專利名稱：殺菌、抗菌和抑菌組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含對(duì)羥苯甲酸酯作為活性成分的一種殺菌、抗菌和抑菌組合物，更具體地，本發(fā)明涉及包含對(duì)羥苯甲酸酯作為活性成分的一種殺菌、抗菌和抑菌組合物，該組合物對(duì)細(xì)菌或病毒，例如牙齒生齲性變異鏈球菌、幽門螺桿菌、結(jié)核分支桿菌、流感病毒或單純皰疹病毒有殺菌、抗菌或者滅活活性。
牙齦炎和牙周炎是牙周疾病的代表例子，這些疾病的一個(gè)病因是由于生齲性細(xì)菌所致，這種細(xì)菌的一個(gè)例子是生齲性變異鏈球菌。
近年來報(bào)道胃潰瘍和十二指腸潰瘍是由幽門螺桿菌引起的，其也是一種細(xì)菌所致疾病。隨著患這些潰瘍的患者的增加，迫切需要開發(fā)抗這些細(xì)菌的殺菌劑。
流感典型地已知是由病毒引起的疾病，但是至今尚未開發(fā)出治療流感的有效藥物。
一種更嚴(yán)重的疾病是能致死的HIV誘導(dǎo)的艾滋病(AIDS)，目前迫切需要開發(fā)有效治療AIDS的藥物。
另一方面，對(duì)羥苯甲酸酯很早已被廣泛用作化妝品、藥物、食品的低毒性消毒劑和抗霉劑。
然而，尚不知對(duì)羥苯甲酸酯是否對(duì)上述細(xì)菌或病毒，包括生齲性變異鏈球菌、幽門螺桿菌、流感病毒、HIV、結(jié)核分支桿菌和MRSA細(xì)菌如甲氧苯青霉素抗性金黃色葡萄球菌等有殺菌、抗菌或者抑菌活性。
已知對(duì)羥苯甲酸酯是低毒且對(duì)人體無副作用的化合物，因此，已公認(rèn)對(duì)羥苯甲酸酯是高度安全的藥物。另一優(yōu)點(diǎn)是對(duì)羥苯甲酸酯可以簡(jiǎn)單的方式合成。如果無毒性對(duì)羥苯甲酸酯對(duì)難以消滅的細(xì)菌或病毒具有殺菌、抗菌或抑菌活性，則可預(yù)期這些化合物可以作為治療對(duì)目前的治療有抗性的細(xì)菌或病毒疾病的藥劑。
本發(fā)明人對(duì)于對(duì)羥苯甲酸酯的抗細(xì)菌或病毒方面進(jìn)行了深入的研究，另人驚奇地發(fā)現(xiàn)，對(duì)羥苯甲酸酯顯示出特別有效的消滅或滅活生齲性變異鏈球菌、幽門螺桿菌、流感病毒、HIV、單純皰疹病毒、結(jié)核分支桿菌等的殺菌、抗菌和研究活性，目前對(duì)這些細(xì)菌或病毒缺乏有效的治療方法，因此，對(duì)羥苯甲酸酯可以作為治療或預(yù)防這些感染的優(yōu)選的藥物。另外還發(fā)現(xiàn)，通過將對(duì)羥苯甲酸酯溶于一種溶劑并將該溶液制成液態(tài)、膏狀或膠凍狀藥物制劑，可以更有效地發(fā)揮殺菌、抗菌和抑菌活性。由此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種包含對(duì)羥苯甲酸酯作為活性成分的殺菌、抗菌和抑菌組合物，該組合物對(duì)細(xì)菌或病毒，包括生齲性變異鏈球菌、幽門螺桿菌、結(jié)核分支桿菌、流感病毒、HIV、單純皰疹病毒、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、白色假絲酵母、大腸桿菌和甲氧苯青霉素抗性金黃色葡萄球菌有殺菌、抗菌、抑菌或者滅活活性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供對(duì)羥苯甲酸酯在用于治療和/或預(yù)防細(xì)菌或病毒感染的殺菌、抗菌和抑菌組合物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的組合物包含對(duì)羥苯甲酸酯作為活性成分，這種對(duì)羥苯甲酸酯包括對(duì)羥苯甲酸的低級(jí)烷基酯，其中的烷基組分含有1-4個(gè)碳原子，如甲基、乙基、丙基和丁基酯；芳烷基酯如對(duì)羥苯甲酸的芐基酯。這些酯還可作為兩種或多種的混合物使用。
在對(duì)羥苯甲酸酯中，對(duì)羥苯甲酸乙酯是可商購(gòu)的化合物，其可以通過熟知的程序很容易地合成。對(duì)羥苯甲酸酯如對(duì)羥苯甲酸甲酯、對(duì)羥苯甲酸乙酯、對(duì)羥苯甲酸丙酯和對(duì)羥苯甲酸丁酯也是公知的，其可從已知化學(xué)物質(zhì)3-1585號(hào)的目錄、日本藥學(xué)百科全書、日本食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)、化妝品原材料標(biāo)準(zhǔn)等處查到。這些酯均是無色結(jié)晶或白色結(jié)晶粉末，并具有下列物理化學(xué)和毒理學(xué)性質(zhì)在25℃時(shí)的水中溶解度甲酯 0.25乙酯 0.17丙酯 0.05丁酯 0.02熔點(diǎn)
甲酯 125-128℃乙酯 116-118℃丙酯 95-98℃丁酯 69-72℃在小鼠中的急性毒性，p.o.(LD-50)甲酯 7800mg/kg乙酯 5000mg/kg丙酯 8000mg/kg丁酯 17000mg/kg在小鼠中的亞急性毒性，p.o.在96周(2年)內(nèi)以0.9-1.2g/kg/天的劑量分別將這四種對(duì)羥苯甲酸酯給予小鼠以檢測(cè)亞急性毒性。生長(zhǎng)沒有受到任何影響，表明這些對(duì)羥苯甲酸酯在人和動(dòng)物中的毒性極低。
因?yàn)閷?duì)羥苯甲酸酯顯示出對(duì)生齲性變異鏈球菌(例如變異鏈球菌IFO 13955等)、幽門螺桿菌和結(jié)核分支桿菌的優(yōu)異的殺菌或抗菌活性，所以這些化合物對(duì)預(yù)防和/或治療由牙齒生齲性細(xì)菌如生齲性變異鏈球菌引起的牙周疾病、胃潰瘍或十二指腸潰瘍、結(jié)核等非常有效。
對(duì)羥苯甲酸酯還具有強(qiáng)效的抗流感病毒(例如B型流感病毒、FluV-B、B/Lee/40株；B型流感病毒、FluV-B、Yamagata/16/98株)、HIV(例如HIV-1型(LA1株)等)、單純皰疹病毒(例如HSV-1，VRIII株等)的殺菌、抗菌或抑菌作用。因此，對(duì)羥苯甲酸酯對(duì)預(yù)防和/或治療由這些病毒的感染引起的疾病非常有效。
另外，對(duì)羥苯甲酸酯顯示出強(qiáng)效的抗銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌化膿鏈球菌、白色假絲酵母、大腸桿菌和甲氧苯青霉素抗性金黃色葡萄球菌的殺菌或抗菌活性。因此，對(duì)羥苯甲酸酯對(duì)預(yù)防和/或治療由上述這些細(xì)菌或病毒的感染引起的疾病非常有效。
對(duì)羥苯甲酸酯可以口服給藥或非腸道給藥，非腸道給藥典型地是經(jīng)皮、肌內(nèi)、靜脈或穿腸給藥。
藥物組合物可以通過將作為活性成分的對(duì)羥苯甲酸酯與常規(guī)用于藥物制劑的藥學(xué)可接受載體混合而制備，所述的藥學(xué)可接受載體包括溶劑、增濕劑、賦形劑、崩解劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、抗氧劑、包衣劑、著色劑、矯正劑、表面活性劑、增塑劑等。適于口服給藥的組合物可以以常規(guī)的酏劑、顆粒劑、粉劑、膠囊劑或片劑形式的藥物制劑而給藥。當(dāng)非腸道給予組合物時(shí)，制劑通常采用注射劑、滴劑或栓劑的形式。
除非另有說明，制備上述藥物組合物可采用制備藥物制劑的常規(guī)方法。
溶劑的例子包括單元醇如甲醇、乙醇或丙醇；多元醇如三乙二醇、異丙二醇或丙二醇；聚醇如聚乙二醇或聚丙二醇；以及酯如乳酸甲酯、乳酸乙酯、乳酸丁酯、芐乙酯、乙酸環(huán)己酯、苯甲酸甲酯、苯甲酸丙酯或苯甲酸丁酯。也可采用其它的常規(guī)溶劑如二甲亞砜，只要對(duì)羥苯甲酸酯可溶于其中并且該溶劑對(duì)對(duì)羥苯甲酸酯的預(yù)期的活性不具有負(fù)面影響即可。
增濕劑的例子包括植物油如橄欖油、橙油、芝麻油等、牛脂、石蠟或者多元醇如凡士林。
賦形劑是在藥物組合物中常規(guī)使用的那些賦形劑，其例子包括甘露醇、木糖醇、山梨醇、葡萄糖、精制蔗糖、乳糖、結(jié)晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、磷酸氫鈣、小麥淀粉、大米淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、羧甲基鈉淀粉、糊精等。
崩解劑可以是藥物組合物中通用的任何常規(guī)化合物，其例子包括具有低取代值的羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈣或羧甲基纖維素鈉。
粘合劑的例子包括甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。
潤(rùn)滑劑的例子包括硬脂酸、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣等。
抗氧劑的例子包括二丁基羥基甲苯(BHT)、沒食子酸丙酯等。
包衣劑的例子包括羥基丙基甲基纖維素、羥基丙基纖維素等。
著色劑的例子包括焦油顏料、氧化鈦等。
矯正劑的例子包括檸檬酸、己二酸、抗壞血酸、薄荷醇等。
表面活性劑的例子包括聚氧乙烯硬化的蓖麻油、單硬脂酸甘油酯、單硬脂酸山梨聚糖酯、單月桂酸山梨聚糖酯聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、聚山梨酸酯、十二烷基硫酸鈉、macrogols、脂肪酸蔗糖酯等。
增塑劑的例子包括檸檬酸三乙酯、十六醇三乙酸甘油酯等。
優(yōu)選使用這些常規(guī)用于藥物組合物的載體和添加劑將對(duì)羥苯甲酸酯制備成藥物制劑如溶液、酏劑、片劑、注射劑等。
根據(jù)本發(fā)明，組合物的優(yōu)選例子是溶液、酏劑、膏狀或膠凍狀形式的藥物制劑，其可通過將對(duì)羥苯甲酸酯溶于上述溶劑而得到。
更具體地，本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選采用將對(duì)羥苯甲酸酯溶于乙醇或丙二醇與水的溶劑混合物中得到的溶液?；蛘撸梢詫?duì)羥苯甲酸酯溶于聚乙二醇或乙醇中形成溶液，得到的溶液是優(yōu)選的藥物組合物。由此得到的溶液還可以常規(guī)方式處理以形成膏狀或膠凍狀的藥物制劑，膏狀或膠凍狀制劑也是本發(fā)明所優(yōu)選的。
上述在溶劑中的對(duì)羥苯甲酸酯溶液也可與常規(guī)或商購(gòu)可得的含漱劑、飲料、噴霧劑、牙膏等形成混合物而用藥。對(duì)羥苯甲酸酯溶液還可摻入口香糖、潤(rùn)喉糖或者原料藥或其它藥物中。
對(duì)羥苯甲酸酯的劑量可根據(jù)患者的狀態(tài)和疾病種類而變化，但通常對(duì)于成人的日劑量為100-200毫克。組合物中的對(duì)羥苯甲酸酯的含量也可根據(jù)制劑類型、欲治療的疾病等變化，但通常為50-200毫克。
包含對(duì)羥苯甲酸酯為活性成分的組合物顯示出未預(yù)料到的抗細(xì)菌或病毒如變異鏈球菌、幽門螺桿菌、結(jié)核分支桿菌、流感病毒、單純皰疹病毒等的強(qiáng)效的殺菌、抗菌和抑菌活性，因此，本發(fā)明的組合物對(duì)于治療和/或預(yù)防由這些細(xì)菌或病毒引起的疾病是非常有用的。
以下將參照實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。實(shí)施例1對(duì)于變異鏈球菌的殺菌功效1)藥物組合物的制備分別制備具有下表1組成的對(duì)羥苯甲酸酯溶液。
表1組成活性成分 載體組合物化合物 用量(％(體積))化合物用量(％(體積))A對(duì)羥苯甲酸丙酯0.05乙醇 10水 90B對(duì)羥苯甲酸乙酯0.05乙醇 10水 90C對(duì)羥苯甲酸甲酯0.05乙醇 10水 90D對(duì)羥苯甲酸丙酯0.025 乙醇 10水 90對(duì)羥苯甲酸乙酯0.025E對(duì)羥苯甲酸丙酯0.025 乙醇 10水 90對(duì)羥苯甲酸甲酯0.025F對(duì)羥苯甲酸丙酯0.015 乙醇 10水 90對(duì)羥苯甲酸乙酯0.015對(duì)羥苯甲酸甲酯0.02G對(duì)羥苯甲酸丙酯0.05丙二醇 10水 90H對(duì)羥苯甲酸乙酯0.05丙二醇 10水 90I對(duì)羥苯甲酸甲酯0.05丙二醇 10水 902)方法將測(cè)試菌株變異鏈球菌IFO 13955(其是生齲性變異鏈球菌)于35℃在瓊脂培養(yǎng)基(Eiken Kagaku K.K.)上培養(yǎng)18-24小時(shí)后，將細(xì)胞以約108個(gè)細(xì)胞/毫升懸浮于無菌磷酸鹽緩沖液中。
將每個(gè)1ml細(xì)胞懸液加入到每個(gè)10ml的上述表1所示的組合物A-I中并與之混合，混合物在20℃作用預(yù)定一段時(shí)間。作用開始后30秒、1、5、10和30分鐘后分別從試管中取一環(huán)混合物涂布于用于后培養(yǎng)的培養(yǎng)基SCDLP(Nippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)上。在35℃培養(yǎng)2天后，觀察測(cè)試菌株是否生長(zhǎng)，以確定細(xì)菌的存活或死亡。
為進(jìn)行對(duì)比，以類似方式測(cè)試無菌水。3)結(jié)果結(jié)果示于表2，其中+號(hào)代表細(xì)菌未死亡，-號(hào)代表細(xì)菌死亡。
表2測(cè)試結(jié)果細(xì)菌組合物 細(xì)菌的存活或死亡30秒 1分鐘 5分鐘 10分鐘 30分鐘生齲性A + + - - -變異 B + + + - -鏈球菌C + + + + -D + + - - -E + + - - -F + + - - -G + + - - -H + + - - -I + + - - -對(duì)照*+ + + + +*使用無菌蒸餾水表2的結(jié)果揭示包含對(duì)羥苯甲酸酯作為活性成分的組合物對(duì)于生齲性變異鏈球菌顯示出強(qiáng)效的殺菌活性。實(shí)施例2對(duì)于幽門螺桿菌和結(jié)核分支桿菌的殺菌功效1)藥物組合物的制備以溶液形式制備包含對(duì)羥苯甲酸酯并具有下表3配方的組合物。
表3藥物制劑的組成活性成分 載體組合物 化合物用量(％(體積))化合物用量(％(體積))A 對(duì)羥苯甲酸乙酯 1丙二醇 99B 對(duì)羥苯甲酸丁酯 1丙二醇 99C 對(duì)羥苯甲酸甲酯 1丙二醇 99D 對(duì)羥苯甲酸丙酯 1丙二醇 99E 對(duì)羥苯甲酸乙酯 1乙醇 99F 對(duì)羥苯甲酸丁酯 1乙醇 99G 對(duì)羥苯甲酸丁酯 1乙醇 99H 對(duì)羥苯甲酸丙酯 1乙醇 992)方法使用三株結(jié)核分支桿菌臨床菌株和三株幽門螺桿菌臨床菌株。預(yù)培養(yǎng)測(cè)試菌株后，用無菌生理鹽水以108CFU/ml將每種培養(yǎng)基稀釋，其作為細(xì)菌稀釋液用于測(cè)試。用無菌蒸餾水將每種表3的組合物A-H調(diào)整至濃度為0.5％，將1ml細(xì)菌溶液加到9ml由此制備的藥物組合物，混合后立即進(jìn)行測(cè)試。每種混合物保持30分鐘。
當(dāng)使用幽門螺桿菌臨床菌株時(shí)，混合物作用預(yù)定一段時(shí)間后，將一環(huán)混合物涂布于Columbia綿羊血瓊脂培養(yǎng)基(BBL)上，在10％CO2中于35℃培養(yǎng)4天。用無菌生理鹽水進(jìn)行相同程序以用作對(duì)照。隨后觀察確定細(xì)菌是否生長(zhǎng)。
當(dāng)使用結(jié)核分支桿菌臨床菌株時(shí)，混合物作用預(yù)定一段時(shí)間后，將一環(huán)混合物涂布于MYCOBACTERIA 7H11 AGAR(DIFCO)上，隨后在35℃有氧培養(yǎng)3周。用無菌生理鹽水進(jìn)行相同程序以用作對(duì)照。隨后觀察確定細(xì)菌是否生長(zhǎng)。
當(dāng)培養(yǎng)后未見細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)，則斷定組合物具有殺菌功效。3)結(jié)果對(duì)于幽門螺桿菌臨床菌株的殺菌功效結(jié)果示于下表4。
表4測(cè)試結(jié)果組合物幽門螺桿菌菌株(1)菌株(2)菌株(3)A - - -B - - -C - - -D - - -E - - -F - - -G - - -H - - -I - - -對(duì)照*+ + +*使用無菌生理鹽水作為對(duì)照。+觀察到細(xì)菌生長(zhǎng)-未觀察到細(xì)菌生長(zhǎng)表4的結(jié)果揭示包含對(duì)羥苯甲酸酯作為活性成分的組合物對(duì)于幽門螺桿菌顯示出強(qiáng)效的殺菌活性。
對(duì)于結(jié)核分支桿菌臨床菌株的殺菌功效結(jié)果示于下表5。
表5測(cè)試結(jié)果組合物 結(jié)核分支桿菌菌株(1) 菌株(2)菌株(3)A +*+*+*B - - -C +*+*+*D +*- -E - - -F - - -G - - -H - - -I - - -對(duì)照*+ + +- - - - - - - - - - - - - - - - - - - -*使用無菌生理鹽水作為對(duì)照+觀察到細(xì)菌生長(zhǎng)-未觀察到細(xì)菌生長(zhǎng)+*觀察到細(xì)菌生長(zhǎng)但是細(xì)菌量降至對(duì)照(生理鹽水)的1/20以下表5的結(jié)果揭示包含對(duì)羥苯甲酸酯作為活性成分的組合物對(duì)于結(jié)核分支桿菌顯示出強(qiáng)效的殺菌活性。實(shí)施例3滅活HIV的效果1)組合物的制備通過將1％對(duì)羥苯甲酸丁酯或1％對(duì)羥苯甲酸甲酯與1％二甲亞砜和98％水混合，以溶液形式制成含對(duì)羥苯甲酸丁酯的組合物A和含對(duì)羥苯甲酸甲酯的組合物B。2)方法HIV-1型(LAI株)和MT-4細(xì)胞用于測(cè)試。在CO2培養(yǎng)器(5％CO2)中于37℃在10％補(bǔ)加FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
用水稀釋組合物A和B以制成具有表6所示濃度的稀釋的組合物，將每種如此獲得的組合物與等量的病毒溶液混合，隨后在室溫培養(yǎng)60分鐘。用96孔微滴定板在MT-4細(xì)胞中測(cè)定TCID50/200μl，由此定量確定存活病毒的感染滴度。接種病毒5天后測(cè)定感染滴度，每孔細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1×105細(xì)胞/200μl。3)結(jié)果組合物對(duì)滅活HIV的效果示于下表6。
表6HIV滅活的結(jié)果組合物活性成分的終濃度(％)滅活效果(TCID50/100μl)A 0.5 101.50.05 102.17B 0.5 102.320.05 103.17對(duì)照*- 103.5*用生理鹽水作為對(duì)照。
由表6的結(jié)果可以清楚地看出，對(duì)羥苯甲酸乙酯顯示出依賴濃度的強(qiáng)效的抗HIV的滅活效果。實(shí)施例4滅活單純皰疹病毒I的效果1)組合物的制備通過將0.5％對(duì)羥苯甲酸丁酯、60.0％水、20.0％乙醇和20％丙二醇混合，以溶液形式制成含對(duì)羥苯甲酸丁酯作為活性成分的組合物。2)方法將1)中制備的組合物以固定的混合比率與病毒溶液混合并在室溫保持接觸，隨后進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋1-107倍。將稀釋液接種到培養(yǎng)細(xì)胞。
培養(yǎng)5天后，用細(xì)胞病理效應(yīng)(CPE)作為指標(biāo)測(cè)定病毒感染滴度(TCID50/25μl)以評(píng)價(jià)組合物抗病毒效果。
單純皰疹病毒I(HSV-1，VRIII株)用作病毒，Vero細(xì)胞用作培養(yǎng)細(xì)胞。
將病毒接種到置于75cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)細(xì)胞并在37℃吸附1小時(shí)，隨后向該體系中加入2％補(bǔ)加FCS的Eagle’sMEM培養(yǎng)基，并在37℃培養(yǎng)。
當(dāng)CPE達(dá)到75％或更多時(shí)，將培養(yǎng)物上清和感染細(xì)胞凍干，隨后融化，重復(fù)凍融循環(huán)3次后，以3000rpm于4℃離心20分鐘，得到的上清用作病毒溶液。
將1)中制備的組合物和用于對(duì)照的70％乙醇與每種病毒溶液分別以1∶4、1∶9和1∶99的比率混合，在室溫保持接觸1小時(shí)。重復(fù)同樣的步驟，只是用2％補(bǔ)加FCS的Eagle’s MEM培養(yǎng)基代替組合物，得到的溶液用作對(duì)照病毒溶液。另外，用2％補(bǔ)加FCS的Eagle’s MEM培養(yǎng)基代替病毒溶液進(jìn)行相同評(píng)價(jià)，由此證實(shí)細(xì)胞毒性。
將各種混合比率的組合物和病毒溶液的混合物用2％補(bǔ)加FCS的Eagle’s MEM培養(yǎng)基進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋1-107倍。每種稀釋系列接種到96孔微滴定板的4孔細(xì)胞中(25μl/孔)。當(dāng)HSV-1接種到Vero細(xì)胞后，測(cè)定病毒的感染滴度TCID50/20μl。通過與同時(shí)測(cè)定的病毒對(duì)照的感染滴度相比較，組合物對(duì)病毒的效果得以評(píng)價(jià)。
為判斷在上述測(cè)試中有效的混合比率，將混合物進(jìn)一步在室溫接觸0、5、15和30分鐘以評(píng)價(jià)滅活效果。3)結(jié)果將上述1)中制備的組合物和70％乙醇與HIV-1病毒溶液分別以1∶4、1∶9和1∶99的比率混合，在室溫保持接觸1小時(shí)，病毒感染滴度示于表7。
表7接觸1小時(shí)時(shí)的病毒感染滴度(TCID50/25μl)組合物∶病毒溶液對(duì)羥苯甲酸丁酯 70％乙醇病毒對(duì)照*11∶4≤3.2×1013.2×1045.6×1041∶9≤3.2×1005.6×1043.2×1041∶99 1.8×1041.0×1053.2×104*1用2％補(bǔ)加FCS的Eagle’s MEM培養(yǎng)基代替組合物以作為病毒對(duì)照。
由表7的結(jié)果可以看出，當(dāng)組合物與病毒溶液的混合比率為1∶4和1∶9時(shí)，與病毒對(duì)照相比滅活效果顯著。
接著，將組合物與病毒溶液的混合比率設(shè)定為在上述測(cè)試中顯示有效的1∶9，并將接觸時(shí)間縮短以證實(shí)滅活效果。
在各種接觸時(shí)間時(shí)的病毒感染滴度示于表8。
表8在各種接觸時(shí)間時(shí)的病毒感染滴度(TCID50/25μl)接觸時(shí)間對(duì)羥苯甲酸丁酯70％乙醇 病毒對(duì)照*10分鐘 5.6×1033.2×1041.8×1045分鐘 3.2×1003.2×1043.2×10415分鐘 3.2×1001.8×1041.8×10430分鐘 3.2×1001.8×1035.6×1041小時(shí) 3.2×1005.6×1043.2×104*1用2％補(bǔ)加FCS的Eagle’s MEM培養(yǎng)基代替組合物以作為病毒對(duì)照。
由表8的結(jié)果可以看出，當(dāng)組合物與病毒溶液接觸后立即(0分鐘)觀察，不能有效地滅活病毒，但是當(dāng)接觸5分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，足以達(dá)到滅活效果。實(shí)施例5對(duì)流感病毒B的滅活效果1)組合物的制備通過將0.5％對(duì)羥苯甲酸丁酯、60.0％水、20.0％乙醇和20％丙二醇混合，以溶液形式制成含對(duì)羥苯甲酸丁酯作為活性成分的組合物。2)方法將1)中制備的組合物以固定的混合比率與病毒溶液混合并在室溫保持接觸，隨后進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋1-107倍。將稀釋液接種到培養(yǎng)細(xì)胞。
培養(yǎng)5天后，用細(xì)胞病理效應(yīng)(CPE)作為指標(biāo)測(cè)定病毒感染滴度(TCID50/25μl)以評(píng)價(jià)組合物抗病毒效果。
流感病毒B(FluV-B，B/Lee/40株)作為病毒，MDCK細(xì)胞作為培養(yǎng)細(xì)胞。
將病毒接種到置于75cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)細(xì)胞并在37℃吸附1小時(shí)，隨后向該體系中加入用于分離流感病毒的培養(yǎng)基，并在37℃培養(yǎng)。
當(dāng)CPE達(dá)到75％或更多時(shí)，將培養(yǎng)物上清以3000rpm于4℃離心20分鐘，得到的上清用作病毒溶液。
將1)中制備的組合物和用于對(duì)照的70％乙醇與每種病毒溶液分別以1∶4、1∶9和1∶99的比率混合，在室溫保持接觸1小時(shí)。重復(fù)同樣的步驟，只是用2％補(bǔ)加FCS的Eagle’s MEM培養(yǎng)基代替組合物，得到的溶液用作對(duì)照病毒溶液。另外，用2％補(bǔ)加FCS的Eagle’s MEM培養(yǎng)基代替病毒溶液進(jìn)行相同評(píng)價(jià)，由此證實(shí)細(xì)胞毒性。
將各種混合比率的組合物和病毒溶液的混合物用2％補(bǔ)加FCS的Eagle’s MEM培養(yǎng)基進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋1-107倍。每種稀釋系列接種到96孔微滴定板的4孔細(xì)胞中(25μl/孔)。當(dāng)FluV-B接種到MDCK細(xì)胞后，測(cè)定病毒的感染滴度TCID50/20μl。通過與同時(shí)測(cè)定的病毒對(duì)照的感染滴度相比較，組合物對(duì)病毒的效果得以評(píng)價(jià)。
為判斷在上述測(cè)試中有效的混合比率，將混合物進(jìn)一步在室溫接觸0、5、15和30分鐘以評(píng)價(jià)滅活效果。3)結(jié)果將上述1)中制備的組合物和70％乙醇與FluV-B病毒溶液分別以1∶4、1∶9和1∶99的比率混合，在室溫保持接觸1小時(shí)，病毒感染滴度示于表9。
表9接觸1小時(shí)時(shí)的病毒感染滴度(TCID50/25μl)組合物∶病毒溶液對(duì)羥苯甲酸丁酯70％乙醇 病毒對(duì)照*11∶4 ≤3.2×1005.6×1035.6×1031∶9 ≤3.2×1003.2×1035.6×1031∶993.2×1033.2×1033.2×103*1用2％補(bǔ)加FCS的Eagle’s MEM培養(yǎng)基代替組合物以作為病毒對(duì)照。
由表9的結(jié)果可以看出，當(dāng)組合物與病毒溶液的混合比率為1∶4和1∶9時(shí)，與病毒對(duì)照相比滅活效果顯著。
接著，將組合物與病毒溶液的混合比率設(shè)定為在上述測(cè)試中顯示有效的1∶9，并將接觸時(shí)間縮短以證實(shí)滅活效果。
在各種接觸時(shí)間時(shí)的病毒感染滴度示于表10。
表10在各種接觸時(shí)間時(shí)的病毒感染滴度(TCID50/25μl)接觸時(shí)間對(duì)羥苯甲酸丁酯 70％乙醇 病毒對(duì)照*10分鐘 3.2×1001.8×1031.8×1035分鐘 3.2×1001.8×1031.8×10315分鐘 3.2×1001.8×1033.2×10330分鐘 3.2×1003.2×1033.2×1031小時(shí) 3.2×1005.6×1035.6×103*1用2％補(bǔ)加FCS的Eagle’s MEM培養(yǎng)基代替組合物以作為病毒對(duì)照。
由表10的結(jié)果可以看出，當(dāng)組合物與病毒溶液接觸后立即具有滅活效果。實(shí)施例6對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌和白色假絲酵母的殺菌功效1)藥物組合物的制備以溶液形式制備含有對(duì)羥苯甲酸酯并具有表11所示組成的組合物。
表11藥物制劑的組成活性成分 載體組合物 化合物 用量(％(體積)) 化合物用量(％(體積))A 對(duì)羥苯甲酸丁酯 0.05 聚乙二醇 99.95B 對(duì)羥苯甲酸乙酯 0.05 聚乙二醇 99.95C 對(duì)羥苯甲酸甲酯 0.05 聚乙二醇 99.95D 對(duì)羥苯甲酸丙酯 0.05 聚乙二醇 99.952)方法采用銅綠假單胞菌IFO 13275、金黃色葡萄球菌IFO 12732、化膿鏈球菌IID 712和白色假絲酵母IFO 1594作為測(cè)試菌株。
當(dāng)采用銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌時(shí)，將每種測(cè)試菌株在瓊脂培養(yǎng)基(EikenKagaku K.K.)中于35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)。將細(xì)胞以約108細(xì)胞/ml懸浮于無菌磷酸鹽緩沖溶液中。
當(dāng)采用化膿鏈球菌時(shí)，將測(cè)試菌株在腦心灌注瓊脂培養(yǎng)基(Difco)中于35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)。將細(xì)胞以約108細(xì)胞/ml懸浮于無菌磷酸鹽緩沖溶液中。
當(dāng)采用白色假絲酵母時(shí)，將測(cè)試菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Eiken KagakuK.K.)中于25℃培養(yǎng)2天。將細(xì)胞以約107細(xì)胞/ml懸浮于無菌磷酸鹽緩沖溶液中。
當(dāng)將1ml每種細(xì)胞懸液加到10ml每種上表11所示的組合物A-D并與之混合后，將混合物在20℃作用預(yù)定一段時(shí)間。在活性開始后5、15和30分鐘從試管中取一環(huán)混合物并涂布在后培養(yǎng)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)后，觀察測(cè)試菌株是否生長(zhǎng)，以確定細(xì)菌的存活或死亡。SCDLP(Nippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)用作為銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和化膿鏈球菌的后培養(yǎng)培養(yǎng)基，后培養(yǎng)在35℃進(jìn)行2天。GPLP培養(yǎng)基(Nippon PharmaceuticalCo.，Ltd.)用作為白色假絲酵母的后培養(yǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)在25℃進(jìn)行7天。
以相似方式測(cè)試無菌水作為對(duì)照。3)結(jié)果結(jié)果示于表12，其中+號(hào)代表細(xì)菌未死亡，-號(hào)代表細(xì)菌死亡。
表12測(cè)試結(jié)果細(xì)菌 組合物細(xì)菌的存活或死亡5分鐘10分鐘 30分鐘銅綠A ---假單胞菌B ---C ---D ---對(duì)照*++-- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -金黃色 A ---葡萄球菌B ---C ---D ---對(duì)照*++-- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -化膿A ---鏈球菌 B ---C ---D ---對(duì)照*++-- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -白色假絲A ---酵母B ---C ---D ---對(duì)照*++-- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -*用無菌水作為對(duì)照。
表12的結(jié)果表明對(duì)羥苯甲酸酯顯示出對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌和白色假絲酵母的強(qiáng)效的殺菌作用。實(shí)施例7對(duì)大腸桿菌和甲氧苯青霉素抗性金黃色葡萄球菌的殺菌功效1)組合物的制備分別制備具有下表13所示的組成的對(duì)羥苯甲酸酯溶液。
表13組成活性成分 載體組合物 化合物 用量(％(體積))化合物用量(％(體積))A 對(duì)羥苯甲酸甲酯 0.5乙醇 70水 30B 對(duì)羥苯甲酸乙酯 0.5乙醇 70水 30C 對(duì)羥苯甲酸丙酯 0.5乙醇 70水 30D 對(duì)羥苯甲酸丁酯 0.05 丙二醇 99.95E 對(duì)羥苯甲酸丁酯 0.05 丙二醇 99.95F 對(duì)羥苯甲酸丁酯 0.05 丙二醇 30乙醇 702)方法測(cè)試使用大腸桿菌IFO 3301和甲氧苯青霉素抗性金黃色葡萄球菌NS 462(MRSA)(菌株保藏于日本食物組合物中心基金會(huì))。
測(cè)試菌株在次級(jí)培養(yǎng)基(0.2％補(bǔ)加肉膏的bouillon培養(yǎng)基，Eiken Kagaku K.K.)中進(jìn)行次級(jí)培養(yǎng)至傳代3-4代，然后轉(zhuǎn)移到同種培養(yǎng)基中并在35℃培養(yǎng)24小時(shí)。由此獲得細(xì)菌溶液。
當(dāng)將1ml每種細(xì)胞懸液加到10ml每種上表11所示的組合物A-F并與之混合后，將混合物在20℃作用預(yù)定一段時(shí)間。對(duì)于組合物A-C和E，在活性開始后1和5分鐘從試管中取一環(huán)混合物并涂布在后培養(yǎng)培養(yǎng)基SCDLP(Nippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)中，對(duì)于組合物D和F，在活性開始后30和60分鐘從試管中取一環(huán)混合物并涂布在后培養(yǎng)培養(yǎng)基SCDLP(Nippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)中。在35℃培養(yǎng)2小時(shí)后，觀察測(cè)試菌株是否生長(zhǎng)，以確定細(xì)菌的存活或死亡。
以相似方式測(cè)試無菌水作為對(duì)照。3)結(jié)果結(jié)果示于表14，其中+號(hào)代表細(xì)菌未死亡，-號(hào)代表細(xì)菌死亡。
表14測(cè)試結(jié)果細(xì)菌 組合物細(xì)菌的存活或死亡1分鐘 5分鐘 30分鐘 60分鐘大腸桿菌 A - - NT NTB + - NT NTC - - NT NTD NT NT - -E + - NT NTF NT NT - -對(duì)照*+ + + +- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -MRSA A - - NT NTB + - NT NTC - - NT NTD NT NT - -E + - NT NTF NT NT - -對(duì)照*+ + + +- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -*用無菌水作為對(duì)照。NT未測(cè)試由上述數(shù)據(jù)證明，對(duì)羥苯甲酸酯是安全的，并且對(duì)于很難消滅或預(yù)防的細(xì)菌或病毒顯示出強(qiáng)效的殺菌、抗菌或抑菌活性。
權(quán)利要求
1.一種包含對(duì)羥苯甲酸酯作為活性成分的殺菌、抗菌或抑菌組合物，其顯示出對(duì)生齲性變異鏈球菌、幽門螺桿菌、結(jié)核分支桿菌、流感病毒、HIV、單純皰疹病毒、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、白色假絲酵母、大腸桿菌和甲氧苯青霉素抗性金黃色葡萄球菌有殺菌、抗菌或抑菌活性。
2.權(quán)利要求1的殺菌、抗菌和抑菌組合物，用于治療和/或預(yù)防由生齲性變異鏈球菌、幽門螺桿菌、結(jié)核分支桿菌、流感病毒、HIV、單純皰疹病毒、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、白色假絲酵母、大腸桿菌或甲氧苯青霉素抗性金黃色葡萄球菌的感染而導(dǎo)致的疾病。
3.權(quán)利要求2的殺菌、抗菌和抑菌組合物，其是液態(tài)、膏狀或膠凍狀形式。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的殺菌、抗菌和抑菌組合物，進(jìn)一步含有一種溶劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了高度安全無毒的對(duì)羥苯甲酸酯，如對(duì)羥苯甲酸甲酯、乙酯和丁酯，其對(duì)缺乏任何有效藥物的生齲性變異鏈球菌、幽門螺桿菌、結(jié)核分支桿菌、流感病毒、HIV、單純皰疹病毒和其它細(xì)菌和病毒具有強(qiáng)效的殺菌、抗菌或抑菌活性，其對(duì)于治療或預(yù)防由這些細(xì)菌或病毒導(dǎo)致的疾病特別有效。
文檔編號(hào)A61P1/02GK1167567SQ97100588
公開日1997年12月17日 申請(qǐng)日期1997年1月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月7日
發(fā)明者菱田巖 申請(qǐng)人:菱田巖