專利名稱：At－1受體拮抗劑在治療與at－1受體增加有關(guān)的疾病中的應用的制作方法
血管緊張肽原是一種α2-巨糖蛋白(macroglycoprotein)，經(jīng)血管緊張肽原酶酶切后產(chǎn)生十肽血管緊張肽I，該物質(zhì)本身僅具有很弱的生物活性。在該級聯(lián)反應的下一步，通過主要存在于內(nèi)皮中的血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶(ACE)的作用又切下兩個氨基酸，形成血管緊張肽II。后者被認為是最強的天然血管收縮劑之一。
血管緊張肽II與靶細胞表面的特異受體相互作用。目前，已成功鑒定了例如稱為AT1受體和AT2受體的受體亞型。對血管緊張肽原酶-血管緊張肽系統(tǒng)，尤其是涉及高血壓的該系統(tǒng)的研究，在過去的十年中幾乎以指數(shù)形式增加。結(jié)果，目前已經(jīng)鑒定了許多血管緊張肽II受體，而且其中一些已經(jīng)被克隆并分析。近來，有相當多的工作致力于鑒定能和AT1受體結(jié)合的物質(zhì)，具有這種性質(zhì)的活性化合物常被稱為血管緊張肽II的拮抗劑。由于抑制AT1受體，這些拮抗劑可以例如用作抗高血壓劑或用來治療充血性心力衰竭。
對AT1和AT2受體的分布和生物特性也已有研究，顯示盡管有30％的同源性，但這兩者在分布和活性方面都大不相同。
AT1受體在血壓調(diào)節(jié)中起重要作用，已知存在于腎上腺皮質(zhì)、腎、子宮等中。在細胞水平，已發(fā)現(xiàn)它存在于成纖維母細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞(SMC)上。
相反，AT2受體主要存在于胎兒組織中，但在成人尤其是病理組織如缺血性心臟病中也有。在此，它主要位于成纖維細胞和內(nèi)皮細胞上。
下述研究的目的在于主要利用免疫細胞化學和原位雜交的方法評估AT1和AT2受體在人肺中的分布。
以前已研制出針對AT1受體抗原決定簇的特異抗體，但針對AT2受體的這種特異工具還沒有得到。因此，組織學研究依靠放射性標記的受體拮抗劑及放射自顯影，這只能給出一個相對粗略的組織定位。然而過去的兩年中，針對人類受體的已良好表征的特異抗體已經(jīng)出現(xiàn)，并被應用于下文所依賴的研究中。
方法和材料1.抗體和原位雜交(ISH)探針的特異性及滴定為了證實免疫細胞化學(ICC)和ISH研究的特異性，我們從病理學系，University Hospital，Ghent，比利時的檔案室獲得了正常人體腎上腺(皮質(zhì)和髓質(zhì))的石蠟包埋塊，并將其作為實驗材料。已知AT1受體主要存在于腎上腺皮質(zhì)而AT2主要存在于髓質(zhì)。
對于人肺研究，對照材料來自死于肺部疾病之外的原因(如致命性事故)的患者的尸體解剖。這些材料一部分來自上面提到的Ghent，另外一些來自美國費城Pennsylvania Hospital的病理部檔案室。我們選擇含有小氣道(airway)的組織作為研究對象，因為它們對損傷更為敏感。
將所有樣品在死亡后盡可能快地于10％的緩沖福爾馬林中固定，脫水并包埋入石蠟中。將其切成3-5微米厚的切片并貼放在硅烷化的玻片上。
為使操作過程中的任何偏差達到最小，每個玻片上貼放一對連續(xù)切片，一個暴露于AT1抗體，另一個暴露于AT2抗體。同時處理多達20塊玻片，這樣，除了一抗外所有試劑包括色素原都相同。因此，切片厚度是唯一不能被完全控制的變量。
2.抗體兩個針對AT1受體的抗體來自Santa Cruz公司，San Diego，CA，美國(克隆N10和306)，對它們進行檢測后發(fā)現(xiàn)它們給出相同的腎上腺皮質(zhì)受體分布。
本研究的主要部分是利用抗AT2受體的抗體來完成的，該抗體也來自Santa Cruz公司(克隆C18)。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，與第一個一樣，它在腎上腺髓質(zhì)及肺部給出相同的染色模式。
所有抗體的特異性和交叉反應性都經(jīng)過商家和個人提供者的嚴格檢測。
3.ISH探針按如下所述制備和使用PCR(聚合酶鏈式反應)產(chǎn)物利用Oligo5.0軟件，針對人血管緊張肽II的I型受體(GenBank登記號(accession number)M93394)和血管緊張肽II的II型受體(GenBank登記號U15592)兩序列的同源區(qū)(表1)，設(shè)計對這兩者特異的寡核苷酸。用標準方法從人骨組織制備cDNA(Sambrook J，F(xiàn)ritschEF，Maniatis T.分子克隆實驗手冊(Molecular Cloninga LaboratoryManual)，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989)。用以下寡核苷酸引物對進行PCR血管緊張肽II的I型受體5’-CTggCTgACTTATgCTTTTTACTgACT-3’和5’-gATgCAggTgACTTTggCTACA-3’(PCR產(chǎn)物長236個堿基對)；血管緊張肽II的II型受體5’-ATTTACTCCTTTTggCTACTCTTCCTC-3’及5’ggTCACgggTTATCCTgTTCTTC-3’(PCR產(chǎn)物長489個堿基對)。以10ng cDNA為模板在MJ Research PCRCycle儀器上使用如下PCR循環(huán)進行PCR擴增1)94℃/2分鐘，2)94℃/10秒；60℃/30秒；72℃/15秒，35個循環(huán)。該PCR擴增使用高保真Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)以及廠商試劑盒中提供的成分進行。PCR擴增產(chǎn)物通過0.8％的瓊脂糖/TBE凝膠電泳來鑒定(Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Maniatis T.分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版，冷泉港，紐約，1989)。為了證實PCR擴增產(chǎn)物的身份，從膠中洗脫DNA，并克隆到A/T克隆載體pMOSBlue中(Amersham)。對含有正確大小的DNA插入片段的菌落(表1)進行雙鏈完全測序以驗證其身份。
每個探針，包括AT1的正義、反義探針及上述僅為反義的探針都用熒光素(FITC)標記，并按以下程序檢測細胞中mRNA的存在首先用探針雜交，而后用鼠抗FITC探針和堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶(APAAP)檢測系統(tǒng)檢測。這種標記技術(shù)增強了對極低拷貝數(shù)的檢測。
4.免疫細胞化學對于所有抗體，操作程序如下。首先用抗原重獲技術(shù)(antigenretrieval technique)以及微波處理(microwaving)在檸檬酸緩沖液(PH6.0)中處理5μm切片。
作用20分鐘之后使切片在該緩沖液中冷卻。當抗體為羊多克隆抗體時，使用過氧化物酶抗過氧化物酶(PAP)法，以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作為色素原。對于兔多克隆抗體，則改用APAAP系統(tǒng)以及新品紅。首先用1％牛血清白蛋白(BSA)封閉切片30分鐘以封閉非特異受體，之后在室溫將其與一抗共同孵育30分鐘。每種抗體都經(jīng)過滴度測定，其最佳稀釋如下
作為陰性對照，對于兔多克隆抗體，使用DaKo(Prosan，Ghent，比利時)的陰性血清，對于羊多克隆抗體則省略掉一抗。
ISH采用已成熟技術(shù)對5μm切片作脫石蠟處理，之后用于原位雜交。切片首先用預雜交液55℃處理20分鐘。洗滌后，將其暴露于探針中55℃過夜。再次洗滌后，用鼠抗FITC抗體及APAAP檢測系統(tǒng)處理切片以定位特異信息。對于AT1受體，有義探針是陰性對照，對于AT2受體，則省略掉探針。
圖像分析為了定量測量染色強度，在Leica MR500中觀察玻片，并按Leica的說明書將單位面積組織上的著色量以象素的形式記錄。這樣即可確定不同區(qū)域中AT1受體與AT2受體的比例，這些區(qū)域是a)氣道上皮，b)上皮下間質(zhì)(sub-epithelial interstium)，c)血管周圍的平滑肌和d)粘液腺。
結(jié)果腎上腺分布研究AT1的分布兩個抗體在腎上腺皮質(zhì)中都給出以下的分布模式，即正如預期的一樣，在圍繞血管的平滑肌細胞四周以及在成纖維細胞周圍和之上的間質(zhì)網(wǎng)(interstitial network)上有獨特染色。內(nèi)皮細胞上沒有染色。
AT2的分布用抗體檢測腎上腺髓質(zhì)時觀察到腎上腺噬鉻細胞瘤細胞呈強烈染色。
ISH兩個反義探針均給出類似圖象。
對照肺AT1分布觀察到氣道上皮下(上皮下)的間質(zhì)細胞以及圍繞血管的平滑肌細胞(SMC)邊緣有很清晰的染色。此外巨噬細胞也呈陽性。
AT2分布這種受體看來與氣道上皮細胞密切相關(guān)，在刷狀緣呈現(xiàn)濃密的著色。在一些粘液腺中，一些血管內(nèi)皮細胞上以及成纖維細胞、軟骨細胞、巨噬細胞上也觀察到陽性細胞。平滑肌細胞沒有染色。
ISH探針仍然給出類似的圖象。特別地AT2探針僅在內(nèi)皮細胞和一些粘液腺上產(chǎn)生強信號。
圖像分析通過染色強度表示的蛋白質(zhì)即受體分布，也就是每平方微米組織上的象素值列于下表
先前通過生物化學和組織學的方法已經(jīng)闡明了在腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)中存在血管緊張肽II受體。用商家和私人提供的抗體均得到這些數(shù)據(jù)，這不僅證實了這些發(fā)現(xiàn)，而且確立了本申請的免疫細胞化學和ISH方法學的可靠性。
鑒于這些研究的結(jié)果，為了確定AT1和AT2的特異分布以及兩者的比例，有必要比較正常和患病肺組織中AT1和AT2受體的分布。
以前通過生化的方法已經(jīng)顯示肺部有AT1受體存在，現(xiàn)在已闡明它們的精確細胞定位。該信息對于確立肺的不同區(qū)域在正常和病理條件下AT1受體與AT2受體的比例是至關(guān)重要的。
關(guān)于分布，尤其是AT2受體的分布的資料是嶄新的，因為在此之前沒有有關(guān)它們存在或分布的資料。從本研究產(chǎn)生了幾個要點。
首先，在小氣道的支氣管上皮細胞上AT2受體的存在。已知該受體被認為是抗纖維化、抗增生和促進凋亡的。因而上皮細胞上該受體的上調(diào)或下調(diào)對上皮細胞的更替、增生的產(chǎn)生有深遠的影響，甚至在肺癌的發(fā)生中起作用。
第二，上皮細胞刷狀緣上有相當數(shù)量的該蛋白存在，這很可能與粘液分泌的量相關(guān)，因為已經(jīng)顯示一些粘液腺上皮細胞也攜帶該受體。從ISH數(shù)據(jù)看，一些腺體含有高水平的mRNA。
最后，免疫細胞化學和原位雜交現(xiàn)在均已證實血管內(nèi)皮細胞上存在AT2受體。已發(fā)現(xiàn)其發(fā)布既不常見也不是在某一特定血管的所有細胞上都存在。
這些研究確證和擴展了關(guān)于血管緊張肽II AT1和AT2型在人肺中存在和分布的現(xiàn)有資料。小氣道上皮細胞上AT2受體的存在對于理解因這些細胞功能改變而導致的疾病有相當?shù)闹匾浴?br> 對AT受體在人肺中的定位，它們在正常和患病肺組織中的分布、上調(diào)或下調(diào)以及兩者的比例，所知甚少。對于本研究，樣品收集自正常肺和患有慢性阻塞性肺疾病(COPD)±高血壓的患者。
肺樣品這些樣品來自以下全部由臨床上定義的患者組。
NN(n＝3)-不吸煙者，正常組織C (n＝5)-吸煙者，但其它正常COPD (n＝8)-COPD陽性，正常BPCOPD/H(n＝3)-COPD加高血壓H (n＝4)-具有提高的BP的吸煙者因腫瘤或其它原因從患者取出肺后，立即從該肺細心分離出氣道。仔細選擇該區(qū)域以避免混入任何癌組織。將該小組織塊在4％的多聚甲醛中室溫固定2小時，而后在石蠟中包埋。這樣做是為了確保最佳的結(jié)構(gòu)完整性和抗原活性保持。
確立受體定位的方法a)免疫細胞化學法(ICC)。檢測2個AT1抗體，Santa Cruz(克隆N-10和306)。還檢測1個AT2抗體，Santa Cruz(克隆C18)。
數(shù)字圖像顯示AT2抗體在支氣管上皮細胞包括刷狀緣中以及粘液腺細胞上的分布。
對AT1受體進行染色的鄰近切片，其顯示在平滑肌細胞、成纖維細胞/基質(zhì)和巨噬細胞上的十分不同的分布。
對人患者肺的分析至今為止得到所有材料均被切片并通過ICC染色，加上適當?shù)年幮詫φ沼茫源_定AT1和AT2受體的定位。圖像分析始于從至今為止的每一位患者的一張切片上得到的讀數(shù)(這是一個緩慢的過程，因為必須嚴格地維持基線)。測量包括上皮對上皮下和血管。該分析采用“雙盲”方式進行，使得除了某些“患者”明顯地極為偏離平均水平這個事實外，不可能有其它評價。通過對連續(xù)切片同時進行AT1和AT2的ICC分析，使因切片厚度和染色的變化造成的差異降至最低。因此，也可以使用同一批色素原。
AT2受體的肺上皮定位這一發(fā)現(xiàn)有了許多后果。由于研究已經(jīng)顯示AT2受體抗增生、抗纖維化和促進凋亡，所以該受體的上調(diào)預計會影響許多肺疾??；例如，對單單吸煙的任何影響。這在纖維化疾病如成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)中起作用，而且甚至在肺癌中起到降低上皮增生能力的作用。
結(jié)果受體定位所有的受體和核酸探針(riboprobes)都在正常腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)上進行過測試，已知這些部位中這兩種受體的含量相對豐富。
在正常的肺組織中重復該過程，在其中我們能檢測到AT1和AT2受體以及它們的mRNA。定位如下AT1-定位于平滑肌細胞、成纖維細胞/基質(zhì)、巨噬細胞上。這是完全可預見到的，除了在正常肺中受體的強度和數(shù)量非常高。
AT2-定位在支氣管上皮細胞(尤其是刷狀緣)、(一些)粘液腺上。此外，還定位在血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞和軟骨細胞上。
這是一個完全出乎意料的新發(fā)現(xiàn)，需要進一步的研究。蛋白和mRNA含量均證實了在上皮細胞和粘液腺上的定位，而在刷狀緣上的定位與粘液分泌有關(guān)。
血管緊張肽AT1和AT2在慢性支氣管炎患者及對照的肺部中的分布
Leica儀器(圖象分析儀MR500)將染色強度轉(zhuǎn)變?yōu)榛叶鹊燃?0-250)，一個單位即一個象素。這使人們可以對數(shù)據(jù)進行精確定量。
這些數(shù)據(jù)以患者的圖象分析為基礎(chǔ)。數(shù)據(jù)用單位面積陽性染色組織上的象素值以及每張玻片上的5個區(qū)域的平均值來表示。
從這些結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，正常肺組織中上皮下的AT1分布與上皮中的AT2分布的比值顯著低于1，而在患病肺組織中該比值接近或高于1。上皮組織構(gòu)成了氣管和大支氣管的內(nèi)襯。與對照相比，慢性支氣管炎患者肺支氣管上皮下區(qū)中AT1/AT2受體比例增加，其主要原因是氣道上皮周圍的成纖維細胞和巨噬細胞上AT1受體水平的增加，這也反映了在COPD中所觀察到的炎癥和纖維化水平的增加。
以上結(jié)果清楚地闡明，調(diào)節(jié)血管緊張肽II的AT1受體定位于上皮下肺組織中，而且特別在相應肺組織中其分布增加。因此，用AT1受體拮抗劑抑制血管緊張肽II導致氣道阻塞減少。
而且，這些實驗顯示，在肺上皮組織中，尤其是相應的患病組織中例如主要是支氣管上皮細胞上，以及在肺泡的結(jié)構(gòu)細胞中例如肺泡的粘液腺上，AT2的分布增加。因AT2受體具有抗增生、抗纖維化和促進凋亡的功能，對它們的調(diào)節(jié)可用于治療具體形式的肺部疾病，尤其是治療成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)以及降低肺癌、乳腺癌中上皮的增生能力，此外，還可用于治療膿毒病綜合癥，肺損傷，例如肺炎，吸入胃內(nèi)容物，胸外傷，休克，灼傷，脂肪栓塞(fat embolia)，心肺動脈分流，氧中毒，出血性胰腺炎癥，間質(zhì)及支氣管肺泡炎，上皮及間質(zhì)細胞增生，膠原積累，纖維化。
正常乳腺組織及乳腺癌患者中的受體分布本研究包括的乳腺標本是從Ghent的University Hospital病理部的檔案中隨機挑取的。所有樣品均在福爾馬林中固定后包埋在石蠟中，并由該部門的病理學家對其病理狀態(tài)作出診斷。16例樣本包括14例侵襲性導管癌、1例侵襲性膠樣癌、1例侵襲性小葉癌。
按前述，使用在肺研究中采用的AT1和AT2的多克隆抗體，以及鏈親和素-生物素-過氧化物酶復合物法，對石蠟包埋組織切片進行免疫細胞化學分析。
為了提供一個可能的模型來試驗受體拮抗劑，我們還對來源于人乳腺組織的細胞系就其受體含量進行了研究。這可以為進一步的生物化學和細胞學研究提供一個有用的體外工作模型。
結(jié)果所獲得的數(shù)據(jù)清楚地表明，在正常人乳腺組織中存在血管緊張肽II的1型、2型受體，其中AT2發(fā)現(xiàn)存在于襯在導管內(nèi)側(cè)的立方上皮上，而AT1受體主要存在于導管的肌上皮細胞上。孵育過程中略去一抗則所有染色消失。
所有樣本中結(jié)締組織均為AT1受體陽性，而癌細胞不被染色(11/16)或僅被輕微染色(5/16)。對于AT2受體，則觀察到相反的結(jié)果，所有的癌細胞均是陽性，而基質(zhì)幾乎沒有反應性(1/16)。
從測試的細胞系獲得的結(jié)果非常有趣，每種細胞系中觀察到的染色模式都不相同。正常哺乳動物上皮細胞的短期培養(yǎng)物呈現(xiàn)AT1受體強陽性，而對于AT2受體僅有弱染色。
乳腺癌
結(jié)論從這些結(jié)果可以看出，AT1受體在正常上皮細胞上的存在似乎與肺的情況極為不同。但上皮細胞類型是肌上皮，而兩種組織中的AT2受體都存在于立方上皮細胞上。同時，對于兩種組織，AT1受體的陽性基質(zhì)染色是相同的。后者明顯與細胞外基質(zhì)中存在成纖維細胞有關(guān)。
AT2受體以如此廣泛而且可再現(xiàn)的方式存在于腫瘤細胞上，這是令人驚奇的。這里描述的帶有特異受體的細胞類型為同類研究提供了一個理想的體外模型。
這些實驗清楚地顯示了一個讓人吃驚的結(jié)果，即在使用乳腺癌細胞的本模型中，AT1受體主要分布于基質(zhì)，而AT2受體可確定主要在癌細胞中。
所有這些出人意料的結(jié)果都清楚地表明任何AT1受體拮抗劑或AT2受體調(diào)節(jié)劑都可以用于治療與上皮下區(qū)中AT1受體的增加有關(guān)的或與上皮中AT2受體的增加有關(guān)的病變或疾病，尤其是用于治療阻塞性氣道疾病。阻塞性氣道疾病是一類呼吸疾病，其特征是氣道大小減小，氣道分泌物增多，導致肺泡通氣減少。阻塞性氣道疾病包括可逆轉(zhuǎn)疾病和不可逆轉(zhuǎn)疾病，選自例如慢性阻塞性肺疾病，如支氣管炎，例如慢性支氣管炎和氣腫，和哮喘、囊性纖維化、間質(zhì)性肺疾病、侵襲性肺癌、肺血管疾病，以及用力呼氣(forced expiration)過程中氣流阻力增加。任何這種治療也可以，但并不必需，與高血壓的治療以及不吸煙者和吸煙者相關(guān)。
這些令人驚奇的結(jié)果清楚地表明，任何AT2受體調(diào)節(jié)劑都可以用于治療與上皮肺組織中AT2受體的增多有關(guān)的疾病或病變，尤其可用于治療具體形式的肺疾病和病變，特別是治療成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)以及降低侵襲性肺癌中上皮的增生能力，此外還可用于治療膿毒病綜合癥，肺損傷如肺炎，吸入胃內(nèi)容物，胸外傷，休克，灼傷，脂肪栓塞，心肺動脈分流，氧中毒，出血性胰腺炎，間質(zhì)及支氣管肺泡炎癥，上皮及間質(zhì)細胞增生，膠原積累，纖維化。
AT1受體拮抗劑或AT2受體調(diào)節(jié)劑是可改變宿主對腫瘤細胞的生物學應答并有益于治療的藥劑。乳房導管肌上皮中AT1受體的表達增加以及乳房立方上皮中AT2受體的表達增加說明，任何AT1受體拮抗劑或AT2受體調(diào)節(jié)劑都可以用于治療侵襲性乳腺癌。這些乳腺癌包括乳腺硬癌、乳腺浸潤癌、乳腺乳頭狀癌、乳腺導管癌、乳腺髓樣癌和乳腺小葉癌以及它們在肺、胸膜、骨骼和肝中的轉(zhuǎn)移癌。這種治療可考慮作為輔助治療聯(lián)合手術(shù)和放療應用，或作為緩和治療(palliative therapy)與激素治療或其它生物應答調(diào)節(jié)劑如干擾素、白細胞介素、腫瘤壞死因子、單克隆抗體等一起使用。
雖然臨床檢查和乳房造影法可以提示乳腺癌的存在，但只有組織活檢測試可以進行確診。AT1和AT2受體的分布形式可以用作增生(AT1受體的定位)和侵襲性癌變(AT2受體的定位)的標志，并從而作為診斷惡性腫瘤的指標。
AT1受體拮抗劑包括具有不同結(jié)構(gòu)特征的化合物。例如，可以提及在公開號為443983(EP443983)的歐洲專利申請中，尤其是在其化合物權(quán)利要求中列出的化合物，以及其實施例的終產(chǎn)物，該權(quán)利要求的主題在此以參考該公開文本的形式并入本申請。
優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)式的(S)-N-(1-羧基-2-甲基丙-1-基)-N-戊酰-N-[2’(1H-四唑-5-基)聯(lián)苯-4-基甲基]胺[纈沙坦]和它的可藥用鹽 而且，在公開號為253310(EP 253310)的歐洲專利申請中，尤其是在其化合物權(quán)利要求中列出的化合物，以及其實施例的終產(chǎn)物，在此以參考該公開文本的形式并入本申請。
優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物[氯沙坦]及其可藥用鹽
而且，在公開號為403159(EP 403159)的歐洲專利申請中，尤其是在其化合物權(quán)利要求中列出的化合物，以及其實施例的終產(chǎn)物，在此以參考該公開文本的形式并入本申請。
優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物[Eprosartan]及其可藥用鹽 而且，在公開號為WO 91/14679的PCT專利申請中，尤其是在其化合物權(quán)利要求中列出的化合物，以及其實施例的終產(chǎn)物，在此以參考該公開文本的形式并入本申請。
優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物[Irbesartan]及其可藥用鹽
而且，在公開號為EP 420237(EP 420237)的歐洲專利申請中，尤其是在其化合物權(quán)利要求中列出的化合物，以及其實施例的終產(chǎn)物，在此以參考該公開文本的形式并入本申請。
優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物[E-1477]及其可藥用鹽 而且，在公開號為502314(EP 502314)的歐洲專利申請中，尤其是在其化合物權(quán)利要求中列出的化合物，以及其實施例的終產(chǎn)物，在此以參考該公開文本的形式并入本申請。
優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物[替米沙坦]及其可藥用鹽
而且，在公開號為459136(EP 459136)的歐洲專利申請中，尤其是在其化合物權(quán)利要求中列出的化合物，以及其實施例的終產(chǎn)物，在此以參考該公開文本的形式并入本申請。
優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物[Candesartan]及其可藥用鹽 而且，在公開號為504888(EP 504888)的歐洲專利申請中，尤其是在其化合物權(quán)利要求中列出的化合物，以及其實施例的終產(chǎn)物，在此以參考該公開文本的形式并入本申請。
優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物[SC-52458]及其可藥用鹽
而且，在公開號為514198(EP 514198)的歐洲專利申請中，尤其是在其化合物權(quán)利要求中列出的化合物，以及其實施例的終產(chǎn)物，在此以參考該公開文本的形式并入本申請。
優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物[Saprisartan]及其可藥用鹽 而且，在公開號為475206(EP 475206)的歐洲專利申請中，尤其是在其化合物權(quán)利要求中列出的化合物，以及其實施例的終產(chǎn)物，在此以參考該公開文本的形式并入本申請。
優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物及其可藥用鹽
而且，在公開號為WO 93/20816的PCT專利申請中，尤其是在其化合物權(quán)利要求中列出的化合物，以及其實施例的終產(chǎn)物，在此以參考該公開文本的形式并入本申請。
優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物[ZD-8731]及其可藥用鹽 AT2受體配體(調(diào)節(jié)劑)包括具有不同結(jié)構(gòu)特點的化合物。例如，可以提及的是WO 94/13651中，尤其是在其化合物權(quán)利要求中列出的化合物，以及其實施例的終產(chǎn)物，其中該權(quán)利要求的主題在此以參考該公開文本的方式并入本申請。
而且，WO 94/13642中，尤其是在其化合物權(quán)利要求中列出的化合物，以及其實施例的終產(chǎn)物，在此以參考該公開文本的方式并入本申請。
例如含有至少一個堿性中心的AT1受體拮抗劑或者AT2受體配體分可以形成酸加成鹽。這些鹽可以使用以下酸來形成強無機酸，例如無機酸，如硫酸，磷酸或氫鹵酸；強有機羧酸，例如經(jīng)或未經(jīng)例如鹵素替代的C1-C4鏈烷羧酸(例如乙酸)，飽和或不飽和二羧酸(例如草酸，丙二酸，琥珀酸，順丁烯二酸，反丁烯二酸，鄰苯二甲酸或者對苯二酸)，羥基羧酸(例如抗壞血酸，羥基乙酸，乳酸，蘋果酸，酒石酸或者檸檬酸)，氨基酸(例如天冬氨酸或者谷氨酸)，或安息香酸；以及有機磺酸，如C1-C4鏈烷磺酸或經(jīng)或未經(jīng)例如鹵素替代的芳基磺酸(例如甲磺酸或者p-甲苯磺酸)。適合的帶有堿的鹽類(salts with bases)的例子是金屬鹽例如堿金屬或堿土金屬鹽(如鈉鹽，鉀鹽或者鎂鹽)；帶有氨或者有機胺的鹽(salts with ammonia or an organic amine)例如嗎啉，硫代嗎啉，哌啶，吡咯烷，單、雙、三低烷基胺(例如乙基胺，叔丁基胺，二乙基胺，二異丙基胺，三乙基胺，三丁基胺或者二甲基丙基胺)，或單、雙或三羥基低烷基胺(例如單、雙、三乙醇胺)。而且，可形成相應的內(nèi)鹽。
本發(fā)明提供用于治療與上皮下區(qū)中AT1受體增加或上皮中AT2受體增加有關(guān)的疾病或病變的藥物制劑，其分別含有AT1受體拮抗劑或AT2受體調(diào)節(jié)劑，或者它們的可藥用鹽。
本發(fā)明還提供AT1受體拮抗劑或AT2受體調(diào)整劑，或者它們的可藥用鹽類，分別在制備用于治療與上皮下區(qū)中AT1受體增加或與上皮中AT2受體增加相關(guān)的疾病的藥物制劑中的應用。
此外，本發(fā)明還提供用于治療與上皮下區(qū)中AT1受體增加或與上皮中AT2受體增加相關(guān)的疾病的方法，其包括分別施用治療上有效量的AT1受體拮抗劑或AT2受體調(diào)節(jié)劑，或它們的可藥用鹽類。
本發(fā)明還提供AT1受體拮抗劑或AT2受體調(diào)節(jié)劑，或者它們的可藥用鹽類，分別在治療與上皮下區(qū)中AT1受體增加或與上皮中AT2受體增加相關(guān)的疾病中的應用。
這些藥物制劑可以經(jīng)腸道如口腔和直腸，或腸胃外施用給恒溫動物，這些藥劑可以僅含有藥物學活性化合物也可添加通常的藥物輔助物質(zhì)。例如，這些藥物制劑含有約0.1％-100％，優(yōu)選約1％-約80％的活性化合物。用于腸道或腸胃外施用以及眼用的藥物制劑可以例如采用單位劑量形式，如包衣的片劑，片劑，膠囊或栓劑以及安瓿。這些制劑可以按本質(zhì)上已知的方式來制備，例如采用傳統(tǒng)的混合，制粒，包衣，增溶(solubulizing)以及凍干方法。因此，口服用藥物制劑可以通過如下步驟獲得將活性成分與固體賦形劑合并起來，如果需要可將已獲得的混合物制粒，而且如果要求或有必要，可在添加適合輔助物質(zhì)之后將該混合物或顆粒加工成片劑或包衣的片劑核心。
活性化合物的劑量可能取決于多種因素，例如給藥方式，恒溫動物的種類、年齡和/或個體狀態(tài)。通常，在口服給藥情況中，估計對于一個體重大約75kg的患者，日劑量大約為約10-約360毫克，例如對于纈沙坦而言，大約為約40毫克、約80毫克、約160毫克或約320毫克。
本發(fā)明的又一方面是可用于治療例如前文所公開的疾病和病變的纈沙坦的固體口服劑量形式。
WO 97/49394(其內(nèi)容，尤其是(但不限于)權(quán)利要求的主題物，以參考文獻方式并入本文)公開了選擇性地聯(lián)合氫氯噻嗪(HCTZ)的纈沙坦(可選擇地以鹽的形式)例如通過壓縮形成的壓縮固體口服劑量形式。在WO 97/49394中，對于纈沙坦/HCTZ組合物以及5％的單獨纈沙坦，纖維素的優(yōu)選范圍是10％-30％例如21％。交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(聚乙烯聚吡咯烷酮)的優(yōu)選范圍是10％-20％，例如13％。
在深入測試之后，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過增加微晶纖維素的比例可以改善纈沙坦的已知固體制劑的生物利用度性質(zhì)。而且令人驚奇的是，還發(fā)現(xiàn)通過減少交聯(lián)PVP聚乙烯聚吡咯烷酮的比例可以改善纈沙坦的所述已知固體制劑的質(zhì)量，例如對于片劑而言更好的重量均一性和更好的壓縮。
因此，在再一方面，本發(fā)明涉及一種固體口服劑量形式，其含有作為活性劑的纈沙坦和按重量計占所述固體口服劑量形式的核心成分總重量30％以上例如31％-65％，如50％的微晶纖維素。
在又一方面，本發(fā)明涉及含有作為活性劑的纈沙坦和微晶纖維素的固體口服劑量形式，其中纈沙坦與微晶纖維素的重量比為2.5∶1到0.3∶1，例如2∶1到1∶1，如1.4∶1。
在又一個實施方案中，本發(fā)明的固體口服劑量形式含有按重量計占所述固體口服劑量形式的核心成分總重量13％以下的聚乙烯聚吡咯烷酮，例如2-10％。
優(yōu)選地，纈沙坦與聚乙烯聚吡咯烷酮的重量比在7∶1到3∶1之間，例如6∶1到4∶1，如5.3∶1。
優(yōu)選地，微晶纖維素與聚乙烯聚吡咯烷酮的重量比在7∶1到1∶1之間，例如4∶1到2∶1，如3.6∶1。
根據(jù)本發(fā)明的固體口服劑量形式可以包含20-360毫克的纈沙坦，例如40毫克，80毫克，160毫克，320毫克。使用此劑量范圍，可以增加治療的靈活性和效能，例如在降低血壓方面。
在又一方面，本發(fā)明涉及含有如下物質(zhì)的固體口服劑量形式20％-65％的纈沙坦31％-65％的微晶纖維素2％-13％的聚乙烯聚吡咯烷酮。
一個典型的組成物可以包含20％-65％的纈沙坦31％-50％的微晶纖維素2％-10％的聚乙烯聚吡咯烷酮1％-10％的硬脂酸鎂0.5％-5％的膠態(tài)無水二氧化硅。
如需要，可以添加占核心組合物重量1％-10％，例如5％-10％的Cutina，或者是占核心組合物重量1％-10％，例如5％-10％的硬脂酸。
優(yōu)選地，本發(fā)明的固體口服劑量形式是壓縮片劑形式。
在又一方面，本發(fā)明涉及一種固體口服劑量形式例如壓縮片劑，其含有250毫克以上至360毫克以下(例如320毫克)纈沙坦作為活性劑。
可以使用在固體口服制劑中常用的作為潤滑劑和滑動劑的其它賦形劑，并且可參考有關(guān)適合物質(zhì)的大量文獻，見尤其是Fiedler著的“Lexiconder Hilfstoffe”，第四版，ECV Aulendorf 1996，和“藥用賦形劑手冊”Wade和Weller編(1994)，其內(nèi)容以參考文獻方式并入本文。
根據(jù)本發(fā)明的固體口服劑量形式可以是糖衣丸形式，在此情況下，該固體口服劑量形式以包衣，典型的是本領(lǐng)域完全常規(guī)的蔗糖包衣、紫膠包衣或其它薄膜包衣形式提供。請注意本領(lǐng)域使用的許多已知包衣方法，例如在流化床中進行噴霧包衣，如采用從Aeromatic，Glatt，Wurste或Hüttlin獲得的裝置通過已知方法進行，或在多孔盤(perforated pan)中通過Accela Cota法進行噴霧包衣；或者浸沒劍型包衣(submergedsword coating)方法?？梢栽谶@些方法中采用在成型過程中常用的添加劑。例如，可以使用的包衣是WO 97/49394中所公開的包衣、Opadry等等。
本發(fā)明的藥物組合物是有用的，因為其中包括的特定活性成分是已知明了的。
待施用的活性劑的確切劑量和具體劑型取決于多個因素例如待治療的疾病、治療的期望持續(xù)時間和活性劑的釋放速率。例如要求的活性劑的量和其釋放速率可以根據(jù)已知的體外或體內(nèi)技術(shù)來確定，即通過測定血漿中特定活性劑的濃度在多長時間內(nèi)保持在對于治療效果可接受的水平上來確定。
例如，本發(fā)明的組合物在臨床試驗中具有與商品化形式的Diovan相似的生物利用度。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的固體形式的溶解速率為30分鐘內(nèi)超過90％。
例如，對于一個體重為755公斤的哺乳動物，如人，以及在標準動物模型中，可以使用每天10毫克-360毫克劑量的纈沙坦。在標準動物試驗以及臨床試驗中可以觀察到對通過該組合物提供的纈沙坦的良好耐受性。
在另一個方面，按上文所述，本發(fā)明提供制備固體口服劑量形式的方法?？梢园催m合量加工WO 97/49394(以參考文獻方式并入本文)中的成分，例如上文所定義的，以形成這種單位劑量形式。
例如，提供一種制備上述固體口服劑量形式的方法，其包括步驟i)將活性劑和可藥用添加劑粉碎，ii)將研碎的活性成分和添加劑的混合物壓縮成coprimate(壓縮塊)iii)將coprimate轉(zhuǎn)換形成顆粒iv)將顆粒壓縮形成該固體口服劑量形式。
該過程在無水的環(huán)境中進行，即是一種干性壓縮方法。此過程可以在環(huán)境溫度和濕度的條件下進行；不必保證該過程在干燥的空氣中進行。
最初的粉碎步驟1)可以根據(jù)常規(guī)的粉碎方法或微粉化方法進行。
活性劑與添加劑可以分別也可以一起粉碎成大小約0.1微米(μ)μ-1500μ，例如1.0μ-900μ，如60μ-600μ的顆粒。至少90％的活性劑和添加劑的晶體處于這些范圍內(nèi)。這樣大小的顆粒可以通過常規(guī)粉碎方法獲得，這些方法例如在空氣噴射研磨機(air jet mill)、錘磨機和篩磨、微細沖擊研磨機(fine impact mill)、球磨機或振蕩磨(vibrator mill)中進行粉碎。
優(yōu)選地，微粉化采用超聲粉碎儀，如BRANSON Sonifier型超聲粉碎器通過已知方法來實現(xiàn)，或使用高速攪拌器例如HOMORE型攪拌器通過攪拌懸浮物來實現(xiàn)。
可以選擇性地在此階段根據(jù)已知方法對研碎顆粒進行篩分和混合。
壓縮形成coprimate需要將干燥的粉碎成分壓緊，這可以采用重擊(slugging)技術(shù)優(yōu)選碾壓來實現(xiàn)。碾壓裝置是常規(guī)的，基本上是使用兩個相向滾動的輥柱。液壓頭迫使其中一個輥柱擠壓另一個，從而對通過螺旋傳送系統(tǒng)注入碾壓裝置的粉碎后顆粒產(chǎn)生一個壓緊的力量。
可以使用25-65kN，如25-45kN的壓緊力。在這一壓緊力范圍內(nèi)，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，對于每一種特定劑型，為了獲得其中顆粒以理想速率崩解為分散的初級顆粒的固體口服劑量形式，應該使用最小的壓緊力，例如，對于以超過最小壓緊力壓縮的固體口服劑量形式崩解以快大約6倍的速率發(fā)生。如此快的崩解速率對于片劑是不尋常的，與膠囊劑型的崩解速率相似。具體的最小壓緊力取決于任何指定劑型中的活性劑含量，從而也取決于存在的添加劑的量和性質(zhì)。
鑒于以上的信息，運用常規(guī)實驗并且無須過多的煩瑣步驟，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能清楚地確定用于其它劑型的最小壓緊力。
輥柱速度可以設(shè)定在1-20rpm之間，優(yōu)選9-15rpm。經(jīng)過輥柱后，壓緊塊(coprimate)類似于成段的細帶。
可以對Coprimate進行篩選和/或磨細以形成顆粒。最簡單形式的篩選是使從輥柱出現(xiàn)的coprimate在機械壓力下通過一個篩子。更優(yōu)選地，使用振動研磨機如MGI624 Frewitt(Key International公司)來篩選coprimate。
將顆粒壓縮成片劑核心可以在傳統(tǒng)的壓片機例如EK-O Korsch偏心壓片機或者旋轉(zhuǎn)壓片機中，在例如大于2kN的壓緊力下進行。片劑核心可以有不同形狀，例如圓形、卵圓形、長方形、圓柱狀或者任何其它適合的形狀；而且根據(jù)治療劑的濃度，片劑核心可以有不同大小。根據(jù)本發(fā)明的片劑的一個特點是就其中所含的活性劑的量而言這些片劑的小的體積。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，通過上述壓縮方法獲得的片劑呈輕微卵圓形。片劑的邊緣可以是傾斜的也可以是圓形的。
在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，固體口服劑量形式被壓縮成具有長方形形狀的片劑形式，其大小比例長∶寬∶高為例如2.5-5.0∶0.9-2.0∶1.0；而且優(yōu)選地，片劑的底面與頂面各自獨立地是平面或是圍繞縱軸的中凸曲面；側(cè)面是平面；端面可以是任何形狀而且邊緣可以選擇性地是斜的或是圓形的。
在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，固體口服劑量形式從顆粒壓縮成長方形，其長大約為10.0-15.0毫米，寬大約為5.0-6.0毫米，高大約為3.0-4.0毫米。
在本發(fā)明的另一個特別優(yōu)選的實施方案中，固體口服劑量形式從顆粒壓縮成長方形，其長大約為15.0-18.0毫米，寬度大約為6.0-9.0毫米，高度大約為3.5-5.0毫米。
在本發(fā)明的又一優(yōu)選實施方案中，提供基本上為圓盤狀的片劑，其上下面均具有輕微凸面。優(yōu)選地，該片劑的直徑大約為8-8.5毫米，高大約為3-3.5毫米，或者直徑大約為16毫米，高大約為6毫米。該片劑所占體積可以大約從0.1立方厘米至1立方厘米，例如0.1立方厘米-0.45立方厘米，如0.2立方厘米-0.3立方厘米，如約0.125立方厘米或0.25立方厘米。
而且這些片劑可以是透明的、無色的或著色的，而且可帶有標記，以便賦予該產(chǎn)品一個獨特的外觀并使得可以對其進行快速識別。著色劑的使用可以用來加強外觀以及鑒別該組合物。適合用于藥物中的著色劑典型包括類胡蘿卜素、氧化鐵或葉綠素。
以下實施例闡明上述發(fā)明；然而，其并不旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
劑型實施例1薄膜包衣片劑
*)在加工過程中去除。
薄膜包衣片劑的制備按例如以下方式進行將纈沙坦、微晶纖維素、聚乙烯聚吡咯烷酮、部分膠態(tài)無水二氧化硅/膠態(tài)二氧化硅/Aerosil 200、二氧化硅以及硬脂酸鎂的混合物在擴散混合器(diffusion mixer)中預先混合，然后經(jīng)過篩磨進行篩分。將所獲混合物再次在擴散混合器中預先混合，在碾壓裝置中壓緊，然后通過篩磨進行篩分。向所獲混合物加入剩余的膠態(tài)無水二氧化硅/膠態(tài)二氧化硅/Aerosil 200，并在擴散混合器中做最后的混合。整個混合物在旋轉(zhuǎn)壓片機中壓縮，然后通過使用Diolack淺紅在多孔盤中給片劑包被一層薄膜。
劑型實施例2
1.D.蛋白質(zhì)濃度的影響在含有10mM pH6的琥珀酸鈉和150mM精氨酸的制劑中檢測蛋白質(zhì)濃度對儲藏穩(wěn)定性的影響。如圖6所示，其中用可溶性rhIL-2在50℃的半衰期對初始的蛋白質(zhì)濃度作圖，rhIL-2儲藏穩(wěn)定性隨蛋白質(zhì)濃度下降而增加。該發(fā)現(xiàn)與實驗觀察結(jié)果一致，即聚集是rhIL-2在液體制劑中的主要降解途徑。
1.E.非離子型表面活性劑聚山梨醇酯80的作用在含有0.5毫克/毫升IL-2、230mM精氨酸堿、128mM琥珀酸調(diào)節(jié)到pH5.8，1mM EDTA和0、0.02和0.1％聚山梨醇酯80的制劑中測試聚山梨醇酯80(Tween80或Tw80)對rhIL-2儲藏穩(wěn)定性的影響。如表3所示，兩種含有聚山梨醇酯80的制劑顯示50℃時可溶性IL-2半衰期的減少，如RP-HPLC測量的從16天減少到9天。因此，在制劑中包含聚山梨醇酯80，單看其對蛋白質(zhì)聚集的作用就可認為并不合適。然而，該添加劑對于由凍融和機械剪切作用引起的急劇蛋白質(zhì)破壞具有穩(wěn)定作用，在含該蛋白的液體制劑加工過程中是有益的，如下文實施例所公開的。
還檢測了兩種基于山梨糖醇制劑的儲藏穩(wěn)定性。雖然RP-HPLC檢測其半衰期和生物活性與精氨酸制劑相當，但是據(jù)SEC-HPLC估計的半衰期則小得多，提示在這些制劑中的rhIL-2蛋白可能有大部分以可溶性聚集物形式存在。
表3RP-HPLC、SEC-HPLC和體外生物試驗對在50℃儲藏的rhIL-2中測量得到的半衰期(t1/2)或剩余的可溶性rhIL-2(峰B)
在表3中，用RP-HPLC測定的含精氨酸堿-琥珀酸rhIL-2制劑的半衰期，比用SEC-HPLC法測定的略小，比用體外生物測定法測定的更小得多。還評估了主要<p>劑型實施例3薄膜包衣片劑
*)Opadry褐色00F16711染料的組成列于下表。
**)在加工過程中去除。
Opadry的組成
該薄膜包衣片劑按例如劑型實施例1中所述的方法來制取。
劑型實施例4膠囊
該片劑按例如以下方法制備成粒/干燥纈沙坦和微晶纖維素在流化床成粒機中用成粒溶液進行噴霧成粒，其中該成粒溶液由溶解于純水中的聚乙烯吡咯烷酮和十二烷基硫酸鈉構(gòu)成。獲得的顆粒物在流化床干燥器中干燥。
碾磨/攪拌將上述干燥顆粒物與聚乙烯聚吡咯烷酮和硬脂酸鎂一起進行碾磨。然后在錐形螺桿型混合器中攪拌此物質(zhì)塊大約10分鐘。
裝入膠囊在控制的溫度與濕度條件下，將上述混合的批量顆粒填入空硬明膠膠囊中。將已填充膠囊除塵，視覺檢查，驗重以及直到經(jīng)質(zhì)量檢測部門對其檢疫。
劑型實施例5膠囊
該劑型按照例如劑型實施例4中的所述方法進行配制。
劑型實施例6
硬明膠膠囊
實施例7-11
實施例12薄膜包衣片劑的溶解(FCT)溶解合格標準為30分鐘內(nèi)Q＝75％(Paddle 50rpm，磷酸緩沖液，pH6.8)
權(quán)利要求
1.含有游離形式的纈沙坦和按重量計占劑量形式核心成分總重量30％以上的微晶纖維素的固體口服劑量形式。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的固體口服劑量形式，其含有高達65％的微晶纖維素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的固體口服劑量形式，其含有少于13％的聚乙烯聚吡咯烷酮。
4.含有游離形式的纈沙坦和微晶纖維素的固體口服劑量形式，其中纈沙坦與微晶纖維素的重量比為2.5∶1到0.3∶1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之任意一項的固體口服劑量形式，其含有20％-65％的纈沙坦。
6.權(quán)利要求1-4之任意一項的固體口服劑量形式，其含有20-360毫克的纈沙坦。
7.含有如下成分的固體口服劑量形式20％-65％的纈沙坦31％-65％的微晶纖維素2％-13％的聚乙烯聚吡咯烷酮。
8.含有250毫克以上至360毫克以下纈沙坦作為活性劑的單位固體口服劑量形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及AT1受體拮抗劑或AT2受體調(diào)節(jié)劑，或者它們的可藥用鹽，在制備用于治療與上皮下區(qū)中AT1受體增加或上皮中AT2受體增加相關(guān)的疾病的藥物制劑中的應用。
文檔編號A61K31/455GK1636561SQ20041008797
公開日2005年7月13日 申請日期1999年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月23日
發(fā)明者G·R·布洛克, M·德加斯帕羅, S·M·甘特 申請人:諾瓦提斯公司