專利名稱：全人源腫瘤壞死因子抗體，其制備方法以及藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及腫瘤壞死因子抗體、其編碼序列、制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factorα，TNF-α)是機(jī)體內(nèi)的一種多功能免疫調(diào)節(jié)分子，它可以和細(xì)胞膜上的受體結(jié)合發(fā)揮作用，往往引起靶細(xì)胞的死亡(它的名稱即來源于此)或招引免疫效應(yīng)細(xì)胞在局部的聚集。TNF-α是一種可溶性的同源三聚體亞基，分子量為17KD(Smith，et al.，J.Biol.Chem.2626951-6954，1987)。也發(fā)現(xiàn)有跨膜結(jié)合的前體TNF-α，分子量為26KD(Kriegler，et al.，Cell5345-53，1988)。單核巨噬細(xì)胞在受到內(nèi)毒素和其他一些刺激物刺激后，能夠分泌TNF-α和TNF-β，另外其他一些細(xì)胞也能分泌TNF-α。
TNF-α在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、細(xì)菌或病毒感染、慢性炎癥、自身免疫疾病如愛滋病(AIDS)、惡性腫瘤和/或神經(jīng)退行性疾病等的病理進(jìn)程中起十分關(guān)鍵的作用。TNF-α單克隆抗體可以中和TNF-α，在體內(nèi)對TNF-α的活性起到了負(fù)調(diào)節(jié)的作用。而且有大量研究表明，TNF-α還是引起膿毒性休克綜合癥的主要介質(zhì)。膿毒性休克綜合癥患者血清中TNF-α水平升高預(yù)示著死亡率或致殘率升高。臨床上應(yīng)用TNF-α抗體或者其受體對膿毒性休克綜合癥有一定療效。
此外，TNF-α是促進(jìn)HIV無癥狀感染狀態(tài)進(jìn)入AIDS的主要介質(zhì)之一，而針對TNF-α的單克隆抗體能夠中和TNF-α的活性，在體內(nèi)對TNF-α的活性進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)，可去除患者從無癥狀感染狀態(tài)進(jìn)入AIDS的誘因，達(dá)到一定的AIDS治療目的。將TNF-α的單克隆抗體與其他AIDS藥物聯(lián)合用藥，拮抗由TNF-α過多所引起的副作用，將會明顯提高藥效。
1987年，Cerami等人獲得一種TNF-α的多克隆鼠抗體(EPO專利出版物0212489，1987年3月4日)，可用于細(xì)菌感染引起的休克診斷性免疫測定和治療。后來又相繼獲得了TNF-α的單克隆抗體，如Rubin et al.，EPO專利出版0218868，1987年4月22日和Yone等人的EPO專利出版物0288088，1988年10月28日中所描述的。
另外一些研究者描述了對重組人TNF-α特異性的單克隆抗體，在體外具有TNF-α中和活性(Liang，et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.137847-854，1986；Meager，et al.，Hybridoma 6305-311，1987)。
但是，由于上述研究得到的多為鼠源抗體，這些抗體都存在不同程度的免疫原性高、特異性低和/或穩(wěn)定性不夠等問題，沒有提供一種能夠在體內(nèi)發(fā)揮診斷或治療作用。
因此，本領(lǐng)域迫切需要建立既能夠保持或提高抗體的親和力和特異性，又能夠降低或基本消除抗體免疫原性的抗TNF-α抗體，從而可以用于臨床治療，比如治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和AIDS等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種特異性高、免疫原性低的全人源抗TNF-α單克隆抗體。本發(fā)明的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO1所述的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO2所述的氨基酸序列。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還在于提供所述全人源抗TNF-α單克隆抗體的核苷酸序列。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還在于提供一種含所述全人源抗TNF-α單克隆抗體的藥物組合物，它含有本發(fā)明的單克隆抗體和藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還在于提供本發(fā)明的單克隆抗體的用途，可用于制備治療AIDS的藥物，并且還可用于制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物。
本發(fā)明基于噬菌體抗體庫技術(shù)克隆和表達(dá)腫瘤壞死因子抗體，經(jīng)過篩選獲得的抗體是全人源的，克服了目前存在的鼠源抗體免疫原性高的缺點(diǎn)。比之從雜交瘤等獲取抗體基因，本發(fā)明的全人源抗體制備程序先進(jìn)簡便、價(jià)格低廉，更重要的是這種直接從人外周血淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增抗體基因的方法，是解決雜交瘤技術(shù)等一直無法解決的人源性抗體來源問題的根本途徑。
本發(fā)明提供了一種全人源的抗TNF-α單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)具有獨(dú)特的不同于現(xiàn)有技術(shù)的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明還提供了全人源的抗TNF-α單克隆抗體的氨基酸序列，以及具有這些鏈的其他蛋白質(zhì)或融合表達(dá)產(chǎn)物。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子。
本發(fā)明還提供了編碼上述單克隆抗體或其片段的DNA分子。本發(fā)明的單抗的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。一種可行的方法是用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS7、293細(xì)胞的動物細(xì)胞等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有上述的單克隆抗體或免疫偶聯(lián)物，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的藥物組合物可用于治療AIDS、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，還可用于其他需要抑制TNF-α的病癥。
本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量的本發(fā)明的抗體以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明的單克隆抗體的具有很高的親和力且是全人源的抗體。這種高親和力的單克隆抗體在臨床上具有重要的價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人源性單鏈抗體(scFv)基因庫的構(gòu)建(1).cDNA的制備收集1000人的外周血各5ml，混合，用淋巴細(xì)胞分離液(醫(yī)科院天津血研所生產(chǎn))分離單個(gè)核細(xì)胞。用Invitrogen公司的試劑盒，從分離的人外周血淋巴細(xì)胞中提取細(xì)胞的總mRNA。用GIBCO公司的mRNA純化試劑盒純化，以上述獲得的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄出cDNA第一鏈。以上步驟按照廠家提供的說明書進(jìn)行。
(2).PCR擴(kuò)增參照國內(nèi)外已發(fā)表的多種人抗體基因家族序列中V區(qū)FR1和FR4較保守的區(qū)段序列，設(shè)計(jì)并合成以下人抗體VH基因(hVH)、VL基因(hVL)、5′端(back)、3′端(forward)引物。根據(jù)所用載體pCANTAB5E(一種噬粒，為Pharmacia公司產(chǎn)品)加入適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c(diǎn)序列(引物均委托上海生工公司進(jìn)行合成)。
PCR反應(yīng)以步驟(1)獲得的轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物為模板，分別以VH引物對或VL引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在100μl總反應(yīng)體積中加入4 UTaq酶(購自華美公司)，條件為94℃ 60s，52℃ 70s，72℃ 80s，共30個(gè)循環(huán)，末次72℃延伸10min。
(3).PCR產(chǎn)物的回收及純化按照上述條件進(jìn)行PCR后，將產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)有分子量分別在310bp左右和300bp左右的兩條條帶，用Promega公司的膠回收試劑盒回收片段，操作按照廠家的說明書進(jìn)行。
(4).人源性單鏈抗體(scFv)基因的構(gòu)建以(Gly4 Ser)3為接頭序列(SEQ ID NO5)分別連接VH和VL構(gòu)成重鏈-接頭序列-輕鏈結(jié)構(gòu)的ScFv基因。接頭引物根據(jù)接頭序列模板及人抗體V區(qū)基因序列3′端、5′端部分序列設(shè)計(jì)并合成。
以上述接頭模板和引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及回收、純化(PCR條件及回收、純化方法均同上)，分離獲得長度約為100bp的接頭序列。
實(shí)施例2ScFv片段克隆進(jìn)入噬菌粒載體按照上述條件進(jìn)行PCR后，獲得兩端帶有SfiI和NotI酶切位點(diǎn)的ScFv片段，進(jìn)行離心柱層析純化，去除不必要的接頭引物和dNTP。將純化完畢的ScFv片段用SfiI和NotI(均購自Promega公司)進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)生可與載體pCANTAB5E(Pharmacia公司)相連接的粘性末端。再一次進(jìn)行離心柱層析純化，去除可能影響其與載體連接的小的SfiI或NotI片段。
噬菌粒載體pCANTAB5E(Pharmacia公司)本身包含有SfiI和NotI酶切粘性末端，可與上述ScFv片段相連接。采用常規(guī)的DNA連接酶，將ScFv片段克隆進(jìn)入噬菌粒載體上相應(yīng)的位點(diǎn)。在pCANTAB5E載體上其相鄰位置是g3p基因，將來可表達(dá)ScFv-g3p融合基因。
1升LB培養(yǎng)液加入1ml過夜培養(yǎng)的TG1細(xì)胞(Pharmacia公司)，培養(yǎng)至OD值約0.3～0.4，4000rpm離心收集細(xì)胞，10倍體積的的冰純水洗滌兩次，重懸于1ml含2％的酵母粉、1％蛋白胨、1mM MgCl2的10mM Tris-HCl緩沖液(PH8.0)中。100μ1電擊感受態(tài)細(xì)胞加入連接過夜的DNA樣品100ng，電壓為10千伏進(jìn)行電擊，將包含ScFv片段的連接載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入E.coli TG1細(xì)胞。然后將E.coli細(xì)胞培養(yǎng)于SOBAG(含100mg/L氨芐青霉素和2％葡萄糖的SOB培養(yǎng)基)瓊脂板，培養(yǎng)溫度為30℃，其中轉(zhuǎn)化有pCANTAB5E載體的Ecoli細(xì)胞成活。反復(fù)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，使所獲抗體庫的容量達(dá)到1×1011。
以2×YTAG(含100mg/L氨芐青霉素及2％葡萄糖的2×YT培養(yǎng)基)稀釋細(xì)菌至OD600＝0.2；再以15ml該懸液培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入1011pfu的M13K07輔助噬菌體(購自Promega公司)，37℃振搖培養(yǎng)1h，離心后重懸于10ml 2×YTAK(含100mg/L氨芐青霉素及70μg/ml卡那霉素的2×YT培養(yǎng)基)，搖床培養(yǎng)過夜，于4℃以1500×g離心15min。收集上清即為人源性ScFv噬菌體展示文庫。將其分裝后于-20℃保存，以備下一步以特異性抗原對文庫進(jìn)行″淘選(panning)″篩選。
實(shí)施例3淘選抗體庫對于實(shí)施例2得到的噬菌體展示文庫中的抗體，通過淘選技術(shù)選擇親和力高的抗體。
用重組人TNF-α(rhTNF-α)抗原(購自深圳晶美公司)包被酶聯(lián)板，BSA封閉，溫育2h，洗板后加50μl噬菌體抗體庫(約1012CFU)溫育2 h，TBST(Tris 50mmol/L，NaCl 150mmol/L，Tween-20 0.5％，BSA 1％，pH7.5)液洗1次(第2輪洗5次，第3輪后洗10次，每次5min)，以50μl洗脫液回收噬菌體，中和緩沖液調(diào)節(jié)pH至中性，感染Ecoli TG1，進(jìn)行下一輪篩選。共進(jìn)行3輪篩選，移走沒有抗原結(jié)合能力的噬菌粒。
進(jìn)行夾心ELISA實(shí)驗(yàn)，測定抗體的抗原結(jié)合活性。加入50μl 200ng/ml的重組人TNF-α(rhTNF-α)抗原包被酶聯(lián)板，BSA封閉，37℃溫育1h，加入用PBST(KCl2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO21.8mol/L，NaCl 137mmol/L，Tween-20 0.5％，pH7.4)對倍稀釋的噬菌體抗體，37℃孵育2h。洗板，加入HRP標(biāo)記的羊抗人單抗(購自Pharmacia公司)，37℃ 1h。用1％Tween-20的PBS洗板，加底物液顯色，在讀板機(jī)上讀取595納米處的光吸收。根據(jù)計(jì)算陽性率接近20％，確定其中親和力最強(qiáng)的克隆，用于下一步的研究。
將上述挑選出2個(gè)親和力最強(qiáng)的克隆感染E.coli HB2151細(xì)胞(Pharmacia公司)，平板培養(yǎng)，從轉(zhuǎn)化板上挑取單個(gè)菌落，用2×YTAG(含100mg/L氨芐青霉素和2％葡萄糖的2×YT培養(yǎng)液)于30℃培養(yǎng)過夜，以堿裂解法小量提取噬菌粒DNA，PCR擴(kuò)增出ScFv基因片段，并克隆入pUC19載體，進(jìn)行序列測定，包括預(yù)期的VH，VL基因和linker序列。VH基因序列處于linker的上游，VL基因序列處于linker的下游。
將上述親和力較強(qiáng)的含scFv基因的重組噬菌粒菌種接種于5ml LB培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。加至50ml SBAG(含100mg/L氨芐青霉素和2％葡萄糖的SB培養(yǎng)液)中，30℃振蕩培養(yǎng)1h，5000rpm離心15min，棄上清。將沉淀重懸于50ml SBAI(含100mg/L氨芐青霉素和1mmol/L IPTG的SB培養(yǎng)液)中，37℃誘導(dǎo)3h，離心同上。取沉淀懸于5ml新配制的溶菌酶(1g/L)，20％(w/v)蔗糖，30mmol/L Tris-Cl(pH8.0)及1mmol/L EDTA(pH8.0)溶液中，冰浴10min，4℃以12000rpm離心5min，上清即為外周質(zhì)部分。將其冷凍干燥后，存貯于-20℃。臨用前以0.01mol/L PBS溶解至500μl。
上述獲得的單鏈抗體按照常規(guī)方法進(jìn)行Western印跡試驗(yàn)，結(jié)果測得其具有抗原特異性。
實(shí)施例4重新克隆到含有人源恒區(qū)的表達(dá)載體pL101，轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞分別設(shè)計(jì)重鏈和輕鏈的引物，在重鏈引物前端加上XbaI/NheI酶切位點(diǎn)；在輕鏈引物前端加上HindIII/BsiWI酶切位點(diǎn)，然后以ScFv片段為模板，按常規(guī)方法進(jìn)行PCR，獲得帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的重鏈可變區(qū)片段和輕鏈可變區(qū)片段。
將上述重鏈可變區(qū)插入到表達(dá)載體pL101的XbaI/NheI位點(diǎn)中，再用Hind III和Bsi WI將上述抗體輕鏈可變區(qū)插入到插入有重鏈可變區(qū)編碼序列的pL101的HindIII/Bsi WI位點(diǎn)中，構(gòu)建成人源TNF-α抗體的表達(dá)載體。表達(dá)載體pL101購自Invitrogen公司。
上述構(gòu)建的帶有抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入在大腸桿菌DH5α菌株，然后接種于100毫升LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增，用Qiagen公司的超純質(zhì)粒DNA純化試劑盒抽提純化質(zhì)粒DNA。將上述純化的質(zhì)粒DNA采用Invitrogen公司的脂質(zhì)體法試劑盒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，操作參照廠家的說明書進(jìn)行。
轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行連續(xù)9周的選擇，最后在96孔板上進(jìn)行極度稀釋培養(yǎng)，連續(xù)進(jìn)行3次，進(jìn)行單克隆化。
挑出的單克隆細(xì)胞系在RPMI 1641培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，對上清進(jìn)行Western印跡實(shí)驗(yàn)，根據(jù)染色反應(yīng)判斷表達(dá)強(qiáng)度，挑選出8個(gè)表達(dá)較強(qiáng)的克隆作為候選細(xì)胞株。
實(shí)施例5篩選CHO細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度高的克隆將上述篩選得到的高表達(dá)候選克隆培養(yǎng)于10ml的方形細(xì)胞瓶中，采用ELISA法測量抗體的表達(dá)量羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃過夜，經(jīng)2％BSA于37℃封閉2小時(shí)，加入待測的培養(yǎng)上清和標(biāo)準(zhǔn)品(人IgG1)，37℃孵育2小時(shí)，加入HRP-羊抗人IgG(κ)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，37℃孵育1小時(shí)，加入TMB于37℃作用10分鐘，最后用H2SO4終止反應(yīng)，測A450值。測得上述8個(gè)候選克隆的表達(dá)量如下表1抗體基因在CHO細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)度(mg/l)

從表1可以看出，編號為7B3和2A4的細(xì)胞株具有很高的表達(dá)水平(250-290毫克/升)，其中7B3的表達(dá)量達(dá)到了290.7毫克/升。挑選抗體表達(dá)量高的克隆，可進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)并純化，從而獲得大量的全人源的抗TNF-α抗體。
實(shí)施例6全人源TNF-α單克隆抗體對于TNF-α的體外中和作用進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，測定全人源TNF-α單克隆抗體對于TNF-α的結(jié)合活性。加入50μl 200ng/ml的重組人TNF-α(rhTNF-α)抗原包被酶聯(lián)板(R&D公司產(chǎn)品)，BSA封閉，37℃溫育1h，加入用PBST(KCl 2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO41.8mol/L，NaCl 137mmol/L，Tween-20 0.5％，pH7.4)對倍稀釋的全人源TNF-α單克隆抗體，37℃孵育2h。洗板，加入HRP標(biāo)記的鼠抗人單抗(購自Pharmacia公司)，37℃ 1h。用1％Tween-20的PBS洗板，加底物液顯色，在讀板機(jī)上讀取595納米處的光吸收。根據(jù)計(jì)算，陽性率接近90％，說明全人源TNF-α單克隆抗體對于TNF-α具有很高的親和力。
序列表<110>上海中信國健藥業(yè)有限公司<120>全人源腫瘤壞死因子抗體，其制備方法以及藥物組合物<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(119)<223>抗TNF-α抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列<400>1Gln Val Lys Ile Glu Glu Thr Thr Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Met Lys Ile Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Leu Phe Ser Asn His20 25 30Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Ile Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ala35 40 45Ala Glu Leu Arg Ser Lys Thr Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Val Glu50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala65 70 75 80Val Leu Leu Gln Pro Ser Asp Leu Arg Thr Glu Asp Ser Gly Val Tyr85 90 95Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Glu Thr Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser115<210>2<211>107<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(107)<223>抗TNF-α抗體輕鏈可變區(qū)的氨?；蛄?amp;lt;400>2Asn Ile Ile Leu Ser Gln Ser Pro Ala Leu Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Pro Phe Val Gly Ser Ser20 25 30Ile His Trp Tyr Gln Pro Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Ile Leu Ile35 40 45Lys Tyr Ala Ser Glu Thr Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Leu Phe Thr Leu Thr Phe Asn Thr Val Glu Thr65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Leu Phe85 90 95Thr Phe Gly Ser Gly Ser Asn Leu Glu Val Lys100 10權(quán)利要求
1.一種抗TNF-α單克隆抗體，其特征在于，它是全人源的，其重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO1所述的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO2所述的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述的抗TNF-α單克隆抗體的DNA分子，其特征在于，其重鏈可變區(qū)核苷酸編碼SEQ ID NO1所述的序列，輕鏈可變區(qū)核苷酸編碼SEQ IDNO2所述的核苷酸序列。
3.一種藥物組合物，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的單克隆抗體和藥學(xué)上可接受的載體。
4.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的用途，其特征在于，用于制備治療AIDS的藥物。
5.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的用途，其特征在于，用于制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種全人源的抗TNF－α單克隆抗體。所述的單克隆抗體具有特異性強(qiáng)，免疫原性低的特點(diǎn)；本發(fā)明還提供了所述單克隆抗體的制備方法以及含有所述單克隆抗體的藥物組合物。
文檔編號A61P29/00GK1613874SQ200310108440
公開日2005年5月11日 申請日期2003年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月6日
發(fā)明者陳列平 申請人:上海中信國健藥業(yè)有限公司