專利名稱：富含異黃酮化合物的分離蛋白及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及富含異黃酮的植物分離蛋白及其制備方法。
異黃酮存在于各種豆科植物中，包括植物蛋白原料如大豆。對于本發(fā)明來說，這些化合物一般包括黃豆苷、60AC-黃豆苷、黃豆苷原、染料木苷、60AC染料木苷、染料木黃酮、大豆異黃酮、生原禪寧-A、芒柄花黃素和擬雌內(nèi)酯。通常這些化合物與大豆固有的苦味有關(guān)，在生產(chǎn)商品如分離物和濃縮物時，焦點一直集中在如何除去這些物質(zhì)。例如，在傳統(tǒng)的生產(chǎn)大豆分離蛋白的方法中，用堿液介質(zhì)浸取大豆片，大部分異黃酮溶解在浸出液中并在乳清中保持溶解狀態(tài)，用酸沉淀蛋白質(zhì)形成分離物后乳清通常被排掉。通過徹底洗滌分離物通?？梢猿埩粼谒岢恋淼姆蛛x蛋白中的異黃酮。
最近人們認(rèn)識到植物蛋白如大豆中所含的異黃酮能抑制人類癌細胞的生長，如在下列文獻中描述的乳腺癌細胞和前列腺細胞Peterson和Barnes的“Genistein Inhibition of the Growth of Human Breast Cancer CellsIndependence from Estrogen Receptors and the Multi-Drug Resistance Gene”(Biochemical and Biophysical Research Communications，Vol.179，NO. 1，P. 661-667，August 30，1991)，Peterson和Barnes的“Genistein and Biochanin A Inhibit the Growth of Human Prostrate Cancer Cells but not Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Autophosphorylation”，(The Prostate 22:335-345(1993))以及Barnes等人的“Soybeans Inhibit Mammory Tumors in Models of Breast Cancer”(Mutagens and Carcinogens in the Diet P.239-253(1990).)。
上述令人感興趣的異黃酮引起對適合于在膳食中攝取的富含這些化合物的蛋白質(zhì)物料的需求，而在以前生產(chǎn)商品蛋白質(zhì)材料的方法中總是盡可能地除去這些化合物。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種富含異黃酮的分離蛋白及其生產(chǎn)方法。此目的和其它目的在下面詳細描述的本發(fā)明中能夠?qū)崿F(xiàn)。
本發(fā)明涉及一種富含異黃酮的植物分離蛋白及其生產(chǎn)方法，本發(fā)明的方法包括用PH值高于大約蛋白質(zhì)等電點的含水提取劑提取植物蛋白質(zhì)原料得到含有蛋白質(zhì)和異黃酮的水相提取液。然后調(diào)節(jié)水相提取液的PH值至大約蛋白質(zhì)材料的等電點以沉淀蛋白質(zhì)材料。分離沉淀出的蛋白質(zhì)材料，但避免或最大限度地減少對沉淀物的進一步的洗滌以防止失去剩余的異黃酮，提供富含異黃酮的分離物。另外，既然異黃酮容易溶解在用于溶解蛋白質(zhì)的含水提取劑中，那么所采用的蛋白質(zhì)原料與水的特定重量比應(yīng)在提取過程中最大程度地溶解異黃酮。
對本發(fā)明來說，有用的異黃酮具有下列通式
其中R1、R2、R3和R4可選自H、OH和OCH3以及這些化合物的葡糖苷。具體地說，已從植物蛋白質(zhì)原料分離出的這些化合物和其葡糖苷包括黃豆苷、60AC-黃豆苷、黃豆苷原、染料木苷、60AC-染料木苷、染料木黃酮、大豆異黃酮、生原禪寧-A、芒柄花黃素和擬雌內(nèi)酯。本發(fā)明分離物富含的異黃酮優(yōu)選包括黃豆苷、60AC-黃豆苷、黃豆苷原、染料木苷、60AC-染料木苷和染料木黃酮。
盡管本發(fā)明是針對大豆制品進行描述的，而且其方法特別適合于由大豆原料生產(chǎn)的富含異黃酮的分離物，但本發(fā)明方法一般也適用于從包含異黃酮的各種植物蛋白源中生產(chǎn)分離蛋白。
本發(fā)明的起始原料是大豆片，其中所含油已通過溶劑浸取從其中除去。用PH值大于大約蛋白質(zhì)材料等電點的含水提取劑提取大豆片，優(yōu)選的PH值大約為6.0-10.0，最優(yōu)選的PH值大約為6.7-9.7。如果需要，可采用典型的堿性試劑來提高含水提取劑的PH值，提取劑包括氫氧化鈉，氫氧化鉀和氫氧化鈣。所需的異黃酮化合物通常溶解在含水提取劑中，為了最大程度地回收含水提取液中的這些化合物，將薄片與含水提取液的重量比控制至特定的值上以便盡可能多的溶解蛋白質(zhì)材料中固有的異黃酮。
可用各種方式完成蛋白質(zhì)和異黃酮的提取，包括以豆片與含水提取液的重量比為大約5∶1-12∶1的比例對豆片進行逆流提取，其中用初始提取液再提取豆片得到含蛋白質(zhì)和異黃酮的水提液。另外，也可以采用兩步提取法，其中第一步提取豆片與提取劑的重量比為大約8∶1，第二步提取是用新鮮提取劑提取豆片，豆片與提取劑的重量比為大約3∶1-大約6∶1，這樣在這兩步中，兩步加起來的豆片與提取劑的重量比不會超過豆片與提取劑的總重量比即大約11∶1-14∶1。
盡管不是嚴(yán)格的，但提取可在溫度高達大約120°F下進行大約5-60分鐘，優(yōu)選15分鐘。然后通過加入食用酸如醋酸、硫酸、磷酸、鹽酸或任何其它適合的酸性試劑將含有上述異黃酮的蛋白質(zhì)水提液的PH值調(diào)節(jié)至大約蛋白質(zhì)的等電點。大豆蛋白的等電點一般在大約4.0-5.0，優(yōu)選大約4.4-4.6。PH值調(diào)至等電點時沉淀出凝乳狀的蛋白質(zhì)。典型地，在生產(chǎn)傳統(tǒng)的分離蛋白中，從稱為乳清的剩余水提液中分離出酸沉淀的蛋白質(zhì)，然后洗滌或處理以除去殘留的風(fēng)味物。此后將洗滌的分離物脫水以形成蛋白質(zhì)含量(以干基計)大于90%的干燥分離物。反復(fù)進行徹底的洗滌以除去不期望的風(fēng)味，這些風(fēng)味歸因于在大豆中的各種“酚”化合物如異黃酮。
在本發(fā)明中，完全避免或盡量減少蛋白質(zhì)材料的洗滌以便基本上減少蛋白沉淀物中異黃酮的除去，由此提供富含異黃酮的分離物。例如通過避免或盡量減少對沉淀的蛋白質(zhì)材料的洗滌，在干燥的分離蛋白中保留的異黃酮大于兩倍。因此應(yīng)當(dāng)完全避免用水洗滌酸沉淀的蛋白質(zhì)或僅限于用水洗滌一次，在洗滌過程中水與起始蛋白質(zhì)原料的重量比為2∶1-4∶1。由于不洗或少洗酸沉淀的凝乳，得到了富含所需的異黃酮的分離物。
然后結(jié)合離心或濃縮法使酸沉淀的蛋白質(zhì)脫水并用傳統(tǒng)的方法干燥。本發(fā)明不受具體脫水方法的限制，但優(yōu)選采用傳統(tǒng)的干燥技術(shù)如噴霧干燥以形成干燥的分離物。正如下面具體實施例所說明的那樣，用上述方法生產(chǎn)的分離蛋白比傳統(tǒng)的分離物提高了異黃酮的含量。
實施例1為了說明按照本發(fā)明生產(chǎn)的分離蛋白中異黃酮的含量有所增加，首先說明傳統(tǒng)的分離蛋白和其生產(chǎn)方法以表明在傳統(tǒng)的方法中所需異黃酮的回收率。將100磅脫脂大豆片放入提取罐中，用加熱至90°F的1，000磅水提取，該水中加入有足夠量的氫氧化鈣使PH值調(diào)節(jié)至9.7。水與豆片的重量比為10∶1。從提取液中分離出豆片，并用600磅PH值為9.7，溫度90°F的水提取液再次萃取豆片。此第二步萃取的水與豆片的重量比為6∶1。通過離心分離除去豆片，將第一和第二步的提取液合并并用鹽酸調(diào)節(jié)到PH值為4.5。通過離心分離從乳清中分離出酸沉淀的凝乳狀物，然后用是起始原料重量7倍的水洗滌得到分離蛋白。對凝乳狀物、乳清、豆片渣和起始原料中的染料木苷(包括染料木苷、染料木黃酮和60AC-染料木苷)和黃豆苷(包括黃豆苷、黃豆苷原和60AC-黃豆苷)進行分析。用下述方法完成這些異黃酮的分析測定總?cè)玖夏拒蘸忘S豆苷的方法
1.稱出0.25g大豆產(chǎn)品并加入到20ml由80份甲醇、10份水和10份3NHCl組成的提取溶液中。
2.另加20ml4NHCl并將混合物攪拌10分鐘。
3.用冷凝器將溶液回流1小時。
4.冷卻溶液，用Whatman #4濾紙過濾。
5.移出10ml等分試樣，往其中加10ml微孔水(milli pore water)和0.4ml醋酸并混合。
6.將每份溶液注入HPLC柱并通過UV吸收測量上述異黃酮的量。
在表1中列出對沉淀的凝乳狀物、大豆乳清、豆片渣和起始原料中的上述異黃酮的分析值。結(jié)果還給出了從起始原料所含量中回收上述異黃酮的百分率。
表1含量(mg/gm干基)％回收率材料染料木苷黃豆苷染料木苷黃豆苷凝乳狀物0.900.5423％15％乳清3.243.3075％83％豆片渣0.21 0.192％2％起始原料1.721.58上述實施例清楚地說明，在傳統(tǒng)方法中，所需異黃酮大部分富集在乳清中，使大多數(shù)商品分離蛋白中異黃酮的含量低。
實施例2將100磅脫脂大豆片放入提取罐中，用800磅加熱至90°F的水以連續(xù)兩步逆流法提取，所說的水中加有足夠的氫氧化鈣使PH值調(diào)節(jié)至9.7。水與豆片的重量比為8∶1。通過離心分離除去豆片，調(diào)節(jié)水提液至PH值為4.5以便沉淀出蛋白質(zhì)，然后通過離心分離從乳清中分離出蛋白質(zhì)。避免用水洗滌分離的凝乳狀物。用類似于實施例1中描述的方法對凝乳狀物、乳清、豆片渣和起始原料進行分析。這些結(jié)果列于表2中。
表2含量(mg/gm干基)％回收率材料染料木苷黃豆苷染料木苷黃豆苷凝乳狀物2.311.5959％44％乳清1.682.1139％53％豆片渣0.210.282％3％起始原料1.721.58上述回收結(jié)果表明，與實施例1相比，在凝乳狀物中所需異黃酮的量已顯著地增加，由此得到富含異黃酮的大豆分離蛋白。
實施例3同實施例2描述的制備酸沉淀的凝乳狀物，但接著酸沉淀凝乳狀物后，用等于2倍于豆片重量的室溫水洗滌凝乳狀物。如實施例1描述的進行分析，異黃酮的回收率列于表3中。
表3含量(mg/gm干基)％回收率材料染料木苷黃豆苷染料木苷黃豆苷凝乳狀物2.031.3752％38％乳清1.942.3545％59％豆片渣0.310.283％3％起始原料1.721.58回收結(jié)果表明，與實施例1相比，凝乳狀物中異黃酮回收率顯著地增加，由此得到富含異黃酮的大豆分離蛋白。
實施例4按實施例2的描述制備酸沉淀的凝乳，但接著用酸沉淀后，用等于4倍于豆片重量的室溫水洗滌凝乳狀物。由此方法得到的異黃酮回收率列于表4中。
表4含量(mg/gm干基)％回收率材料染料木苷黃豆苷染料木苷黃豆苷凝乳狀物1.801.1246％31％乳清2.202.6351％66％豆片渣0.310.283％3％起始原料1.721.58與實施例1相比，盡管回收數(shù)據(jù)表明了凝乳狀物中異黃酮回收明顯的增加，但回收率比實施例3描述的少。
實施例5用800克90°F的水提取100克脫脂大豆粉。漿液的PH值為6.7。將漿液攪拌5分鐘并離心分離以除去粉渣。用鹽酸調(diào)節(jié)提取液至PH值為4.5并通過離心分離10分鐘從大豆乳清中分離出凝乳狀物。不洗滌凝乳狀物。如實施例1的描述測定各部分中異黃酮的回收率并列于表5中。
表5含量(mg/gm干基)％回收率材料染料木苷黃豆苷染料木苷黃豆苷凝乳狀物2.491.7660％46％乳清1.251.4729％37％豆粉渣0.911.4011％17％起始原料1.721.58可以看出，與實施例1相比，凝乳狀物中異黃酮的量普遍得到提高。
實施例6用800g 90°F的水提取100g脫脂大豆粉。通過加氫氧化鈣調(diào)PH值至9.7。攪拌漿液15分鐘，然后離心分離5分鐘以分離出提取液。通過將粉與300g水混合5分鐘對粉渣進行第二次提取。通過離心分離5分鐘從粉渣中分離出第二次提取液。將第一和第二次的水提液合并并調(diào)PH值至蛋白質(zhì)的等電點4.5。通過離心分離回收酸沉淀的凝乳狀物，按實施例1的描述測定凝乳狀物，乳清和粉渣中異黃酮的回收率。異黃酮的回收列于表6中。
表6含量(mg/gm干基)％回收率材料染料木苷黃豆苷染料木苷黃豆苷凝乳狀物2.231.4857％41％乳清1.772.2741％57％豆粉渣0.210.192％2％起始原料1.721.58顯然，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，可對在此描述的本發(fā)明進行許多的改變和改進。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)富含異黃酮的植物分離蛋白的方法，包括(a)用PH值大于大約原料等電點的含水提取劑提取含有異黃酮的植物蛋白原料得到含有蛋白質(zhì)和異黃酮的水相提取液；(b)調(diào)節(jié)水相提取液的PH值至大約蛋白質(zhì)材料的等電點以便沉淀出蛋白質(zhì)材料；和(c)分離所說的沉淀蛋白質(zhì)材料并避免用水進一步洗滌所說的沉淀物以得到富含異黃酮的分離蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中提取是在PH值大約6.0-10.0下進行的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中提取是在PH值大約6.7-9.7下進行的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中調(diào)節(jié)提取液的PH值至大約4.4-4.6。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用所說的提取劑，以提取劑與原料的重量比為大約5∶1-12∶1的比例提取植物蛋白原料。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中提取植物蛋白原料包括兩步提取，而兩次提取的提取劑與原料的相加重量比不會超過大約11∶1-14∶1的總重量比。
7.一種生產(chǎn)富含異黃酮的植物分離蛋白的方法包括(a)用PH值大于大約原料等電點的含水提取劑提取含有異黃酮的植物蛋白原料以得到含有蛋白質(zhì)和異黃酮的水提液；(b)調(diào)節(jié)水提液的PH值至大約蛋白質(zhì)材料的等電點以便沉淀出蛋白質(zhì)材料；和(c)分離所說的沉淀蛋白材料并用小于約4倍于蛋白材料重量的水洗滌所說的材料以提供富含異黃酮的分離蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中在PH值為大約6.0-10.0下進行提取。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中在PH值為大約6.7-9.7的條件下進行提取。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中調(diào)節(jié)提取液的PH值至大約4.4-4.6。
11.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中用提取劑與原料的重量比為大約5∶1-12∶1的所說提取液提取植物蛋白質(zhì)原料。
12.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中提取植物蛋白質(zhì)原料包括兩步法提取，而兩次提取的提取劑與原料的相加重量比不會超過大約11∶1-14∶1的總重量比。
13.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中用小于約2倍于蛋白質(zhì)材料重量的水洗滌沉淀的蛋白質(zhì)材料。
14.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，包括將富含異黃酮的分離物脫水的步驟。
15.由權(quán)利要求14的方法生產(chǎn)所得的富含異黃酮的分離物。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)富含異黃酮的植物分離蛋白，其中控制原料與提取劑的重量比，避免或盡量減少洗滌酸沉淀的蛋白質(zhì)凝乳狀物以提高分離蛋白中異黃酮的含量。
文檔編號A61K36/185GK1111946SQ94112830
公開日1995年11月22日 申請日期1994年10月12日 優(yōu)先權(quán)日1993年10月12日
發(fā)明者J·L·什恩, B·F·戈瓦拉, F·E·斯帕達弗拉 申請人:蛋白質(zhì)技術(shù)國際公司