌的數(shù)目顯著降低(p＜0.005)，在1、2、3、4每次實(shí)驗(yàn)中分別降低了6.35、5.39、3.84和5.77個(gè)log10單位(表13)。計(jì)算保護(hù)系數(shù)用于估計(jì)特定培養(yǎng)物的效價(jià)，在試驗(yàn)1、2、3、4中PF分別測(cè)定為63.5、7.14、15.2和10.6。
在四次實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)所用的攻擊劑量104鼠傷寒沙門氏菌導(dǎo)致了對(duì)照組中90％至100％的10日齡雛雞的盲腸中有沙門氏菌的移生(表14)。與對(duì)照組比較，處理組盲腸培養(yǎng)沙門氏菌陽(yáng)性的雛雞數(shù)目顯著降低(p＜0.01)，在1、2、3、4每次試驗(yàn)中分別下降了100％、65％、75％和60％。
實(shí)施例4利生菌的制備使用本發(fā)明連續(xù)培養(yǎng)方法可制備第二種穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物，其內(nèi)容如patent application serial no.07/921,173，1992年7月29日提交，的專利所述，其內(nèi)容在此引入作為參考。
該穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物稱為CF II，由11種不同的細(xì)菌組成，包括四種兼性革蘭氏陽(yáng)性厭氧球菌，兩種兼性革蘭氏陽(yáng)性厭氧桿菌，三種兼性革蘭氏陰性厭氧桿菌，一種專性革蘭氏陽(yáng)性氧桿菌和一種專性革蘭氏陽(yáng)性厭氧球桿菌。細(xì)菌鑒定如下(1)糞腸球菌(標(biāo)為菌株A)，(2)糞腸球菌(標(biāo)為菌株B)，(3)avium腸球菌，(4)lactis腸球菌，(5)乳酸桿菌類 (標(biāo)為CMS)，(6)animalis乳酸桿菌，(7)弗氏檸檬酸菌，
(8)大腸桿菌，(9)費(fèi)羅因德埃希桿菌，(10)animalis雙歧桿菌，和(11)丙酸丙酸桿菌。
當(dāng)給家禽服用時(shí)，這一穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物證明基本上具有利生菌的效果，與未處理家禽相比，它可以顯著降低鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌在家禽中的移生。
應(yīng)理解，上述詳細(xì)描述僅作為闡述，可對(duì)其進(jìn)行改良和變化，而不偏離本發(fā)明的宗旨和范圍。
我們要求
表1A組I 組21234567 89揮發(fā)性脂肪酸PY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PG PY/PGPY/PG甲酸 S/S S/S -/- T/- -/- -/- -/T-/- -/-乙酸 S/S S/S T/T T/- -/T -/- S/T-/- T/T丙酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-異丁酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-丁酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-異戊酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-戊酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-異癸酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-癸酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-非揮發(fā)性脂肪酸丙酮酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-乳酸 T/L T/L T/L S/L T/L T/L L/LS/L T/L丁酮二酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-丙二酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-延胡索酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-丁二酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-苯甲酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-苯乳酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/- -/-VIAs和NVFAs的量表示如下-＝?jīng)]有產(chǎn)生；T＝痕跡量產(chǎn)生；S＝少量產(chǎn)生 L＝大量產(chǎn)生；V＝極大量的產(chǎn)生；
表1B組III 組IV10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20揮發(fā)性脂肪酸 PY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PG甲酸-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/T -/- -/- -/- -/-乙酸S/L S/S S/L T/T T/- S/S T/S S/S T/T -/- S/S丙酸T/- T/- T/- -/- -/- -/- T/L L/L -/- -/- S/S異丁酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-丁酸-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-異戊酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-戊酸-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- /-異癸酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-癸酸-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-非揮發(fā)性脂肪酸丙酮酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-乳酸-/L -/L -/L -/- -/S L/- T/S T/S S/S -/- -/-丁酮二酸-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-丙二酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-延胡索酸-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-丁二酸 -/- -/- -/- -/- -/T -/- -/- -/- -/- -/- S/S苯甲酸 L/L L/T L/T -/- -/- L/L T/T -/- -/- -/- -/-苯乳酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
表1C組4 組5組621 22 23 24 25 26 27 28 29揮發(fā)性脂肪酸 PY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PGPY/PG PY/PG PY/PG甲酸-/- -/- -/- T/- -/- -/- -/--/--/-乙酸S/L L/S S/- S/- -/- -/S T/TT/TS/T丙酸-/- -/- -/- S/L -/- -/- S/-L/L-/-異丁酸 -/- -/- -/- -/T -/- -/- -/--/--/-丁酸V/L -/S -/- -/S -/- -/- -/--/-L/V異戊酸 -/- -/- -/- -/L -/- -/- -/--/--/-戊酸-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/--/-異癸酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/--/-癸酸-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/--/-非揮發(fā)性脂肪酸丙酮酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/--/-乳酸T/S T/- -/- -/- S/L T/L -/--/--/-丁酮二酸-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/--/-丙二酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/--/-延胡索酸-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/--/-丁二酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/--/-苯甲酸 S/- -/L L/- L/- -/- -/- L/L-/--/-苯乳酸 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/--/--/-
表2A細(xì)胞、培養(yǎng)和菌落特性條件12345678910革蘭氏反應(yīng) +++++++++-形態(tài)學(xué) ccccccccb bb活動(dòng)性 ----------細(xì)菌呼吸fa fa fa fa fa fa fa fa fa fa生長(zhǎng)于血瓊脂++++++++++MacConkey瓊脂 ---------+疊氮鈉血瓊脂+++++++--NA膽汁七葉苷瓊脂(37℃) +++++++ NA膽汁七葉苷瓊脂(45℃) +++++++ NACDCBA瓊脂 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA溶血--++++-++-乳糖反應(yīng)在MacConkey瓊脂 NA NA NA NA NA NA NA NA NA +七葉苷水解 ++++++ NA形態(tài)學(xué)c＝球菌，b＝桿菌，cb＝球桿菌細(xì)菌呼吸oa＝專性厭氧菌，fa＝兼性厭氧菌CDCBA＝富含血紅素和甲萘醌的腦和心臟浸漬血瓊脂溶血測(cè)定對(duì)兼性厭氧菌在血瓊脂上，對(duì)專性厭氧菌在CDCBA上NA＝不能使用表2B細(xì)胞、培養(yǎng)和菌落特性條件11121314151617181920革蘭氏反應(yīng) - - - - - + + + + +形態(tài)學(xué) b b b b b b b b b b活動(dòng)性 + - + + - - - - - -細(xì)菌呼吸fafafafafaoaoaoaoaoa生長(zhǎng)于血瓊脂+ + + + + NANANANANAMacConkey瓊脂 + + + + + - - - - -疊氮鈉血瓊脂NANANANANANANANANANA膽汁七葉苷瓊脂(37℃) NANANANANANANANANANA膽汁七葉苷瓊脂(45℃) NANANANANANANANANANACDCBA瓊脂 NANANANANA+ + + + +溶血- - - - - - - +乳糖反應(yīng)在MacConkey瓊脂 + + - - +七葉苷水解 NANANANANANANANANANA
表2C細(xì)胞、培養(yǎng)和菌落特性條件 212223242526272829革蘭氏反應(yīng)+ + + + + + + --形態(tài)學(xué)b cbb b b b cbcb活動(dòng)性- - - - - - - --細(xì)菌呼吸 oaoaoaoaoaoaoaoaoa生長(zhǎng)于血瓊脂 NANANANANANANANANAMacConkey瓊脂 - - - - - - - --疊氮鈉血瓊脂NANANANANANANANANA膽汁七葉苷瓊脂(37℃)NANANANANANANANANA膽汁七葉苷瓊脂(45℃)NANANANANANANANANACDCBA瓊脂 + + + + + + + ++溶血--乳糖反應(yīng) 在MacConkey瓊脂七葉苷水解NANANANANANANANANA
表3A生化特性條件1 2 3 4 5 6 7 8 9 10過氧化氫酶 - - - - - - - - - +氧化酶 - - - - - - - - - -硝酸鹽還原硝酸鹽瓊脂- - - - - - - - - +無氧條件 - - - - - - - - + +葡萄糖肉湯培養(yǎng)基產(chǎn)酸 + + + + + + + + + +產(chǎn)氣 - - - - - - - - - +碳水化合物利用半乳糖醇 - - - - - - - - -乳糖 + + + + + + + + + +麥芽糖+ + + + + + + + +甘露醇+ + + + + + + + -水楊苷+ + + + + + + + +蔗糖 + + + + + + + + + +TSI瓊脂Butt/Slant a/aa/aa/aa/aa/aa/aa/aa/aa/aa/a產(chǎn)氣 - - - - - - - - - +硫化氫 - - - - - - - - -甲基紅 + + + + + + + - +Vogues-Proskauer- - - - - - - + - -吲哚生成- - - - - - - - - +枸椽酸鹽+ + - + - - - - - -丙二酸鹽- - - - - - - - -精氨酸二水解酶 + + + + - + + + +賴氨酸脫羧酶NA NA NA NA NA NA NA NA NA +明膠液化+ + - - - - - - -尿素酶 - - - - - - - - - -表3A(繼續(xù))硝酸鹽還原硝酸鹽瓊脂+＝生長(zhǎng)，-＝不生長(zhǎng)厭氧用血瓊脂紙片法測(cè)定碳水化合物利用+＝產(chǎn)酸，-＝不產(chǎn)酸TSI瓊脂butt/slanta＝酸性，b＝堿性，賴氨酸脫羧酶測(cè)定于LIA瓊脂NA＝無法使用表3B生化特性條件 1112131415 1617181920過氧化氫酶 + + + + +- - - - -氧化酶 - - + - -- - - - -硝酸鹽還原硝酸鹽瓊脂 + + + + +NANANANANA無氧條件 + + + + +- - -葡萄糖肉湯培養(yǎng)基產(chǎn)酸 + - + +NANANANANA產(chǎn)氣 + - - +NANANANANA碳水化合物利用半乳糖醇 - - -NANANANANA乳糖 + + - - +NANANANANA麥芽糖 - + +NANANANANA甘露醇 - + NANANANANA水楊苷 -NANANANANA蔗糖 + + - + -NANANANANATSI瓊脂Butt/Slanta/a a/a b/b a/b a/a NANANANANA產(chǎn)氣 + + - +NANANANANA硫化氫 + - - -NANANANANA甲基紅 + + - + +NANANANANAVogues-Proskauer - - - - -NANANANANA吲哚生成 - + - - +NANANANANA枸椽酸鹽 + - + + +NANANANANA丙二酸鹽 + + NANANANANA精氨酸二水解酶- - + + -賴氨酸脫羧酶 - + + + +明膠液化 - - - - -尿素酶 - - - - -- - - - -
表3C生化特性條件212223242526272829過氧化氫酶 - - - - - - - - -氧化酶 - - - - - - - - -硝酸鹽還原硝酸鹽瓊脂NANANANANANANANANA無氧條件-葡萄糖肉湯培養(yǎng)基產(chǎn)酸 NANANANANANANANANA產(chǎn)氣 NANANANANANANANANA碳水化合物利用半乳糖醇 NANANANANANANANANA乳糖 NANANANANANANANANA麥芽糖NANANANANANANANANA甘露醇NANANANANANANANANA水楊苷NANANANANANANANANA蔗糖 NANANANANANANANANATSI瓊脂Butt/SlantNANANANANANANANANA產(chǎn)氣 NANANANANANANANANA硫化氫NANANANANANANANANA甲基紅 NANANANANANANANANAVogues-ProskauerNANANANANANANANANA吲哚生成NANANANANANANANANA枸椽酸鹽NANANANANANANANANA丙二酸鹽NANANANANANANANANA精氨酸二水解酶+ + - - + +賴氨酸脫羧酶明膠液化 - - - - - -尿素酶- - - - - +
表4APE 20E系統(tǒng)細(xì)菌(分離物)生化測(cè)定 101112131415ONPG +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+精氨酸二水解酶-/- +/+ -/- +/+ +/+ -/-賴氨酸脫羧酶 +/+ -/- +/+ +/+ +/+ +/+鳥氨酸脫羧酶 +/+ -/- +/+ +/+ +/+ -/-枸椽酸鹽 -/- +/+ -/- +/+ +/+ -/-H2S -/- +/+ -/- -/- -/- -/-尿素酶-/- -/- -/- +/+ +/+ -/-色氨酸脫氨酶 -/- -/- -/- -/- -/- -/-吲哚 +/+ -/- +/+ -/- -/- +/+Voges-Proskauer -/- -/- -/- -/- +/+ -/-明膠 -/- -/- -/- +/+ +/+ -/-葡萄糖+/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+甘露醇+/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+肌醇 -/- -/- -/- -/- +/+ -/-山梨醇+/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+鼠李糖+/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+蔗糖 +/+ -/- +/+ -/- +/+ +/+蜜二糖+/+ -/- +/+ -/- +/+ +/+苦杏仁苷 -/- -/- +/+ -/- +/+ +/+阿拉伯糖 +/+ +/+ +/+ -/- +/+ +/+*重復(fù)實(shí)驗(yàn)/實(shí)驗(yàn)2的數(shù)據(jù)表5A碳水化合物發(fā)酵測(cè)定細(xì)菌(分離物)碳水化合物底物1234567891011核糖醇+----+---- -阿拉伯糖 +++++++--+ +半乳糖醇 ---------- -果糖 ++++++++++ +甘油 ++--+++-++ +乳酸 -----ND --+- -麥芽糖++--++++++ +甘露糖++--++++++ +蜜二糖+-+--++--- -蜜三糖---++-+-++ -核糖 +++++++++- +山梨醇+++-+++-++ +蔗糖 ++++++++++ -木糖 ++-+++++++ +苦杏仁苷 ++++++-+-- -纖維二糖 +++++--++- +赤蘚醇-----+---- -葡萄糖++++++++++ +肌醇 ++-------- -乳糖 ++++++++-+ +甘露醇++++++++++ +松三糖++++++---- -丙酮酸鹽 +-----+--- -鼠李糖+-++-++-++ +水揚(yáng)苷++++++++-+ +淀粉 +---++-+-- -海藻糖++++++-+++ +
表5B碳水化合物發(fā)酵測(cè)定細(xì)菌(分離物)碳水化合物底物1213141516171819202122核糖醇- - - - - - - - -阿拉伯糖 + - - + + + + - -半乳糖醇 - - - - - - - - -果糖 + - + + + + - - +甘油 + - + + - + - - -乳酸 - - + + - - - - +麥芽糖+ - + + + + + - +甘露糖+ - + + + + - - +蜜二糖+ - + + + + - - -蜜三糖+ - - + + + + - +核糖 + - + + + + - - +山梨醇+ - + + + + - - -蔗糖 + - + + + + + - +木糖 + - - + + + - - +苦杏仁苷 - - - + + - - - -纖維二糖 - - - + + - + - +赤蘚醇- - - - - - - - -葡萄糖+ - + + + + + - +肌醇 - - + + - + - - -乳糖 + - - + + + - - +甘露醇+ - + + - + - - +松三糖- - - + - - - - +丙酮酸鹽 - - - + - - - - +鼠李糖+ - - - + - - - +水揚(yáng)苷+ - + + + - + - -淀粉 - - - + + - - - +海藻糖+ - + + + + + - +
表5C碳水化合物發(fā)酵測(cè)定細(xì)菌(分離物)碳水化合物底物 23 24 25 26 27 28 29核糖醇------阿拉伯糖 -++---半乳糖醇 ------果糖 ++-+++甘油 --++--乳酸 -+----麥芽糖-+++-+甘露糖+--+--蜜二糖---+--蜜三糖-+++--核糖 ------山梨醇------蔗糖 -+++--木糖 +--+--苦杏仁苷 -+----纖維二糖 -+-+-+赤蘚醇------葡萄糖++++-+肌醇 ------乳糖 -+++-+甘露醇+-----松三糖------丙酮酸鹽 ------鼠李糖------水揚(yáng)苷-++---淀粉 ---+--海藻糖-++--+
表6API快速鏈球菌系統(tǒng)測(cè)定細(xì)菌(分離物)酶/底物 1 2 3 4 5 6 7 8 9Voges-Proskauer +/++/++/++/++/++/++/++/++/+馬尿酸鹽水解 -/-+/++/++/++/++/++/+-/--/-七葉苷水解 +/++/++/++/++/++/++/+-/+-/-吡咯烷酮基-2-萘胺+/++/++/++/++/++/++/++/+-/-α-半乳糖苷酶-/--/--/--/--/--/--/--/--/-β-葡萄糖醛酸酶 -/--/--/--/-+/+-/-+/+-/--/-β-半乳糖苷酶-/-+/++/++/++/+-/-+/+-/--/-堿性磷酸酶 -/--/--/--/+-/--/-+/+-/--/-亮氨酸芳基胺酶 +/+-/-+/+-/-+/++/++/++/++/+精氨酸二水解酶 +/++/++/++/++/+-/-+/+-/+-/-核糖 +/++/++/++/++/++/++/++/+-/-阿拉伯糖 -/--/-+/++/++/++/++/+-/--/-甘露醇 +/++/++/++/++/++/++/++/+-/-山梨醇 +/++/+-/--/--/-+/++/+-/--/-乳糖 -/--/-+/++/++/++/++/++/+-/-海藻糖 +/++/++/++/++/++/++/++/+-/-胰島素 -/--/--/--/--/--/--/--/--/-蜜三糖 -/--/--/--/-+/+-/-+/+-/--/-淀粉 +/++/++/+-/-+/+-/-+/++/+-/-糖原 -/--/--/--/--/--/--/--/--/-*重復(fù)1/重復(fù)2的數(shù)據(jù)表7API STAPH Trac系統(tǒng)測(cè)定細(xì)菌(分離物)酶/底物 1 2 3 4 5 6 7 8 9葡萄糖 +/++/0+/++/++/++/++/++/++/+果糖+/++/++/++/++/++/++/++/++/+甘露糖 +/++/++/++/++/++/++/++/++/+麥芽糖 +/++/++/++/++/++/++/++/++/+乳糖+/+-/-+/++/++/++/++/++/++/+海藻糖 +/++/++/++/++/++/++/++/++/+甘露醇 +/++/++/++/++/++/++/++/++/+木糖醇 -/--/--/--/--/-+/+-/--/-+/+蜜二糖 -/--/-+/++/++/++/++/+-/-+/+硝酸鹽還原 -/--/--/--/--/--/--/-+/+-/-堿性磷酸酶 +/+-/-+/+-/--/--/--/-+/++/+3-羥基丁酮生成 +/++/++/++/++/++/++/++/++/+蜜三糖 -/--/--/--/-+/++/++/+-/-+/+木糖-/--/--/--/-+/++/++/++/++/+蔗糖+/++/++/++/++/++/++/++/++/+α-甲基-葡萄糖苷+/+-/--/--/-+/++/++/+-/-+/+N-乙酰-葡萄糖苷 +/++/++/++/++/++/++/++/++/+精氨酸二水解酶 +/++/++/++/++/+-/-+/++/+-/-尿素酶 -/--/--/--/--/--/--/--/--/-*重復(fù)1/重復(fù)2的數(shù)據(jù)表8AAPI ZYM半定量酶系統(tǒng)測(cè)定細(xì)菌(分離物)酶分析 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10對(duì)照 0/00/00/00/00/00/00/00/00/00/0堿性磷酸酶0/01/0T/TT/T0/02/20/0T/T0/05/4(C4)酯酶 0/01/11/11/12/22/21/10/0T/T0/0酯酶脂酶(C8) 1/32/22/22/22/20/02/22/12/2T/T脂酶(C14) 0/00/00/00/0T/00/00/00/02/20/0亮氨酸氨肽酶 5/3T/11/10/00/00/01/12/33/31/1纈氨酸氨肽酶 0/00/00/00/00/00/00/00/02/2T/T胱氨酸氨肽酶 T/T0/00/00/00/00/00/0T/T1/1T/T胰蛋白酶 0/00/00/00/00/00/00/00/00/0T/T糜蛋白酶 0/10/00/00/02/20/0T/1T/T0/00/0酸性磷酸酶3/31/2T/T0/01/11/11/12/32/23/3磷酸水解酶2/22/21/13/31/11/12/22/22/23/3α-半乳糖苷酶 0/00/00/00/00/00/00/00/04/40/0β-半乳糖苷酶 0/0T/T0/00/00/00/01/11/13/32/3β-葡萄糖醛酸酶 0/00/00/00/00/00/00/01/10/00/0α-葡萄糖苷酶 4/42/30/00/00/00/02/23/30/00/0β-葡萄糖苷酶 4/30/02/21/12/10/0T/T2/20/00/0N-乙酰-β-葡糖胺酶1/10/00/00/00/00/00/01/10/00/0α-甘露糖苷酶 0/00/00/00/00/00/00/00/00/00/0α-巖藻糖苷酶 0/00/00/00/00/00/00/00/00/00/0半定量酶活力按如下方式記錄 0＝＜5nmol，T(痕量)＝＜5nmol，1＝5nmol，2＝10nmol，3＝20nmol，4＝30nmol，和5≥40nmol.*重復(fù)1/重復(fù)2的數(shù)據(jù)表8BAPI ZYM半定量酶系統(tǒng)測(cè)定 Enzyme System Tests細(xì)菌(分離物)酶分析11 12 13 14 15 16 17 18 19 20對(duì)照 0/00/00/00/00/00/00/00/00/00/0堿性磷酸酶5/53/22/23/32/33/30/00/00/05/5(C4)酯酶 1/10/03/33/30/00/01/10/00/01/1酯酶脂酶(C8) 1/10/04/33/30/0T/11/10/0T/01/1脂酶(C14) 1/T1/T3/32/30/00/00/00/00/00/0亮氨酸氨肽酶 3/45/54/44/44/40/00/00/00/00/0纈氨酸氨肽酶 1/12/32/22/21/10/00/00/00/00/0胱氨酸氨肽酶 T/T0/01/11/10/00/00/00/00/00/0胰蛋白酶 T/T2/22/22/20/00/00/00/00/00/0糜蛋白酶 T/T0/00/00/00/01/10/00/00/00/0酸性磷酸酶5/53/42/24/44/42/30/02/2T/T2/2磷酸水解酶4/33/31/12/24/32/21/12/2T/T2/2α-半乳糖苷酶 2/10/00/02/20/05/54/40/00/02/2β-半乳糖苷酶 4/43/30/04/32/22/35/50/03/33/3β-葡萄糖醛酸酶 1/10/00/01/1T/00/00/00/00/00/0α-葡萄糖苷酶 1/1T/T0/02/20/01/13/42/23/30/0β-葡萄糖苷酶 0/00/00/00/00/05/50/00/03/30/0N-乙酶-β-葡糖胺酶0/00/00/02/2T/03/30/00/00/05/5α-甘露糖苷酶 0/00/00/00/00/00/00/00/00/00/0α-巖藻糖苷酶 0/00/00/00/00/00/00/00/00/00/0
表8CAPI ZYM半定量酶系統(tǒng)測(cè)定細(xì)菌(分離物)酶分析21 22 23 24 25 26 27 28 29對(duì)照 0/00/00/00/00/00/00/00/00/0堿性磷酸酶0/00/00/00/05/5T/T5/50/00/0(C4)酯酶 T/T0/01/10/00/00/00/00/0T/T酯酶脂酶(C8) T/T1/11/1T/T0/00/01/10/01/T脂酶(C14) 0/00/00/00/00/00/00/00/00/0亮氨酸氨肽酶 0/00/00/00/00/00/0T/T0/00/0纈氨酸氨肽酶 0/00/00/00/00/00/00/00/00/0胱氨酸氨肽酶 0/00/00/00/00/00/00/00/00/0胰蛋白酶 0/00/00/00/00/00/00/00/00/0糜蛋白酶 0/00/00/00/00/00/00/00/00/0酸性磷酸酶0/0T/00/00/02/21/14/22/21/1磷酸水解酶1/11/11/12/21/11/15/32/12/2α-半乳糖苷酶 2/2T/02/10/00/00/04/20/01/Tβ-半乳糖苷酶 0/0T/00/00/00/00/04/20/00/0β-葡萄糖醛酸酶 0/00/00/00/00/00/05/30/00/0α-葡萄糖苷酶 0/03/21/T0/00/02/23/20/00/0β-葡萄糖苷酶 0/01/T1/T0/02/30/00/00/00/TN-乙酰-β-葡糖胺酶0/00/00/00/00/00/03/20/00/0α-甘露糖苷酶 0/00/00/00/00/00/00/00/00/0α-巖藻糖苷酶 0/01/T0/00/00/00/01/00/00/0
表9APresumpto平皿系統(tǒng)測(cè)定Presumtpo象限號(hào)細(xì)菌(分離物)平皿編號(hào) 瓊脂基質(zhì) 生長(zhǎng)能力/生化測(cè)定16 17 1819I 1 LD培養(yǎng)基 生長(zhǎng) ++++++ +吲哚 - - -2 LD-七葉苷生長(zhǎng) +++ + +++過氧化氫酶- - -七葉苷水解 +++ - -3 LD-卵黃 生長(zhǎng) +++ + +++卵磷脂酶 - - -脂酶 - - -蛋白水解 - - -4 LD-膽汁 生長(zhǎng) I I III 1 LD-DNA 生長(zhǎng) +++++++++脫氧核糖核酸酶+ - -2 LD-葡萄糖生長(zhǎng) +++++++++葡萄糖發(fā)酵+ + -3 LD-牛奶 生長(zhǎng) +++++++++酪蛋白水解- - -4 LD-淀粉 生長(zhǎng) +++++++++淀粉水解 - - -III 1 LD-甘露醇生長(zhǎng) +++++++++甘露醇發(fā)酵- + -2 LD-乳糖 生長(zhǎng) +++++++++乳糖發(fā)酵 + + -3 LD-鼠李糖生長(zhǎng) +++++++++鼠李糖發(fā)酵+ - -4 LD-明膠 生長(zhǎng) +++++++++明膠水解 - - -在LD-膽汁瓊脂上相當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)與LD瓊脂比較I＝很少生長(zhǎng)；和E＝相同生長(zhǎng)表9B Presumpto平皿系統(tǒng)測(cè)定Presumtpo象限號(hào)細(xì)菌(分離物)平皿編號(hào) 瓊脂基質(zhì) 生長(zhǎng)能力/生化測(cè)定20212223I 1 LD培養(yǎng)基 生長(zhǎng)吲哚2 LD-七葉苷生長(zhǎng)過氧化氫酶七葉苷水解3 LD-卵黃 生長(zhǎng)卵磷脂酶脂酶蛋白水解4 LD-膽汁 生長(zhǎng)II 1 LD-DNA 生長(zhǎng)脫氧核糖核酸酶2 LD-葡萄糖生長(zhǎng)葡萄糖發(fā)酵3 LD-牛奶 生長(zhǎng)酪蛋白水解4 LD-淀粉 生長(zhǎng)淀粉水解III 1 LD-甘露醇生長(zhǎng)甘露醇發(fā)酵2 LD-乳糖 生長(zhǎng)乳糖發(fā)酵3 LD-鼠李糖生長(zhǎng)鼠李糖發(fā)酵4 LD-明膠 生長(zhǎng)明膠水解表9CPresumpto平皿系統(tǒng)測(cè)定Presumtpo象限號(hào)細(xì)菌(分離物)平皿編號(hào) 瓊脂基質(zhì) 生長(zhǎng)能力/生化測(cè)定24252627I 1 LD培養(yǎng)基 生長(zhǎng)吲哚2 LD-七葉苷生長(zhǎng)過氧化氫酶七葉苷水解3 LD-卵黃 生長(zhǎng)卵磷脂酶脂酶蛋白水解4 LD-膽汁 生長(zhǎng)II 1 LD-DNA 生長(zhǎng)脫氧核糖核酸酶2 LD-葡萄糖生長(zhǎng)葡萄糖發(fā)酵3 LD-牛奶 生長(zhǎng)酪蛋白水解4 LD-淀粉 生長(zhǎng)淀粉水解III 1 LD-甘露醇生長(zhǎng)甘露醇發(fā)酵2 LD-乳糖 生長(zhǎng)乳糖發(fā)酵3 LD-鼠李糖生長(zhǎng)鼠李糖發(fā)酵4 LD-明膠 生長(zhǎng)明膠水解表9DPresumpto平皿系統(tǒng)測(cè)定Presumtpo象限號(hào)細(xì)菌(分離物)平皿編號(hào) 瓊脂基質(zhì) 生長(zhǎng)能力/生化測(cè)定2829I 1 LD培養(yǎng)基 生長(zhǎng) +++吲哚 -2 LD-七葉苷生長(zhǎng) +++過氧化氫酶-七葉苷水解-3 LD-卵黃 生長(zhǎng) +++卵磷脂酶 -脂酶 -蛋白水解 -4 LD-膽汁 生長(zhǎng) EII 1 LD-DNA 生長(zhǎng) +++脫氧核糖核酸酶-2 LD-葡萄糖生長(zhǎng) +++葡萄糖發(fā)酵-3 LD-牛奶 生長(zhǎng) +++酪蛋白水解-4 LD-淀粉 生長(zhǎng) +++淀粉水解 -III 1 LD-甘露醇生長(zhǎng) +++甘露醇發(fā)酵-2 LD-乳糖 生長(zhǎng) +++乳糖發(fā)酵 -3 LD-鼠李糖生長(zhǎng) +++鼠李糖發(fā)酵-4 LD-明膠 生長(zhǎng) +++明膠水解 +
表10A抗菌劑敏感性測(cè)定細(xì)菌(分離物)抗菌劑1 2 3 4 5 6 7 8 9 10丁胺卡那霉素 R S S S S S S S S S氨芐青霉素S S S S S S S S S奧格門丁 S S S R R S S桿菌肽R R R R R S R S S R羧芐青霉素S S S R S R S R S S頭孢菌素IIS R S R R S R S S S頭孢菌素I S S R R S S S S S S氯霉素S S S S S S S S S S氯四環(huán)素 R R S S S S R S S S氯林可霉素R R R R R R R S S R鄰氯青霉素R R R R R R R R R R紅霉素R R S S S S R S S S慶大霉素 S S S S S S S S S S卡那霉素 R R R R S R R S S S林可霉素 R R R R R R R R S R甲氧苯青霉素 R R R R R S R S R R萘啶酮酸 R R R R R R R R R S新霉素S S S S S S R S S S呋喃妥英 S S S S S S S S S新生霉素 R R R S S S R S青霉素R R R R S S S R S R多粘菌素B R R R R R R R R R S利福平S S S S S S S S S S鏈霉素R R R R S R R R S S磺胺嘧啶 R R R R R R R R S S三甲氧芐氨嘧啶R S R R R R S R S S四環(huán)素R S S S S S R S S S萬古霉素 S S S S S S S S R RS＝敏感的，R＝抗性的表10B抗菌劑敏感性測(cè)定細(xì)菌(分離物)抗菌劑11121314151617181920丁胺卡那霉素 S S S S S R S R R R氨芐青霉素R S R S S奧格門丁 S S R S S S S桿菌肽R R R R R R R R R R羧芐青霉素S S S S S S S S S S頭孢菌素IIR S R R R R S S S S頭孢菌素I R S R R S R S S S S氯霉素S S S S S S S S S S氯四環(huán)素 S S S S S S R R R氯林可霉素R R R R R S S S S S鄰氯青霉素R R R R R R R R R R紅霉素R S S R S S S R R R慶大霉素 S S S S S R S R R R卡那霉素 S S S S S R S R R R林可霉素 R R R R R R S R R R甲氧苯青霉素 R R R R R R R R R R萘啶酮酸 S S S S S R S R R R新霉素S S S S S R S R R R呋喃妥英 S S R S S新生霉素 R S S青霉素R R R R R R R S S S多粘菌素B S S S R S R S R R R利福平R S S S R S S S S S鏈霉素S S S S S R S R R R磺胺嘧啶 S S S S S S R R R R三甲氧芐氨嘧啶S S R S R R R R R R四環(huán)素S S S S S S R R R萬古霉素 R R R R R S S S S
表10C抗菌劑敏感性測(cè)定細(xì)菌(分離物)抗菌劑 212223242526272829丁胺卡那霉素R R R R R R R S S氨芐青霉素奧格門丁S S S S S S S S S桿菌肽 R R R R R R R R R羧芐青霉素 S S S S S S S S S頭孢菌素II S S S S S S S S S頭孢菌素I S S S S S S S S S氯霉素 S S S S S S S S S氯四環(huán)素R R R R R R R S S氯林可霉素 S S S S S S S S S鄰氯青霉素 R R R R R R R R R紅霉素 R R R R R R R S S慶大霉素R R R R R R R S S卡那霉素R R R R R R R S S林可霉素R R R R R R R S S甲氧苯青霉素R R R R R R R R R萘啶酮酸R R R R R R R S S新霉素 R R R R R R R S S呋喃妥英新生霉素青霉素 S S S S S S S R R多粘菌素B R R R R R R R S S利福平 S S S S S S S S S鏈霉素 R R R R R R R S S磺胺嘧啶R R R R R R R R R三甲氧芐氨嘧啶 R R R R R R R R R四環(huán)素 R R R R R R R S S萬古霉素S S S S S S S R R
表11 盲腸細(xì)菌特性培養(yǎng)物的處理對(duì)3日齡和10日齡焙烤用雛雞的盲腸內(nèi)容物中丙酸濃度的影響1。
試驗(yàn)2 試驗(yàn)3 試驗(yàn)4組 第3天第10天 第3天 第10天 第3天第10天對(duì)照組 .61±.58 1.82±.61 .68±.602.46±.93 .54±.582.67±0.88處理組21.28±15.75*27.64±10.15*16.85±8.14*27.01±9.48*20.73±10.78*47.75±12.4*1數(shù)值為10只雛雞的均值±SD和mmol/g盲腸內(nèi)容物。*與對(duì)照組比顯著性差異(p＜0.005)
表12 盲腸細(xì)菌特性培養(yǎng)物的處理對(duì)3日齡和10日齡焙烤用雛雞的盲腸內(nèi)容物中總揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響1。
試驗(yàn)2試驗(yàn)3 試驗(yàn)4組 第3天第3天 第3天 第10天 第10天 第10天對(duì)照組 9.03±2.30 73.01±6.43 14.03±6.75 52.87±16.98 16.66±2.71 71.95±16.25處理組14.75±5.80** 80.84±20.6945.60±8.05**69.14±23.04*50.67±22.59**107.03±28.63*1數(shù)值為10只雛雞的均值±SD和mmol/g盲腸內(nèi)容物。*與對(duì)照組比顯著性差異(p＜0.005)表13 盲腸細(xì)菌特性培養(yǎng)物的處理對(duì)10日齡焙烤用雛雞的盲腸內(nèi)容物中鼠傷寒沙門菌數(shù)目的影響1。
每克盲腸內(nèi)容物中沙門氏菌log10值組試驗(yàn)1 試驗(yàn)2 試驗(yàn)3 試驗(yàn)4對(duì)照組6.35±0.9916.28±0.53 4.11±2.15 6.37±0.60處理組 0±0*0.89±1.50*0.27±0.69*0.60±0.75*1數(shù)據(jù)表示為20只雛雞的X±SD.*與對(duì)照組比顯著性差異(p＜0.005)表14 盲腸細(xì)菌特性培養(yǎng)物的處理對(duì)10日齡烤肉用雛雞盲腸培養(yǎng)呈鼠傷寒沙門氏菌陽(yáng)性的數(shù)目的影響1。
沙門氏菌培養(yǎng)呈陽(yáng)性雛雞/雛雞總數(shù) (％)組試驗(yàn)1 試驗(yàn)2 試驗(yàn)3 試驗(yàn)4對(duì)照組20/20(100) 20/20(100) 18/20(90) 20/20(100)處理組 0/20(0)* 7/20(35)* 3/20(15)* 8/20(40)**與對(duì)照組比顯性差異(p＜0.01)1數(shù)值為10只雛雞的均值±SD和mmol/g盲腸內(nèi)容物。*與對(duì)照組比顯著性差異(p＜0.005)1數(shù)值為10只雛雞的均值±SD和mmol/g盲腸內(nèi)容物。*與對(duì)照組比顯著性差異*＝(p＜0.005)；**＝(p＜0.01)
權(quán)利要求
1.一種抑制禽類沙門氏菌移生的組合物，包括生物學(xué)基本純化的細(xì)菌種群，所述的細(xì)菌基本包括下列所有的細(xì)菌I.兼性厭氧菌，革蘭氏陽(yáng)性球菌(1)第一糞腸球菌菌株，(2)第二糞腸球菌菌株，(3)第一faecium腸球菌菌株，(4)第二faecium腸球菌菌株，(5)第三faecium腸球菌菌株，(6)avium腸球菌，(7)第三糞腸球菌菌株，II.兼性厭氧菌，革蘭氏陽(yáng)性球桿菌(8)lactis乳酸球菌，(9)第一乳酸桿菌菌株，III.兼性厭氧菌，革蘭氏陰性桿菌(10)第一大腸桿菌菌株，(11)弗氏檸檬酸菌，(12)一種屬于腸桿菌科的細(xì)菌，(13)一種假單胞菌屬的菌種，(14)液化沙雷氏菌，(15)第二大腸桿菌菌株，IV.專性厭氧菌，革蘭氏陽(yáng)性桿菌(16)第一丙酸桿菌的菌種，(17)第二丙酸桿菌的菌種，(18)第二乳酸桿菌的菌株，(19)第一雙歧桿菌的菌株或第三乳酸桿菌的菌株，(20)第三丙酸桿菌的菌株，(21)第一真細(xì)菌的菌株，(22)第二真細(xì)菌的菌株，(23)一種標(biāo)為OAGPB-5的未知細(xì)菌菌株，(24)第三真細(xì)菌的菌株，(25)第二雙歧桿菌的菌株或第四乳酸桿菌的菌株，(26)第三雙歧桿菌的菌株或第五乳酸桿菌的菌株，(27)第四丙酸桿菌的菌株，V.專性厭氧菌，革蘭氏陰性球菌(28)一種韋永球菌的菌種，和VI.專性厭氧菌，革蘭氏陰性桿菌(29)一種梭形桿菌屬菌種。
2.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包括ATCC保存號(hào)55515的細(xì)菌，和/或所述組合物包括26種所述的細(xì)菌，和/或所述組合物包括27種所述的細(xì)菌，和/或所述組合物包括28種所述的細(xì)菌，和/或所述組合物包括所有的所述細(xì)菌，和/或所述組合物進(jìn)一步包括乳糖，和/或所述組合物進(jìn)一步包括無抗革蘭氏陽(yáng)性菌活性的抑球蟲劑，和/或所述組合物進(jìn)一步包括載體，和/或所述組成的所述細(xì)菌制成膠囊。
3.一種飼料產(chǎn)品，它包含與權(quán)利要求1中所述組合物相結(jié)合的動(dòng)物飼料。
4.一種抑制禽類沙門氏菌移生的方法，包括給禽類施用一種組合物，所述組合物包括生物學(xué)基本純化的細(xì)菌的種群，所述細(xì)菌包括基本上下列所有的I.兼性厭氧菌，革蘭氏陽(yáng)性球菌(1)第一糞腸球菌的菌株，(2)第二糞腸球菌的菌株，(3)第一faecium腸球菌的菌株，(4)第二faecium腸球菌的菌株，(5)第三faecium腸球菌的菌株，(6)avium腸球菌，(7)第三糞腸球菌的菌株，II.兼性厭氧菌，革蘭氏陽(yáng)性球桿菌(8)lactis乳酸球菌，(9)第一乳酸桿菌的菌株，III.兼性厭氧菌，革蘭氏陰性桿菌(10)第一大腸桿菌的菌株，(11)弗氏檸檬酸菌，(12)一種屬于腸桿菌科的細(xì)菌，(13)一種假單胞菌屬的菌種，(14)液化沙雷氏菌，(15)第二大腸桿菌的菌株，IV.專性厭氧菌，革蘭氏陽(yáng)性桿菌(16)第一丙酸桿菌種的菌種，(17)第二丙酸桿菌的菌種，(18)第二乳酸桿菌的菌株，(19)第一雙歧桿菌的菌株或第三乳酸桿菌的菌株，(20)第三丙酸桿菌的菌株，(21)第一真細(xì)菌的菌株，(22)第二真細(xì)菌的菌株，(23)一種標(biāo)為OAGPB-5的未知細(xì)菌菌株，(24)第三真細(xì)菌的菌株，(25)第二雙歧桿菌的菌株或第四乳酸桿菌的菌株，(26)第三雙歧桿菌的菌株或第五乳酸桿菌的菌株，(27)第四丙酸桿菌的菌株，V.專性厭氧菌，革蘭氏陰性球菌(28)一種韋永球菌的菌株，VI.專性厭氧菌，革蘭氏陰性桿菌(29)一種梭形桿菌的菌株。其中所述組合物以抑制沙門氏菌在所述禽類腸道中的移生有效的劑量施用。
5.權(quán)利要求4中所述的方法，其中所述組合物包括ATCC保存號(hào)55515的細(xì)菌，和/或所述組合物包括26種所述的細(xì)菌，和/或所述組合物包括27種所述的細(xì)菌，和/或所述組合物包括28種所述的細(xì)菌，和/或所述組合物包括所有的所述細(xì)菌。
6.權(quán)利要求4中所述的方法，其中所述的禽類為家禽。
7.權(quán)利要求6中所述的方法，其中所述的家禽選自包括雞、火雞、鴨、鵪鶉和鵝的一組動(dòng)物，和/或其中所述的家禽小于約14日齡。
8.權(quán)利要求4中所述的方法，進(jìn)一步包括給所述的禽類施用乳糖，和/或施用對(duì)抗革蘭氏陽(yáng)性菌基本無活性的抑球蟲劑。
9.權(quán)利要求4中所述的方法，其中所述的細(xì)菌種群與載體一起施用，和/或其中所述的細(xì)菌被膠囊化。
10.權(quán)利要求4中所述的方法，其中施用的步驟包括口服該細(xì)菌種群至所述家禽中，優(yōu)選與家禽的飼料和/或飲水結(jié)合，和/或?qū)⒃摷?xì)菌種群噴灑在所述家禽上，和/或?qū)⒃摷?xì)菌種群與家禽的泄殖腔接觸。
11.一種用于分離可有效用于抑制沙門氏菌在家養(yǎng)動(dòng)物中移生的利生菌的方法，包括(a)將成年家養(yǎng)動(dòng)物的糞便、盲腸內(nèi)容物或大腸內(nèi)容物接種至培養(yǎng)基中，并在無氧條件下以成批培養(yǎng)的形式溫育，以提供一種中間培養(yǎng)物，(b)將該中間培養(yǎng)物以連續(xù)培養(yǎng)形式溫育，并在周轉(zhuǎn)率約為0.029至0.10小時(shí)-1，pH約為4.7至6.5和無氧條件下連續(xù)溫育充足的時(shí)間以建立穩(wěn)態(tài)，和(c)從步驟(b)中回收穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物。
12.權(quán)利要求11中所述的方法，進(jìn)一步包括(d)篩選從(c)中回收的穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物對(duì)沙門氏菌在所述家養(yǎng)動(dòng)物中移生的抑制作用。
13.權(quán)利要求11中所述的方法，其中所述的家畜為家養(yǎng)動(dòng)物為家禽。
14.權(quán)利要求11中所述的方法，其中所述成批培養(yǎng)的溫育步驟持續(xù)6-18小時(shí)，和/或所述成批培養(yǎng)在pH5.5左右維持，和/或所述成批培養(yǎng)的溫育步驟持續(xù)直至光密度達(dá)到至少1.0左右，和/或所述成批培養(yǎng)的溫育步驟在pH達(dá)到約4.2后，只繼續(xù)不超過2小時(shí)左右，和/或在所述連續(xù)培養(yǎng)中周轉(zhuǎn)率為約0.0416小時(shí)-1并且所述pH約5.5，和/或所述成批培養(yǎng)的pH值不低于4.2，和/或所述成批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)的溫度約在26℃至47℃之間。
15.權(quán)利要求11中所述的方法，其中所述培養(yǎng)基含有乳糖。
16.權(quán)利要求12中所述的方法，其中篩選步驟包括(1)提供受試的家養(yǎng)動(dòng)物并給其施用取自(c)的穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物；(2)提供未經(jīng)處理的對(duì)照動(dòng)物；(3)飼養(yǎng)受試和對(duì)照動(dòng)物2-3天；(4)測(cè)定受試和對(duì)照動(dòng)物盲腸內(nèi)容物中丙酸和總揮發(fā)性脂肪酸的濃度；(5)比較受試動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物中丙酸濃度和總揮發(fā)性脂肪酸濃度；其中所述的穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物被確定可有效用于抑制沙門氏菌在家養(yǎng)動(dòng)物中的移生，條件是當(dāng)(1)受試動(dòng)物中丙酸的濃度超過或等于約10mmol/g盲腸內(nèi)容物時(shí)，和/或(2)受試動(dòng)物總揮發(fā)性脂肪酸濃度超過對(duì)照動(dòng)物約100％或更多時(shí)。
17.權(quán)利要求16中所述的方法，其中總揮發(fā)性脂肪酸濃度包括乙酸加丙酸加丁酸加異丁酸加戊酸加異戊酸的濃度。
18.通過權(quán)利要求12方法產(chǎn)生的利生菌。
19.一種方法，它用于篩選可作為利生菌用于有效抑制沙門氏菌在家養(yǎng)動(dòng)物中的移生的細(xì)菌組合物，包括(a)提供受試的家養(yǎng)動(dòng)物和給其施用待試細(xì)菌組合物；(b)提供未經(jīng)處理的對(duì)照動(dòng)物，(c)飼養(yǎng)受試和對(duì)照動(dòng)物2-3天，(d)測(cè)定受試和對(duì)照動(dòng)物盲腸內(nèi)容物中丙酸和總揮發(fā)性脂肪酸的濃度；并且(e)比較受試和對(duì)照動(dòng)物中丙酸濃度和總揮發(fā)性脂肪酸濃度；其中所述的細(xì)菌組合物被確定可有效用于抑制沙門氏菌在家養(yǎng)動(dòng)物中的移生，條件是當(dāng)(1)受試動(dòng)物中丙酸的濃度超過或等于約10mmol/g盲腸內(nèi)容物時(shí)，和(或)(2)受試動(dòng)物總揮發(fā)性脂肪酸濃度超過對(duì)照動(dòng)物約100％或更多時(shí)。
20.權(quán)利要求19中所述的方法，其中總揮發(fā)性脂肪酸濃度包括乙酸加丙酸加丁酸加異丁酸加戊酸加異戊酸的濃度。
21.權(quán)利要求19中所述的方法，其中所述的動(dòng)物為家禽。
22.一種細(xì)菌組合物，它可有效地抑制通過權(quán)利要求19方法產(chǎn)生的家養(yǎng)動(dòng)物的沙門氏菌的移生。
全文摘要
一種限定性利生菌或厭氧菌組合物可有效用于控制或抑制家禽沙門氏菌的移生。該利生菌包括29種生物學(xué)上基本純的細(xì)菌的種群或培養(yǎng)物。在使用中，可給受試家禽施用有效量的利生菌以提高家禽對(duì)沙門氏菌移生的抗性。本發(fā)明還涉及一種從成年動(dòng)物糞便、盲腸內(nèi)容物或大腸中分離利生菌的新方法，以用于有效控制或抑制沙門氏菌在家畜中的移生，將糞便、盲腸內(nèi)容物或大腸與培養(yǎng)基結(jié)合，并在無氧條件下進(jìn)行不稀釋溫育(即成批培養(yǎng))。緊接著這一初步溫育，所得培養(yǎng)物在連續(xù)流動(dòng)條件下溫育直至達(dá)到一種穩(wěn)態(tài)，在這以后的時(shí)間里，穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物可以回收作為利生菌使用。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1142773SQ94194949
公開日1997年2月12日 申請(qǐng)日期1994年12月13日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月13日
發(fā)明者D·J·尼斯貝特, D·E·科里埃, J·B·迪羅阿希 申請(qǐng)人:美國(guó)政府農(nóng)業(yè)部