專利名稱：信號調(diào)節(jié)蛋白α在制備預(yù)防和治療腫瘤的巨噬細胞中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及一種信號調(diào)節(jié)蛋白 α (SIRPa)在制備預(yù)防和治療腫瘤的巨噬細胞中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤中浸潤的巨噬細胞又稱腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor associated macrophages, TAMs)是浸潤的炎性細胞的主要成分。研究表明腫瘤細胞通過分泌細胞因子、趨化因子等從外周血中募集單核細胞到達腫瘤局部，誘導(dǎo)分化形成腫瘤相關(guān)巨噬細胞。 腫瘤相關(guān)巨噬細胞在腫瘤細胞的增殖、存活、浸潤和轉(zhuǎn)移中起重要作用，主要包括形成慢性炎癥的微環(huán)境，降解細胞外基質(zhì)，腫瘤細胞浸潤，進入血管，促進血管生成，在遠隔部位種植等0 (John Condeelis, Jeffrey W. Pollard. Macrophages :0bligate Partners for Tumor Cell Migration，Invasion, and Metastasis. Cell. 124 :263-266.)信號調(diào)節(jié)蛋白α (SIRPa)屬于免疫球蛋白超家族(IgSF)成員，是一類主要表達在骨髓細胞和神經(jīng)元細胞的胞膜蛋白，此外在平滑肌細胞、血管內(nèi)皮細胞等也有少量表達。 SIRPa胞外區(qū)由三個免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域(IgSF)組成，通常被高度糖基化，結(jié)構(gòu)學(xué)研究顯示它與抗原受體如TCR和BCR在非常類似，提示SIRPs家族分子可能是機體免疫系統(tǒng)進化的重要一環(huán)，參與調(diào)節(jié)免疫細胞活化。SIRPa胞質(zhì)區(qū)在人、大鼠和小鼠之間高度保守， 具有富含酪氨酸殘基的免疫受體抑制基序(ITIMs)，可以被蛋白激酶如Src蛋白磷酸化，進而與含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白如酪氨酸磷酸酶SHP-I和SHP-2結(jié)合，抑制免疫細胞的激活。 目前普遍認為SIRPa是一類抑制性受體。已有文獻報道SIRP α可以抑制LPS刺激引起的巨噬細胞活化，抑制中性粒細胞的遷移等。然而一部分研究證明SIRP α亦可以發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用，例如巨噬細胞SIRPa與配體結(jié)合后可以促進JAK-STAT的活化并促進NO的形成。 (Jacqueline Alblas. Signal Regulatory Protein Ligation Induces Macrophage Nitric Oxide Production through JAK/STAT-and Phosphatidylinositol 3-Kinase/Racl/NAPDH 0xidase/H202-Dependent Pathways. MOL CELL BIOL. 25 :7181-7192)慢病毒載體指以人類免疫缺陷病毒-1 (HIV-I)來源的一種病毒載體，能夠穩(wěn)定高效的將外源基因整合到宿主染色體上，實現(xiàn)持續(xù)性表達。慢病毒載體可以克服脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，持續(xù)時間短等缺點，已廣泛應(yīng)用與生物學(xué)研究中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供信號調(diào)節(jié)蛋白α的新用途，特別是提供一種通過慢病毒載體介導(dǎo)上調(diào)巨噬細胞信號調(diào)節(jié)蛋白α (SIRPa)的表達，調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細胞的功能， 達到預(yù)防和治療腫瘤的作用。本發(fā)明提供了信號調(diào)節(jié)蛋白a (SIRPa)在制備預(yù)防和治療腫瘤的巨噬細胞中的應(yīng)用。具體是通過構(gòu)建SIRPa過表達的慢病毒載體，體外轉(zhuǎn)染分離獲得的巨噬細胞，獲得過表達SIRPa的巨噬細胞，用于預(yù)防和治療腫瘤。本發(fā)明的技術(shù)方案主要包括以下幾個方面1、慢病毒表達質(zhì)粒的構(gòu)建LV-WT-SIRP α、LV-microRNA-SIRP α、LV-GFP2、表達質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)細胞，包裝慢病毒，滴度檢測；3、分離培養(yǎng)外周單核細胞，骨髓來源的巨噬細胞(BMDMs)，腫瘤局部的腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)；4、慢病毒轉(zhuǎn)染細胞；5、體外觀察腫瘤細胞共培養(yǎng)條件下SIRP α過表達與干擾的巨噬細胞(a)細胞表型的改變-流式檢測MHC II ;(b)遷移粘附到腫瘤局部-Transwell能力，細胞骨架改變，粘附相關(guān)分子表達；(c)表達分泌腫瘤炎癥與免疫相關(guān)分子-Real-Time與ELISA檢測IL-6、 TNFa、IL-12、IL-10等；(d)微環(huán)境中生存能力的改變-PI/Annexin V染色，Caspase相關(guān)分子的改變。6、體外觀察腫瘤細胞共培養(yǎng)條件下SIRP α過表達與干擾的腫瘤相關(guān)巨噬細胞 (TAMs)研究內(nèi)容同5 ；7、體外觀察SIRP α過表達與干擾的巨噬細胞對腫瘤細胞的調(diào)節(jié)(a)巨噬細胞表面分子的改變-流式檢測TRAIL、FasL ； (b)腫瘤細胞凋亡-PI/Annexin V染色，Caspase相關(guān)分子改變。(c)腫瘤細胞增殖-CCK-8檢測；8、體內(nèi)觀察SIRPa過表達與干擾的巨噬細胞對腫瘤的影響在預(yù)防和治療腫瘤模型中定期注射慢病毒載體介導(dǎo)的SIRPa過表達與干擾的巨噬細胞，觀察對腫瘤大小和小鼠生存時間的影響。本發(fā)明提供了信號調(diào)節(jié)蛋白α (SIRPa)的新用途。實驗結(jié)果表明1)如圖2所示，巨噬細胞SIRPa負性調(diào)控其向腫瘤細胞的遷移。與無H印al_6 細胞條件相比，巨噬細胞與ifepal-6細胞共培養(yǎng)時向!fepal-6遷移的能明顯增強，低表達 SIRPa促進巨噬細胞的這種遷移能力。2)如圖3所示，巨噬細胞SIRP α負性調(diào)控腫瘤炎癥微環(huán)境。圖3_1與3_2說明腫瘤微環(huán)境刺激巨噬細胞分泌IL-6、TNF a、ILl β等炎性因子，低表達SIRP α的BMDMs分泌炎性因子的能力強于對照組，。圖3-3說明SIRP α調(diào)控BMDMs與炎癥和免疫相關(guān)的信號通路。3)如圖4所示，巨噬細胞SIRP α負性調(diào)控細胞存活。低表達SIRP α的BMDMs在相應(yīng)刺激下PARP與Caspase-3剪切體的表達低于對照組。4)如圖5顯示，巨噬細胞SIRP α負性調(diào)控腫瘤的生長。圖5_1顯示高表達SIRP a 的巨噬細胞培養(yǎng)上清明顯抑制B16F10腫瘤的生長，圖5-2顯示回輸慢病毒載體介導(dǎo)的高表達SIRP α的BMDMs抑制B16F10的生長。圖5_3顯示回輸慢病毒載體介導(dǎo)的高表達SIRP a 的巨噬細胞抑制H印al-6的生長。實驗結(jié)果證明巨噬細胞SIRPa負性調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本發(fā)明提供了一種利用慢病毒載體針對腫瘤相關(guān)巨噬細胞的方法，可以用于預(yù)防和治療小鼠肝癌、黑色素瘤等腫瘤，進而可以預(yù)防和治療哺乳動物腫瘤，特別是與巨噬細胞相關(guān)的腫瘤如肝癌、乳腺癌等。本發(fā)明為SIRPa的臨床應(yīng)用提供了新的思路。本發(fā)明提供了一種新型的腫瘤治療方案。


圖1是慢病毒表達質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定及包裝、感染。SIRP α表達特異性檢測。其中圖1-1 為 Western-Blot 檢測 LV-WT-SIRP α、LV-miRNA-SIRP α、LV-GFP 質(zhì)粒包裝的慢病毒的感染效果；圖1-2為Wfestern-Blot檢測LV-miRNA-SIRP α包裝的慢病毒的不同滴度的感染效果以及腫瘤細胞Hepal-6表達SIRP α的情況。圖2是SIRP α與巨噬細胞遷移到腫瘤局部的能力其中圖2-1是利用Transwell方法，光鏡下觀察BMDMs KD Control組與!fepal-6 細胞共培養(yǎng)10hr、20hr后的遷移能力；圖2_2是對圖2_1的各組細胞計數(shù)后進行統(tǒng)計分析。圖3是SIRP α調(diào)節(jié)巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中的表型其中圖3-1為高低表達SIRP α的巨噬細胞與腫瘤細胞細胞共培養(yǎng)后IL_6、TNF α、 IL10、IL12等細胞因子的表達情況；圖3-2為ELISA檢測高低表達SIRP α的巨噬細胞與腫瘤細胞細胞共培養(yǎng)后IL-6、TNFa、IL10、IL12的水平；圖3_3為高低表達SIRP α的巨噬細胞與腫瘤細胞細胞共培養(yǎng)后相應(yīng)信號通路的改變。圖4是SIRP α調(diào)節(jié)巨噬細胞存活的能力其中圖4-1是干擾SIRP α表達和對照的巨噬細胞在IFN γ誘導(dǎo)下發(fā)生凋亡情況。 分別檢測了參與凋亡途徑的caSpaSe3和PARP剪切情況；圖4-2是干擾SIRP α表達和對照的巨噬細胞在TNF+CHX的作用下發(fā)生凋亡情況，實驗分別檢測了 CaSpaSe3和PARP剪切情況。圖5是SIRP α調(diào)節(jié)腫瘤細胞體內(nèi)生長的能力其中圖5-1為高低表達SIRP α的巨噬細胞共培養(yǎng)上清與B16F10腫瘤生長的能力；圖5-2為體內(nèi)回輸高低表達SIRP α的巨噬細胞與B16F10腫瘤生長的能力；圖5_3為高低表達SIRP α的巨噬細胞與!fepal-6細胞皮下接種C57小鼠后瘤體生長的能力。
具體實施例方式現(xiàn)結(jié)合實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步描述，但本發(fā)明的實施并不僅限于此。實施例1 :SIRPa表達載體的構(gòu)建、鑒定及干擾序列的合成、鑒定；SIRP α特異性表達檢測材料1) SIRP α慢病毒表達載體與干擾載體和包裝載體Lenti-Linker、VSVG, PACK,線性化載體 pcDNA6. 2-Gff/miR 購自 hvitrogen 公司；2)克隆引物為鼠源SIRP α mRNA開放閱讀框起始和終止引物序列，委托上海生工合成。3)克隆過程使用限制性內(nèi)切酶和Τ4連接酶購自NEB公司。4) 293Τ, Hepal-6細胞系購自上海市中科院細胞所。
5) M-CSF等細胞因子購自P^rotech公司6)轉(zhuǎn)染試劑 PEI 購自 Polyplus-transfection 公司。7)兔抗鼠多克隆抗體SIRPa由本實驗室自行制備(參見Kharitonenkov A. Afamily of proteins that inhibit signalling through tyrosine kinase receptors. Nature. 1997Mar 13 ；386 (6621) :181-6.)。方法1)慢病毒表達載體與干擾載體構(gòu)建、鑒定1. 1構(gòu)建干擾慢病毒載體LV-miRNA-SIRP α構(gòu)建慢病毒干擾載體LV-microRNA-SIRP α，設(shè)計干擾引物，引物序列如下上游TGCTGTCTATGAGCAGATGAGTTCACGTTTTGGCCACTGACTGACGTGAACTCCTGCTCATAG(SEQ ID NO 1)下游 CCTGTCTATGAGCAGGAGTTCACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTGAACTCATCTGCTCATAGAC(SEQ ID NO 2)引物于95 °C退火5min，冷卻至常溫形成二聚體。T4連接酶連接至pcDNA6. 2-Gff/miSIRP α制備干擾質(zhì)粒。再以該質(zhì)粒為模版，通過上游引物 GGACTAGTGCAGATATCAACAAGTTTG(SEQ ID NO 3)(帶 Spe 1 酶切位點)，和下游引物 GGACT AGTCTGCGGCCGCACCACTTTGTACAAGAAAGTCGG(SEQ ID NO 4)(帶 Spel 酶切位點)PCR 擴增 GFP-miSIRP α片段，得到約900bp的片段，經(jīng)Spel單酶切后連入NheI和SpeI雙酶切的 pLenti-linker1. 2構(gòu)建過表達慢病毒載體LV-WT-SIRP α以小鼠cDNA為模版，設(shè)計相應(yīng)引物PCR獲得目的片段。引物序列如下上游GGATCCATGGAGCCCGCCGGCCCG(SEQID NO 5)(帶 BamHI 酶切位點)下游GCTAGCTCACTTCCTCTGGACCTGGACACT(SEQID NO 6)(帶 NheI 酶切位點)使用高保真KOD酶體系擴增獲得全長序列約1500bp，BamHl與NheI雙酶切表達載體和目的片段，酶切鑒定后，用T4連接酶連接至表達載體?；寐《景b，滴度檢測細胞在IOcm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至70%匯合度，采用磷酸鈣法(參照分子克隆，第三版，1282-1287頁)共轉(zhuǎn)慢病毒表達質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒，60hr后收集培養(yǎng)上清，測定病毒滴度，具體方法如下傳四31~細胞IX IO5于M孔板，用無血清培養(yǎng)基稀釋病毒原液1 10、 1 100、1 1000加入M孔板，感染體積為200 μ 1。感染60hr后，收集細胞經(jīng)流式計數(shù)鑒定。病毒滴度公式計算為滴度(/ml)比例％ X(IXlO5)X稀釋倍數(shù)/培養(yǎng)體積ml。3)干擾效果檢測分離小鼠骨髓細胞，M-CSF 100ng/ml培養(yǎng)7天，分化成熟形成巨噬細胞(BMDMs)， 1 X IO6/孔傳至6孔板，使用干擾SIRP α慢病毒，選定MOI值為50，80，感染8hr后換液，感染60hr后觀察感染效率，Western-Blot檢測效果。4) SIRP α特異性表達檢測本發(fā)明中腫瘤模型建立在H印al-6等腫瘤細胞模型基礎(chǔ)上，因此flfestern-Blot檢測H印al-6細胞SIRP α的表達情況。結(jié)果如圖1所示，通過flfestern-Blot檢測，LV_WT_SIRP α包裝的過表達慢病毒能夠有效的提高巨噬細胞SIRP α的表達，同時LV-miRNA-SIRPa包裝得到的慢病毒能下調(diào)巨噬細胞SIRP α的表達。如圖1-2所示，當(dāng)MOI =40時，巨噬細胞可以獲得較好的干擾效果，因此以下實驗建立在此干擾效率的基礎(chǔ)上。同時圖1-2顯示，與BMDMs相比，!fepal-6細胞的 SIRPa表達量很低，說明SIRPa主要表達于BMDMs，具有較好的特異性。實施例2 =SIRPa與巨噬細胞遷移到腫瘤局部能力材料DTranswell 24 孑L板，0. 8 μ m，購自 Corning 公司2)0. 結(jié)晶紫、0.4%多聚甲醛購自國藥公司3)!fepal-6細胞購自上海市中科院細胞所4) C57/BL6小鼠購自中科院方法分離培養(yǎng)C57小鼠的BMDMs，腫瘤細胞Hepal-6種植于Transwell下室，BMDMs SIRPaKD, Control組細胞種植于細胞上室，加入無血清DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)10hr、20hr后 0.4%多聚甲醛固定BMDM細胞15min，0. 結(jié)晶紫染色15-30min，生理鹽水洗凈后鏡下觀察，每孔在100X視野條件下隨機選取5個視野，計數(shù)細胞總數(shù)取均值為該孔細胞數(shù)。結(jié)果如圖2-1與圖2-2所示，無腫瘤細胞存在條件下，差異表達SIRPa的BMDMs遷移能力沒有明顯差別。在與ifepal-6細胞共培養(yǎng)時，巨噬細胞向ifepal-6遷移的能明顯增強， SIRPa抑制巨噬細胞向腫瘤細胞的遷移。說明SIRPa負性調(diào)節(jié)巨噬細胞向腫瘤局部遷移的能力。實施例3 =SIRP α調(diào)節(jié)巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中的表型材料l)mIL_6、mTNFa、mILlO、mIL12 等引物由生工公司合成，2) Sybr-Green 購自 TaKaRa 公司3)mIL-6、mTNFa、mILlO、mIL12 等 ELISA 試劑盒購自達科為公司4)B16細胞購自中科院5) TRIZOL 購自 Invitrogen 公司6) M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體系購自Promega公司7)p-statl、p-stat3、IkBa、N0S2 等抗體購自 Cell signaling technology 公司方法1)H印al_6、B16 細胞與 BMDMs SIRP α KD，Control 細胞共培養(yǎng) 12M36hr，收取培養(yǎng)上清進行ELISA檢測，同時收取BMDMs的RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)cDNA，通過Real-Time檢測相關(guān)細胞因子的表達。2) BMDMs與!fepal-6細胞細胞共培養(yǎng)0、l、3Jhr，收取蛋白，Western-Blot檢測相關(guān)分子的表達情況。結(jié)果圖3-1與圖3-2分別從mRNA與蛋白水平顯示腫瘤微環(huán)境能夠刺激巨噬細胞分泌 IL_6、TNFa、ILli3等炎性因子，低表達SIRP α的BMDMs分泌炎性因子的能力強于對照組， 提示低表達SIRPa可以促進腫瘤炎癥環(huán)境。
圖3-3顯示SIRP α調(diào)控BMDMs細胞與炎癥和免疫相關(guān)的信號通路，低表達SIRP α 可以增強乂&13、11^(1的磷酸化與，抑制Matl的磷酸化與N0S2的表達，提示SIRP α可以抑制巨噬細胞腫瘤相關(guān)的免疫功能。實施例4 =SIRP α與巨噬細胞存活的關(guān)系材料1) mTNF α、mIFN γ 訂購自 ρ印rotech 公司2) Caspase-3、PARP 抗體購自 CST 公司方法DBMDMs SIRP α KD 和 Control 組細胞 CHX lng/ml 預(yù)處理過夜，TNF α 10ng/ml 刺激 0、6、12hr，收取蛋白 Western-Blot 檢測 Caspase-3、PARP 的表達；2) IFNy 100ng/ml 朿Ij 激 BMDMs SIRP α KD Control 組細胞 0243648hr， Western-Blot 檢測 Caspase-3> PARP 的表達。結(jié)果如圖4-1 所示，低表達 SIRP α 的 BMDMs 在 CHX+TNF α 刺激下，PARP 與 Caspase-3 剪切體的表達低于對照組，提示SIRP α促進CHX+TNFa引起的細胞凋亡。圖4-2顯示低表達SIRP α的BMDMs抑制IFN γ誘導(dǎo)的PARP與Caspase-3剪切體的表達，提示SIRP α促進IFN γ引起的細胞凋亡。以上結(jié)果提示，SIRPa負性調(diào)節(jié)有害刺激引起的細胞凋亡。實施例5 =SIRPa與腫瘤體內(nèi)生長的關(guān)系材料l)C57/BL6、Balb/c 小鼠購自中科院2)Hepal-6,B16F10細胞系購自中科院細胞所方法1)B16F10 細胞 5\105接種8&讓/(；小鼠腹腔，同時收集B16F10 與 BMDMs SIRPa KD, Control細胞共培養(yǎng)上清，待腫瘤接種5天后，腹腔注射KD、Control上清250ul/只/天， 連續(xù)12天后，小鼠活體成像檢測腫瘤大小；2) B16F10細胞5 X IO5接種Balb/c小鼠腹腔，同時體外分離小鼠BMDMs，干擾 SIRPa表達，待腫瘤接種5天后，將BMDMs SIRP a KD，Control 2 X IO6回輸小鼠體內(nèi)，待12 天后活體成像檢測腫瘤大?。?)!1印&1-6細胞與腦01^ SIRP a KD，Control 細胞 1 :1 共 5 X IO6 皮下注射 C57/BL6 小鼠，并在相應(yīng)時間測量腫瘤的大小。結(jié)果圖5-1顯示，低表達SIRPa的巨噬細胞培養(yǎng)上清能夠明顯促進B16F10腫瘤的生長，圖5-2顯示低表達SIRP α的BMDMs與B16F10共培養(yǎng)后亦能促進B16F10的生長。圖 5-3顯示，低表達SIRPa的巨噬細胞能促進H印al_6的生長。結(jié)果提示，低表達SIRPa的巨噬細胞能夠促進腫瘤的體內(nèi)生長。
權(quán)利要求
1.信號調(diào)節(jié)蛋白α在制備預(yù)防和治療腫瘤的巨噬細胞中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的信號調(diào)節(jié)蛋白α在制備預(yù)防和治療腫瘤的巨噬細胞中的應(yīng)用，其特征在于通過構(gòu)建SIRP α過表達的慢病毒載體，體外轉(zhuǎn)染分離獲得的巨噬細胞，獲得過表達SIRP α的巨噬細胞。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物工程技術(shù)領(lǐng)域。腫瘤中浸潤的巨噬細胞又稱腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)是浸潤的炎性細胞的主要成分。研究表明腫瘤細胞通過分泌細胞因子、趨化因子等從外周血中募集單核細胞到達腫瘤局部，誘導(dǎo)分化形成腫瘤相關(guān)巨噬細胞。信號調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)屬于免疫球蛋白超家族(IgSF)成員，是一類主要表達在骨髓細胞和神經(jīng)元細胞的胞膜蛋白，此外在平滑肌細胞、血管內(nèi)皮細胞等也有少量表達。本發(fā)明的目的在于提供信號調(diào)節(jié)蛋白α的新用途，具體是通過構(gòu)建SIRPα過表達的慢病毒載體，體外轉(zhuǎn)染分離獲得的巨噬細胞，獲得過表達SIRPα的巨噬細胞，用于預(yù)防和治療腫瘤。
文檔編號A61P35/00GK102335427SQ20111030380
公開日2012年2月1日 申請日期2011年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月10日
發(fā)明者潘宇飛, 王紅陽, 董立巍, 談冶雄 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)