專利名稱：具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物材料復(fù)合制備領(lǐng)域，特別涉及一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法。
背景技術(shù)：
軟骨缺損很難自我修復(fù)，給患者造成很大的痛苦。軟骨缺損的修復(fù)是困擾臨床治療的棘手問題，在世界范圍內(nèi)這類患者人數(shù)眾多，且隨著社會(huì)老齡化加劇，軟骨缺損發(fā)病率呈現(xiàn)日益增長的趨勢。臨床上對 軟骨缺損修復(fù)主要采用自體、異體軟骨移植和關(guān)節(jié)假體置換。自體軟骨移植由于軟骨組織的來源有限，極大地限制了此法在臨床上的應(yīng)用。同種異體軟骨移植雖然軟骨組織來源充足，但此法存在一定的免疫排斥問題；另外，移植軟骨與相鄰軟骨間能否達(dá)到牢固結(jié)合仍然是未完全解決的難題。傳統(tǒng)的人工關(guān)節(jié)置換使用年限短，且隨著使用年限的增長，容易產(chǎn)生材料失效、老化等問題；近年來，隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，組織工程化軟骨被認(rèn)為是最有應(yīng)用前景的軟骨修復(fù)方法。組織工程軟骨修復(fù)是以軟骨組織修復(fù)支架為載體，結(jié)合軟骨種子細(xì)胞、生長因子，通過體內(nèi)或體外培養(yǎng)構(gòu)建軟骨組織。在這一過程中軟骨組織修復(fù)支架具有重要作用，它為細(xì)胞、組織的重建提供了必要的三維空間和力學(xué)支持，起到模擬細(xì)胞外基質(zhì)的作用；具有良好的組織相容性，適合的孔徑和孔隙率，利于軟骨細(xì)胞的增殖和黏附，以及營養(yǎng)物質(zhì)的滲入和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的排出；具有良好的生物活性，能夠使修復(fù)重建的軟骨組織與底層自體骨牢固結(jié)合。因此需要軟骨組織修復(fù)支架具有良好的生物活性，適合的力學(xué)性能，理想的三維微觀結(jié)構(gòu)，且具有與正常軟骨組織相符的宏觀形貌。聚乙烯醇(PVA)水凝膠是親水性聚乙烯醇大分子經(jīng)交聯(lián)后形成的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)的水溶脹體。PVA水凝膠具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)、良好的物理機(jī)械性能、易于成型、與人體組織良好的生物相容性，尤其是PVA水凝膠與人體組織性能相似的物理性質(zhì)、對水分子等優(yōu)異的透過性、適宜的擴(kuò)展性、良好的柔韌性等，這些特性使PVA水凝膠可以用作傷口敷料、藥物釋放載體、人造組織、組織工程等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。近年來研究證實(shí)PVA水凝膠具有和人體關(guān)節(jié)軟骨類似的生物力學(xué)性質(zhì)和良好的生物相容性，植入人體后能重建平滑的軟骨面，減輕磨損，部分替代關(guān)節(jié)軟骨，延緩或阻止創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，是一種理想的關(guān)節(jié)軟骨替代材料。但與人關(guān)節(jié)軟骨相比PVA水凝膠沒有生物活性，影響軟骨的固定和修復(fù)功能，且PVA水凝膠的力學(xué)強(qiáng)度較弱，作為組織工程支架使用時(shí)很難控制其外觀形貌和微觀結(jié)構(gòu)。因此為改善PVA水凝膠的性能，本發(fā)明將PVA水凝膠與具有優(yōu)異的賦型能力和力學(xué)性能的細(xì)菌纖維素水凝膠復(fù)合，并通過反應(yīng)加入具有良好生物活性的羥基磷灰石。細(xì)菌纖維素(BC)作為一種優(yōu)良的生物材料，在濕潤狀態(tài)下形成的細(xì)菌纖維素水凝膠具有其獨(dú)特的物理、化學(xué)性能:其具有天然的三維納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；良好的力學(xué)性能；高親水性，良好的透氣、吸水、透水性能:優(yōu)異的賦型能力，可以在細(xì)菌纖維素培養(yǎng)時(shí)精確控制其外觀形貌和微觀結(jié)構(gòu)。同時(shí)，細(xì)菌纖維素還具有良好的體內(nèi)、體外生物相容性和良好的生物可降解性。研究表明，細(xì)菌纖維素水凝膠優(yōu)異的力學(xué)性能(拉伸模量和彈性模量)可以達(dá)到與正常軟骨相似的水平；同時(shí)軟骨細(xì)胞在細(xì)菌纖維素上表現(xiàn)出高水平的生長，并且可以維持軟骨分化、支持軟骨細(xì)胞的遷移增殖。羥基磷灰石是一種磷酸鈣生物陶瓷，具有良好的生物相容性、界面生物活性和骨傳導(dǎo)性、骨結(jié)合能力。在組織工程軟骨修復(fù)中能夠使重建的軟骨組織與底層自體骨牢固結(jié)合。本專利采用計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)、三維快速成型技術(shù)、菌株/石蠟混合發(fā)酵技術(shù)并且將羥基磷灰石的制備與冷凍-解凍法結(jié)合，制備出一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架。該組織工程軟骨修復(fù)支架具有PVA水凝膠網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)與BC水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，同時(shí)羥基磷灰石顆粒均勻鑲嵌在互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)部；得到的支架具有與正常軟骨組織相符的宏觀形貌和力學(xué)性能，良好的生物活性，以及理想的三維多孔結(jié)構(gòu)。本發(fā)明工藝簡單、成本低、無污染，制備的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架可作為組織工程支架材料應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)、半月板修復(fù)等軟骨組織修復(fù)中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法。涉及一種生物材料復(fù)合制備領(lǐng)域。本發(fā)明工藝簡單、成本低、無污染，且制備的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架具有適合的外觀形貌和多孔結(jié)構(gòu)、良好的力學(xué)性能和生物活性，可作為組織工程支架材料應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)、半月板修復(fù)等軟骨組織修復(fù)中。本專利涉及的一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法。包括:
(O 采用計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)對預(yù)期修復(fù)的軟骨組織經(jīng)行掃描，獲得軟骨組織三維結(jié)構(gòu)的數(shù)字模型，利用數(shù)字模型設(shè)計(jì)支架材料內(nèi)部的三維多孔結(jié)構(gòu)，通過布爾運(yùn)算得到其負(fù)型。利用三維快速成型技術(shù)，采用三維快速打印機(jī)，以石蠟粉末為成型材料，制得軟骨修復(fù)支架的石蠟 負(fù)型。(2) 細(xì)菌纖維素發(fā)酵:選取能分泌細(xì)菌纖維素的菌株活化制備成種子醪液，然后將種子醪液均勻滴加在經(jīng)滅菌處理的石蠟負(fù)型上，加入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)6 14d。(3) 發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)石蠟脫除、純化處理和脫水浸潰處理得到含CaCl2水溶液重量百分比為30 50%的細(xì)菌纖維素水凝膠軟骨修復(fù)支架。將聚乙烯醇溶解于Na2HPO4水溶液中，得到混合溶液A。采用浸潰法，使混合溶液A進(jìn)入細(xì)菌纖維素水凝膠軟骨修復(fù)支架內(nèi)部，得到的產(chǎn)物經(jīng)冷凍-解凍數(shù)次，Y-射線輻照處理得到一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架。作為優(yōu)選的技術(shù)方案:
其中，如上所述的一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法，其特征是:所述的設(shè)計(jì)支架材料內(nèi)部的三維多孔結(jié)構(gòu)為每5mmX5mm的加工平面上呈nXn陣列式的微孔，微孔直徑為200 500Mffl，微孔間距不小于200Mffl。計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)設(shè)計(jì)的三維多孔結(jié)構(gòu)，通過石蠟負(fù)型、發(fā)酵培養(yǎng)將最終影響組織工程軟骨修復(fù)支架內(nèi)部的三維多孔結(jié)構(gòu)。在組織工程培養(yǎng)過程中，適合的孔徑和孔隙率，利于軟骨細(xì)胞的增殖和黏附，以及營養(yǎng)物質(zhì)的滲入和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的排出。因此在支架材料多孔結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)時(shí)可以通過調(diào)節(jié)三維多孔的數(shù)量、位置以及微孔的孔徑，控制三維多孔支架的孔徑和孔隙率。如上所述的一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法，其特征是:所述的能分泌細(xì)菌纖維素的菌株是木醋桿菌、根瘤菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、氣桿菌屬或固氮菌屬中的一種或幾種。如上所述的一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法，其特征是:所述的菌株/石蠟混合發(fā)酵方法為:將菌株濃度為50 95%的種子醪液以點(diǎn)陣方式均勻滴加在石蠟負(fù)型上，10 20min后加入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為20 30°C，時(shí)間為6 14d。如上所述的一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法，其特征是:所述的石蠟脫除、純化處理方法為:在50 70°C的溫度下，發(fā)酵產(chǎn)物分別在蒸餾水、異丙醇和無水乙醇中浸泡5 IOmin,然后在70 100°C的溫度下，在重量百分比為4 8%的NaOH水溶液中洗滌4 6h，再用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性。以除去石蠟、細(xì)菌纖維素上的菌體蛋白和粘附在纖維素膜上的殘余培養(yǎng)基。如上所述的一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法，其特征是:所述的脫水浸潰處理方法為，細(xì)菌纖維素經(jīng)高速離心、真空脫水或壓榨脫水后浸泡在CaCl2水溶液中，經(jīng)反復(fù)脫水、浸泡得到含CaCl2水溶液重量百分比為30 50%的細(xì)菌纖維素水凝膠。所述的CaCl2水溶液濃度為50 lOOmmol/L。反復(fù)脫水、浸泡處理可以在不破壞細(xì)菌纖維素水凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上使 CaCl2水溶液進(jìn)入細(xì)菌纖維素內(nèi)部，并去除多余的水分子。如上所述的一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法，其特征是:所述的混合溶液A為聚乙烯醇在60 100°C下溶解于Na2HPO4水溶液中得到的混合溶液，其中聚乙烯醇分子量為2 20萬，醇解度為87 99%，混合溶液A中含聚乙烯醇的重量百分比為10 25% ；Na2HP04水溶液的PO4離子濃度為CaCl2水溶液中Ca離子濃度的
0.5-0.7倍，優(yōu)選0.6倍。CaCl2水溶液與Na2HPO4水溶液相互反應(yīng)可以得到羥基磷灰石顆粒，在這一過程中Ca離子與PO4離子的摩爾比例是得到羥基磷灰石[Caltl(PO4)6(OH)2]的關(guān)鍵。聚乙烯醇-Na2HPO4水溶液進(jìn)入含有CaCl2水溶液的細(xì)菌纖維素水凝膠軟骨修復(fù)支架內(nèi)部，由于細(xì)菌纖維素和聚乙烯醇分子鏈上均具有大量的羥基基團(tuán)能夠促進(jìn)Ca離子的沉積，以細(xì)菌纖維素的纖維素納米纖維為模板，CaCl2與Na2HPO4溶液相互反應(yīng)形成羥基磷灰石顆粒。同時(shí)由于聚乙烯醇分子鏈上羥基基團(tuán)與Ca離子的相互作用促進(jìn)了 PVA分子鏈間的相互作用，形成了類似“物理交聯(lián)點(diǎn)”的結(jié)構(gòu)，有利于PVA水凝膠的形成；并且阻礙了羥基磷灰石顆粒粒徑的增大，有利于提高復(fù)合水凝膠軟骨修復(fù)支架的力學(xué)強(qiáng)度。如上所述的一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法，其特征是:所述的冷凍-解凍方法為在-40 -10°C下，冷凍6 24h，然后在室溫下解凍I 4h。反復(fù)次數(shù)為I 4次。冷凍使細(xì)菌纖維素中PVA的分子鏈的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)被“凍結(jié)”下來，PVA分子鏈在羥基磷灰石顆粒周圍發(fā)生分子鏈間相互作用及鏈纏結(jié)，形成有序結(jié)構(gòu)。解凍后，這些結(jié)合緊密的有序微區(qū)不再分開，成為“纏結(jié)點(diǎn)”。重新凍結(jié)時(shí)又有新的有序微區(qū)形成，這些微區(qū)稱為“物理交聯(lián)點(diǎn)”。用冷凍-解凍法可以促進(jìn)PVA分子運(yùn)動(dòng)，重新排列，通過分子鏈的折疊獲得具有結(jié)晶/半結(jié)晶結(jié)構(gòu)的PVA水凝膠。并且PVA水凝膠網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)與BC水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，同時(shí)羥基磷灰石顆粒均勻鑲嵌在互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)部，從而使復(fù)合水凝膠的物理性能和機(jī)械性能得到很大提高。如上所述的一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法，其特征是:所述的Y-射線輻照處理，其輻照劑量為15 60kGy。在Y-射線輻照處理作用下，聚乙烯醇分子鏈間通過產(chǎn)生的自由基而交聯(lián)在一起，交聯(lián)度隨輻射劑量的增大而增大，水凝膠的交聯(lián)密度增大，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中微孔的尺寸將會(huì)減小，從而使水凝膠的溶脹比、含水量等降低，故通過控制輻射劑量可以實(shí)現(xiàn)對交聯(lián)密度的調(diào)控。因此采用的Y-射線輻照能均勻地作用在PVA上，使PVA的交聯(lián)點(diǎn)分布均勻，并且交聯(lián)度易于控制，能夠進(jìn)一步提高PVA水凝膠的交聯(lián)密度，以使產(chǎn)物達(dá)到人體軟骨組織的力學(xué)性能要求；并且在輻照處理過程中還可同步實(shí)現(xiàn)對軟骨修復(fù)支架的消毒滅菌。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
本專利采用計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)、三維快速成型技術(shù)、菌株/石蠟混合發(fā)酵技術(shù)并且將羥基磷灰石的制備與冷凍-解凍法結(jié)合，制備一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架。該組織工程軟骨修復(fù)支架具有PVA水凝膠網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)與BC水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，同時(shí)羥基磷灰石顆粒均勻鑲嵌在互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)部；得到的軟骨修復(fù)支架具有與正常軟骨組織相符的宏觀形貌和力學(xué)性能，良好的生物活性，以及理想的三維多孔結(jié)構(gòu)。本發(fā)明工藝簡單、成本低、無污染，制備的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架可作為組織工程支架材料應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)、半月板修復(fù)等軟骨組織修復(fù)中。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1:
采用計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)對預(yù)期修復(fù)的軟骨組織經(jīng)行掃描，獲得軟骨組織三維結(jié)構(gòu)的數(shù)字模型。利用數(shù)字模型設(shè)計(jì)支架材料內(nèi)部的三維多孔結(jié)構(gòu)，每5mmX 5mm的加工平面上呈9X9陣列式的微孔，微孔直徑為500μπι，微孔間距不小于200Mffl。設(shè)計(jì)完成的軟骨修復(fù)支架通過布爾運(yùn)算得到其負(fù)型，利用三維快速成型技術(shù)，采用三維快速打印機(jī)，以石蠟粉末為成型材料，制得軟骨修復(fù)支架的石蠟負(fù)型。選取能分泌細(xì)菌纖維素的木醋桿菌，將菌株活化制備成種子醪液，將菌株濃度為50%的種子醪液以點(diǎn)陣方式均勻滴加在石蠟負(fù)型上，IOmin后加入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30°C，時(shí)間為6d。發(fā)酵產(chǎn)物在50°C下，分別在蒸餾水、異丙醇和無水乙醇中浸泡lOmin。然后在重量百分比為4%的NaOH水溶液中，在100°C的溫度下加熱4h，再用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性。將CaCl2溶解于蒸餾水中配制成濃度為50mmol/L的CaCl2A溶液。采用高速離心法對細(xì)菌纖維素進(jìn)行部分脫水，并將其浸泡在CaCl2水溶液中。反復(fù)脫水、浸泡后得到含CaCl2水溶液重量百分比為50%的細(xì)菌纖維素水凝膠軟骨修復(fù)支架。

在60°C下，將分子量為20萬，醇解度為87%的聚乙烯醇溶于30mmol/L的Na2HPO4水溶液中，得到含聚乙烯醇重量百分比為10%的混合溶液A，然后將細(xì)菌纖維素水凝膠浸泡在混合溶液A中。浸潰處理后的復(fù)合物在-10°C下，冷凍6h，在室溫下解凍lh，反復(fù)次數(shù)為4次。然后采用Y-射線輻照處理，輻照劑量為15kGy，得到一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架。
實(shí)施例2:
采用計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)對預(yù)期修復(fù)的軟骨組織經(jīng)行掃描，獲得軟骨組織三維結(jié)構(gòu)的數(shù)字模型。利用數(shù)字模型設(shè)計(jì)支架材料內(nèi)部的三維多孔結(jié)構(gòu)，每5mmX 5mm的加工平面上呈6X6陣列式的微孔，微孔直徑為200μπι，微孔間距不小于200Mffl。設(shè)計(jì)完成的軟骨修復(fù)支架通過布爾運(yùn)算得到其負(fù)型，利用三維快速成型技術(shù)，采用三維快速打印機(jī)，以石蠟粉末為成型材料，制得軟骨修復(fù)支架的石蠟負(fù)型。選取能分泌細(xì)菌纖維素的根瘤菌屬，將菌株活化制備成種子醪液，將菌株濃度為95%的種子醪液以點(diǎn)陣方式均勻滴加在石蠟負(fù)型上，20min后加入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為20°C，時(shí)間為14d。發(fā)酵產(chǎn)物在70°C下，分別在蒸餾水、異丙醇和無水乙醇中浸泡5min。然后在重量百分比為5%的NaOH水溶液中，在90°C的溫度下加熱5h，再用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性。將CaCl2溶解于蒸餾水中配制成濃度為50mmol/L的CaCl2A溶液。采用高速離心、法對細(xì)菌纖維素進(jìn)行部分脫水，并將其浸泡在CaCl2水溶液中。反復(fù)脫水、浸泡后得到含CaCl2水溶液重量百分比為50%的細(xì)菌纖維素水凝膠軟骨修復(fù)支架。在60°C下，將分子量為15萬，醇解度為88%的聚乙烯醇溶于30mmol/L的Na2HPO4水溶液中，得到含聚乙烯醇重量百分比為25%的混合溶液A，然后將細(xì)菌纖維素水凝膠浸泡在混合溶液A中。浸潰處理后的復(fù)合物在_20°C下，冷凍8h，在室溫下解凍2h，反復(fù)次數(shù)為4次。然后采用Y-射線輻照處理，輻照劑量為25kGy，得到一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架。實(shí)施例3:
采用計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)對預(yù)期修復(fù)的軟骨組織經(jīng)行掃描，獲得軟骨組織三維結(jié)構(gòu)的數(shù)字模型。利用數(shù)字模型設(shè)計(jì)支架材料內(nèi)部的三維多孔結(jié)構(gòu)，每5mmX 5mm的加工平面上呈7X7陣列式的微孔，微孔直徑為250Mm，微孔間距不小于200Mffl。設(shè)計(jì)完成的軟骨修復(fù)支架通過布爾運(yùn)算得到其負(fù)型，利用三維快速成型技術(shù)，采用三維快速打印機(jī)，以石蠟粉末為成型材料，制得軟骨修復(fù)支架的石蠟負(fù)型。
`
選取能分泌細(xì)菌纖維素的假單胞菌屬，將菌株活化制備成種子醪液，將菌株濃度為65%的種子醪液以點(diǎn)陣方式均勻滴加在石蠟負(fù)型上，IOmin后加入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為20°C，時(shí)間為12d。發(fā)酵產(chǎn)物在60°C下，分別在蒸餾水、異丙醇和無水乙醇中浸泡IOmin0然后在重量百分比為6%的NaOH水溶液中，在80°C的溫度下加熱6h，再用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性。將CaCl2溶解于蒸餾水中配制成濃度為100mmol/L的CaClpK溶液。采用真空脫水法對細(xì)菌纖維素進(jìn)行部分脫水，并將其浸泡在CaCl2水溶液中。反復(fù)脫水、浸泡后得到含CaCl2水溶液重量百分比為40%的細(xì)菌纖維素水凝膠軟骨修復(fù)支架。在70°C下，將分子量為12萬，醇解度為89%的聚乙烯醇溶于60mmol/L的Na2HPO4水溶液中，得到含聚乙烯醇重量百分比為15%的混合溶液A，然后將細(xì)菌纖維素水凝膠浸泡在混合溶液A中。浸潰處理后的復(fù)合物在_30°C下，冷凍10h，在室溫下解凍3h，反復(fù)次數(shù)為3次。然后采用Y-射線輻照處理，輻照劑量為35kGy，得到一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架。實(shí)施例4:
采用計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)對預(yù)期修復(fù)的軟骨組織經(jīng)行掃描，獲得軟骨組織三維結(jié)構(gòu)的數(shù)字模型。利用數(shù)字模型設(shè)計(jì)支架材料內(nèi)部的三維多孔結(jié)構(gòu)，每5mmX 5mm的加工平面上呈8X8陣列式的微孔，微孔直徑為300μπι，微孔間距不小于200Mffl。設(shè)計(jì)完成的軟骨修復(fù)支架通過布爾運(yùn)算得到其負(fù)型，利用三維快速成型技術(shù)，采用三維快速打印機(jī)，以石蠟粉末為成型材料，制得軟骨修復(fù)支架的石蠟負(fù)型。選取能分泌細(xì)菌纖維素的無色桿菌屬，將菌株活化制備成種子醪液，將菌株濃度為75%的種子醪液以點(diǎn)陣方式均勻滴加在石蠟負(fù)型上，20min后加入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30°C，時(shí)間為10d。發(fā)酵產(chǎn)物在70°C下，分別在蒸餾水、異丙醇和無水乙醇中浸泡5min。然后在重量百分比為7%的NaOH水溶液中，在70°C的溫度下加熱6h，再用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性。將CaCl2溶解于蒸餾水中配制成濃度為100mmol/L的CaClpK溶液。采用真空脫水法對細(xì)菌纖維素進(jìn)行部分脫水，并將其浸泡在CaCl2水溶液中。反復(fù)脫水、浸泡后得到含CaCl2水溶液重量百分比為40%的細(xì)菌纖維素水凝膠軟骨修復(fù)支架。在80°C下，將分子量為10萬，醇解度為90%的聚乙烯醇溶于60mmol/L的Na2HPO4水溶液中，得到含聚乙烯醇重量百分比為10%的混合溶液A，然后將細(xì)菌纖維素水凝膠浸泡在混合溶液A中。浸潰處理后的復(fù)合物在_40°C下，冷凍12h，在室溫下解凍4h，反復(fù)次數(shù)為3次。然后采用Y-射線輻照處理，輻照劑量為45kGy，得到一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架。實(shí)施例5:
采用計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)對預(yù)期修復(fù)的軟骨組織經(jīng)行掃描，獲得軟骨組織三維結(jié)構(gòu)的數(shù)字模型。利用數(shù)字模型設(shè)計(jì)支架材料內(nèi)部的三維多孔結(jié)構(gòu)，每5mmX 5mm的加工平面上呈8X8陣列式的微孔，微孔直徑為400μπι，微孔間距不小于200Mffl。設(shè)計(jì)完成的軟骨修復(fù)支架通過布爾運(yùn)算得到其負(fù)型，利用三維快速成型技術(shù)，采用三維快速打印機(jī)，以石蠟粉末為成型材料，制得軟骨修復(fù)支架的石蠟負(fù)型。選取能分泌細(xì)菌纖維素的產(chǎn)堿菌屬，將菌株活化制備成種子醪液，將菌株濃度為85%的種子醪液以點(diǎn)陣方式 均勻滴加在石蠟負(fù)型上，15min后加入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為25°C，時(shí)間為8d。發(fā)酵產(chǎn)物在60°C下，分別在蒸餾水、異丙醇和無水乙醇中浸泡lOmin。然后在重量百分比為8%的NaOH水溶液中，在80°C的溫度下加熱5h，再用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性。將CaCl2溶解于蒸餾水中配制成濃度為75mmol/L的CaCl2A溶液。采用壓榨脫水法對細(xì)菌纖維素進(jìn)行部分脫水，并將其浸泡在CaCl2水溶液中。反復(fù)脫水、浸泡后得到含CaCl2水溶液重量百分比為30%的細(xì)菌纖維素水凝膠軟骨修復(fù)支架。在100°C下，將分子量為2萬，醇解度為99%的聚乙烯醇溶于45mmol/L的Na2HPO4水溶液中，得到含聚乙烯醇重量百分比為25%的混合溶液A，然后將細(xì)菌纖維素水凝膠浸泡在混合溶液A中。浸潰處理后的復(fù)合物在_40°C下，冷凍16h，在室溫下解凍4h，反復(fù)次數(shù)為2次。然后采用Y-射線輻照處理，輻照劑量為55kGy，得到一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架。實(shí)施例6
采用計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)對預(yù)期修復(fù)的軟骨組織經(jīng)行掃描，獲得軟骨組織三維結(jié)構(gòu)的數(shù)字模型。利用數(shù)字模型設(shè)計(jì)支架材料內(nèi)部的三維多孔結(jié)構(gòu)，每5mmX 5mm的加工平面上呈7X7陣列式的微孔，微孔直徑為500μπι，微孔間距不小于200Mffl。設(shè)計(jì)完成的軟骨修復(fù)支架通過布爾運(yùn)算得到其負(fù)型，利用三維快速成型技術(shù)，采用三維快速打印機(jī)，以石蠟粉末為成型材料，制得軟骨修復(fù)支架的石蠟負(fù)型。
選取能分泌細(xì)菌纖維素的固氮菌屬，將菌株活化制備成種子醪液，將菌株濃度為95%的種子醪液以點(diǎn)陣方式均勻滴加在石蠟負(fù)型上，20min后加入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30°C，時(shí)間為14d。發(fā)酵產(chǎn)物在50°C下，分別在蒸餾水、異丙醇和無水乙醇中浸泡IOmin0然后在重量百分比為6%的NaOH水溶液中，在100°C的溫度下加熱4h，再用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性。將CaCl2溶解于蒸餾水中配制成濃度為75mmol/L的CaCl2水溶液。采用壓榨脫水法對細(xì)菌纖維素進(jìn)行部分脫水，并將其浸泡在CaCl2水溶液中。反復(fù)脫水、浸泡后得到含CaCl2水溶液重量百分比為30%的細(xì)菌纖維素水凝膠軟骨修復(fù)支架。
在100°C下，將分子量為8萬，醇解度為95%的聚乙烯醇溶于45mmol/L的Na2HPO4水溶液中，得到含聚乙烯醇重量百分比為15%的混合溶液A，然后將細(xì)菌纖維素水凝膠浸泡在混合溶液A中。浸潰處理后的復(fù)合物在_40°C下，冷凍24h，在室溫下解凍4h。然后采用Y -射線輻照處理，輻照劑量為60kGy，得到一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架。
權(quán)利要求
1.一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法，包括: (a)采用計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)對預(yù)期修復(fù)的軟骨組織經(jīng)行掃描，獲得軟骨組織三維結(jié)構(gòu)的數(shù)字模型，利用數(shù)字模型設(shè)計(jì)支架材料內(nèi)部的三維多孔結(jié)構(gòu)，通過布爾運(yùn)算得到其負(fù)型，利用三維快速成型技術(shù)，采用三維快速打印機(jī)，以石蠟粉末為成型材料，制得軟骨修復(fù)支架的石蠟負(fù)型； (b)細(xì)菌纖維素發(fā)酵:選取能分泌細(xì)菌纖維素的菌株活化制備成種子醪液，然后將種子醪液均勻滴加在經(jīng)滅菌處理的石蠟負(fù)型上，加入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)6 14d ; (c)發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)石蠟脫除、純化處理和脫水浸潰處理得到含CaCl2水溶液重量百分比為30 50%的細(xì)菌纖維素水凝膠軟骨修復(fù)支架，將聚乙烯醇溶解于Na2HPO4水溶液中，得到混合溶液A，采用浸潰法，使混合溶液A進(jìn)入細(xì)菌纖維素水凝膠軟骨修復(fù)支架內(nèi)部，得到的產(chǎn)物經(jīng)冷凍-解凍數(shù)次，Y-射線輻照處理得到一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架。
2.如權(quán)利要求1，一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法，其特征是:所述的設(shè)計(jì)支架材料內(nèi)部的三維多孔結(jié)構(gòu)為每5mmX5mm的加工平面上呈nXn陣列式的微孔,微孔直徑為200 500Mm,微孔間距不小于200Mm。
3.如權(quán)利要求1，一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法，其特征是:所述的能分泌細(xì)菌纖維素的菌株是木醋桿菌、根瘤菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、氣桿菌屬或固氮菌屬中的一種或幾種。
4.如權(quán)利要求1，一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法，其特征是:所述的菌株/石蠟混合發(fā)酵方法為:將菌株濃度為50 95%的種子醪液以點(diǎn)陣方式均勻滴加在石蠟負(fù)型上，10 20min后加入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為20 30°C，時(shí)間為6 14d。
5.如權(quán)利要求1，一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法，其特征是:所述的石蠟脫除、純化處理方法為:在50 70°C的溫度下，發(fā)酵產(chǎn)物分別在蒸餾水、異丙醇和無水乙醇中浸泡5 lOmin，然后在70 100°C的溫度下，在重量百分比為4 8%的NaOH水溶液中洗滌4 6h，再用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性。
6.如權(quán)利要求1，一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法，其特征是:所述的脫水浸潰處理方法為，細(xì)菌纖維素經(jīng)高速離心、真空脫水或壓榨脫水后浸泡在CaCl2水溶液中，經(jīng)反復(fù)脫水、浸泡得到含CaCl2水溶液重量百分比為30 50%的細(xì)菌纖維素水凝膠，所述的CaCl2水溶液濃度為50 lOOmmol/L。
7.如權(quán)利要求1，一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法，其特征是:所述的混合溶液A為聚乙烯醇在60 100°C下溶解于Na2HPO4水溶液中得到的混合溶液，其中聚乙烯醇分子量為2 20萬，醇解度為87 99%，混合溶液A中含聚乙烯醇的重量百分比為10 25% ；Na2HP04水溶液的PO4離子濃度為CaCl2水溶液中Ca離子濃度的0.5-0.7倍，優(yōu)選0.6倍。
8.如權(quán)利要求1，一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法，其特征是:所述的 冷凍-解凍方法為在-40 -10°C下，冷凍6 24h，然后在室溫下解凍I 4h,反復(fù)次數(shù)為I 4次。
9.如權(quán)利要求1，一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法，其特征是:所述的 Y-射線輻照處理，其輻照劑量為15 60kGy。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架的制備方法。包括制備軟骨修復(fù)支架的石蠟負(fù)型。以石蠟負(fù)型為模板，選取能分泌細(xì)菌纖維素的菌株發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)石蠟脫除、純化和脫水浸漬處理得到含CaCl2水溶液重量百分比為30～50%的細(xì)菌纖維素水凝膠軟骨修復(fù)支架。將聚乙烯醇溶解于Na2HPO4水溶液中，得到混合溶液A。采用浸漬法使混合溶液A進(jìn)入細(xì)菌纖維素水凝膠軟骨修復(fù)支架內(nèi)部，得到的產(chǎn)物經(jīng)冷凍-解凍數(shù)次，γ-射線輻照處理得到一種具有生物活性的復(fù)合水凝膠組織工程軟骨修復(fù)支架材料。本發(fā)明制備的復(fù)合水凝膠具有適合的外觀形貌和多孔結(jié)構(gòu)、良好的力學(xué)性能和生物活性，可作為組織工程支架材料應(yīng)用于軟骨組織修復(fù)中。
文檔編號(hào)A61L27/12GK103143058SQ20131011059
公開日2013年6月12日 申請日期2013年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月1日
發(fā)明者鐘春燕, 其他發(fā)明人請求不公開姓名 申請人:鐘春燕