專利名稱：一類熒光分子影像探針與磁/熒光雙模態(tài)分子影像探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類熒光分子影像探針與磁/熒光雙模態(tài)分子影像探針及其制備方法。
背景技術(shù)：
分子影像技術(shù)可以在分子水平上實(shí)現(xiàn)生物有機(jī)體生理和病理變化的在體、實(shí)時(shí)、 動(dòng)態(tài)、無創(chuàng)的三維成像，融合不同影像的雙、多模態(tài)技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)不同影像設(shè)備的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)， 從而減少假陽性和假陰性，使獲取的診斷結(jié)果更為精準(zhǔn)。多模態(tài)分子探針的構(gòu)筑則是有效提高成像質(zhì)量及腫瘤診斷準(zhǔn)確率的重要途徑。雙、多模態(tài)融合已成為生物醫(yī)學(xué)成像的發(fā)展趨勢(shì)，多模態(tài)分子探針的介入使得分子影像從一項(xiàng)技術(shù)演變?yōu)橐婚T新的學(xué)科，并逐漸在疾病的治療、診斷及監(jiān)測(cè)等方面發(fā)揮重要作用。磁共振成像(MRI)技術(shù)因具有無創(chuàng)傷、高組織分辨率等優(yōu)點(diǎn)已成為臨床醫(yī)療中診斷腫瘤最為有效的方法之一，但其敏感性較低。為了增強(qiáng)病變組織與正常組織圖像之間的對(duì)比度和清晰度，需要選擇合適的造影增強(qiáng)劑來顯示解剖學(xué)特征。這些造影增強(qiáng)劑絕大多數(shù)是利用金屬離子的順磁特性。釓(Gd3+)因?yàn)榫哂袕?qiáng)順磁性，它的絡(luò)合物是目前應(yīng)用最廣泛和最有效的一類造影增強(qiáng)劑。釓內(nèi)嵌金屬富勒烯水溶性衍生物，以其高效低毒的特性，迅速成為新型造影劑的研究熱點(diǎn)，如GdOC82 (OH) 40的MRI造影效率是臨床所用Gd-DTPA二乙烯三胺五醋酸，DTPA螯合物造影劑的 20 倍(Mikawa, Μ.，et al.，Bioconjugate Chemistry, 2001. 12(4) :p. 510-514)。然而，傳統(tǒng)修飾方法得到的內(nèi)嵌金屬富勒烯造影劑和其它MRI造影劑均為原生單模態(tài)造影劑，需要通過進(jìn)一步被發(fā)光基團(tuán)或核素修飾才能得到結(jié)合磁/熒光或磁/PET等雙模態(tài)分子影像探針實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供基于碳納米材料的單模態(tài)(熒光)分子影像探針、雙模態(tài) (磁/熒光)一體化分子影像探針及其制備方法。本發(fā)明所提供分子影像探針是按照包括下述步驟的方法制備得到的將碳納米材料加入過氧化氫與氨水的混合溶液中進(jìn)行反應(yīng)，得到含熒光分子影像探針的溶液；其中，所述碳納米材料選自下述任意一種內(nèi)嵌金屬富勒烯、空心富勒烯和氧化石墨烯。內(nèi)嵌金屬富勒是指富勒烯的碳籠內(nèi)能夠包入各種不同的金屬或金屬原子簇，形成一類具有特殊結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的化合物，通常使用MOCai形式來表示內(nèi)嵌金屬富勒烯的結(jié)構(gòu)；其中勵(lì)C82、A3NiC80或M2OC8tl型具有較高的產(chǎn)量。本發(fā)明中所述內(nèi)嵌金屬富勒烯具體可為Gd@C82、LuiC82, YiC82, Gd3NiC80, Y3NiC80, Lu3NiC80, Gd2iC80, Lu#C8Q、Y2iC80O 所述空心富勒烯具體可為 C6tl 或 C7Q。上述方法中，當(dāng)碳納米材料為具有順磁性的釓或镥內(nèi)嵌金屬富勒烯時(shí)，可得到磁/ 熒光雙模態(tài)分子影像探針。
上述方法中，所述反應(yīng)需在攪拌條件下進(jìn)行，所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為45_90°C，反應(yīng)時(shí)間為2-16小時(shí)。上述方法中，所述過氧化氫與氨水的混合溶液中過氧化氫的質(zhì)量濃度為 70% -80%，氨水的質(zhì)量濃度為20-30% ；所述碳納米材料與所述過氧化氫與氨水的混合溶液的配比為(5-100)mg (10-40)mL。該混合溶液具體可由質(zhì)量濃度30%的過氧化氫溶液和質(zhì)量濃度的氨水按照體積比7 3混合得到的。當(dāng)碳納米材料為內(nèi)嵌金屬富勒烯(如GdOC82)時(shí)，所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為45-55°C、 時(shí)間2-3小時(shí)，所述內(nèi)嵌金屬富勒烯與上述混合溶液的配比為(3-5)mg 20mL。當(dāng)碳納米材料為空心富勒烯時(shí)，所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為55_65°C、時(shí)間10-12小時(shí)，所述空心富勒烯與所述過氧化氫與氨水的混合溶液的配比為IOOmg (70-80)mL ；當(dāng)碳納米材料為氧化石墨烯時(shí)，所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為80_90°C、時(shí)間12-16小時(shí)，所述氧化石墨烯與所述過氧化氫與氨水的混合溶液的配比為5mg (20-40)mL。本發(fā)明所述方法還包括下述步驟將所述含熒光分子影像探針的溶液離心，除去不溶物，再濃縮至至l_2mL，得到濃縮液；向所述濃縮液中加入乙醇并振蕩，生成大量沉淀， 收集沉淀并用乙醇沖洗，然后干燥，得到所述熒光分子影像探針。所述方法還進(jìn)一步包括對(duì)所述熒光分子影像探針進(jìn)行純化的步驟，具體方法如下將所述熒光分子影像探針溶于水中，過濾收集濾液，將濾液用Mw = 3500透析袋透析除去小分子雜質(zhì)，透析后將溶液使用200nm微孔濾膜過濾，將濾液濃縮蒸干得到純化的熒光分子影像探針。以金屬富勒烯GdOC82為例，它與30 %過氧化氫和觀%氨水混合溶液作用發(fā)生氧化反應(yīng)得到籠外修飾羥基與氨基的金屬富勒烯水溶性衍生物，該分子影像探針的分子表達(dá)式為Gd@C820 14(OH) 14(NH2) 6。本發(fā)明所使用原料金屬富勒烯GdOC82是用高效液相色譜結(jié)合富勒烯/內(nèi)嵌金屬富勒烯專用色譜柱Buckypr印/Buckypr印-M純化得到的，用一步反應(yīng)法即可制備得到雙模態(tài)一體化分子影像探針。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于制備的雙模態(tài)分子影像探針(GdOC82O^14(OH) 14(NH2) 6。)同時(shí)具有良好的弛豫性能及寬激發(fā)波長的熒光特性，無需進(jìn)一步修飾就可以方便的用于磁共振成像以及熒光成像的多重檢測(cè)；另一優(yōu)點(diǎn)在于表面修飾的氨基殘基便于進(jìn)一步與生物配體偶聯(lián)，使之具有一定的組織靶向性。與其它現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)1、本發(fā)明制備的GdOC82O14(OH)14(NH2)6具有熒光/磁共振成像雙模態(tài)一體化分子影像探針特性，是一種原生的雙模態(tài)分子影像探針。2、本發(fā)明不需有機(jī)溶劑的介入，無需分離中間產(chǎn)物，無需無水無氧等條件，具有制備方法簡單經(jīng)濟(jì)、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。3、本發(fā)明巧妙利用過氧化氫的氧化性與氨的親核性，經(jīng)過一步反應(yīng)大量制得具有熒光特性的GdOC82的衍生物。該方法同樣適用于C6(1、CTO等空心富勒烯，Y3N@C8(1、Lu3N@C8(1等內(nèi)嵌富勒烯和氧化石墨烯，因而具有一定普適性和便于實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。4、本發(fā)明制備的Gd@C820 14(0H) ^14(NH2) 6雙模態(tài)一體化分子影像探針具有粒徑分布小、窄等特點(diǎn)。5、本發(fā)明制備的雙模態(tài)一體化分子影像探針其MRI造影效率是現(xiàn)臨床所用 Gd-DTPA的近10倍，可以在較低劑量下實(shí)現(xiàn)較高的影像對(duì)比度。6、本發(fā)明中合成的雙模態(tài)一體化分子影像探針，由于碳籠的存在，有效地防止了有毒的Gd3+離子的泄露和外來物質(zhì)的進(jìn)攻，從而大大降低了其毒性。7、本發(fā)明制備的雙模態(tài)一體化分子影像探針具有寬激發(fā)波長的熒光特性，可以方便的進(jìn)行細(xì)胞吸收、定位觀測(cè)。8、本發(fā)明制備的雙模態(tài)一體化分子影像探針，表面修飾的氨基殘基便于進(jìn)一步與生物配體偶聯(lián)，使之具有一定的組織靶向性。


圖1為本發(fā)明提供的基于金屬富勒烯GdOC82的雙模態(tài)(磁/熒光)分子影像探針的制備流程圖。圖2為實(shí)施例1制備的雙模態(tài)金屬富勒烯GdOC82衍生物的平均水合半徑。圖3為實(shí)施例1制備的雙模態(tài)金屬富勒烯GdOC82衍生物在水與生理鹽水中，在 0. 5T磁場(chǎng)下用反轉(zhuǎn)-恢復(fù)序列測(cè)得的縱向弛豫時(shí)間的倒數(shù)1/ \對(duì)不同Gd濃度作圖。圖4為實(shí)施例1制備的雙模態(tài)金屬富勒烯GdOC82衍生物在0. 5Τ與7. IT磁場(chǎng)下， 在水中用反轉(zhuǎn)-恢復(fù)序列測(cè)得的縱向弛豫時(shí)間的倒數(shù)1/ \對(duì)不同Gd濃度作圖。圖5為對(duì)照例IGd-DTPA在0. 5Τ磁場(chǎng)下用反轉(zhuǎn)-恢復(fù)序列測(cè)得的縱向弛豫時(shí)間的倒數(shù)1/ \對(duì)不同Gd濃度作圖。圖6為實(shí)施例1中制備的GdOC8UOH) 14(NH2) 6在0. 054mM、0. 138mM和對(duì)照例1中的臨床使用造影劑Gd-DTPA在0. 5mM下和純水的體外T1加權(quán)像對(duì)比圖(0. 5T自旋-回波序列 TE/TE = 300ms/15ms，T = 27 °C )。圖7為實(shí)施例1制備的GdOC82O^14(OH) ^14(NH2) ^6中不同價(jià)態(tài)的Cls鍵合能實(shí)驗(yàn)曲線和擬合曲線。圖8為實(shí)施例1制備的GdOC82O^14(OH) ^14(NH2) ^6中不同價(jià)態(tài)的Nls鍵合能實(shí)驗(yàn)曲線和擬合曲線。圖9為實(shí)施例1制備的GdOC82O 14(OH) ^14(NH2) ^6的紫外-可見吸收譜圖。圖10為實(shí)施例1制備的Gd@C820 14(OH) 14(NH2) 6的熒光光譜發(fā)射峰圖(激發(fā)波長 370-490nm，步長=20nm)。圖11實(shí)施例2產(chǎn)物的熒光光譜發(fā)射峰圖(激發(fā)波長350-470nm，步長=20nm)圖12實(shí)施例3產(chǎn)物的熒光光譜發(fā)射峰圖(激發(fā)波長400-500nm，步長=20nm)圖13為實(shí)施例1制備的GdOC82O^14(OH) 14(NH2) 6在自然光和365nm紫外光下的照片。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
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對(duì)照例1作為對(duì)照，以臨床使用的釓噴酸葡胺注射液，商品名為馬根維顯(Gd-DTPA， Magnevist)(德國先靈公司生產(chǎn)，先靈藥業(yè)有限公司分包裝。進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào) H20030138，批準(zhǔn)文號(hào)國藥準(zhǔn)字J2003006》，分別配制一系列濃度的水溶液，用翻轉(zhuǎn)-恢復(fù)序列在0. 5T磁場(chǎng)條件下測(cè)得縱向弛豫時(shí)間T1，而后用其倒數(shù)對(duì)濃度作圖(見圖幻，得到表征其水質(zhì)子弛豫率大小的重要參數(shù)A值為4. SmT1s-1。實(shí)施例1、制備基于金屬富勒烯GdOC82的雙模態(tài)(磁/熒光)一體化分子影像探針(a)內(nèi)嵌金屬富勒烯GdiC82可按如下參考文獻(xiàn)制備=Shu, C. Y.，et al.，Carbon, 2006. 44 (3) :p. 496-500. Cagle. D. W.，PNAS, 1999. 96 :ρ· 5182-5187。具體如下通過直流電弧放電法制備含有金屬富勒烯GdOC82的灰炱，用甲苯 (DMF或鄰二氯苯)提取結(jié)合高效液相色譜(使用富勒烯/內(nèi)嵌金屬富勒烯專用色譜柱 Buckypr印/Buckypr印-M)分離提純得到高純度的金屬富勒烯GdOC82的甲苯溶液，蒸干得到黑色固體(A)。(b)配制20mL質(zhì)量濃度30%過氧化氫溶液與質(zhì)量濃度氨水的混合溶液(Va
氧化s · V氨水=7 · 3) (B)。(c)將!BrngA加入B中，在50°C下劇烈攪拌3h，A逐漸溶解生成亮黃色溶液C。(d)將C溶液離心，除去不溶物，再減壓蒸餾濃縮至lmL，得到黃色濃溶液；加入 IOmL乙醇并振蕩，迅速生成大量黃色沉淀，離心后收集固體并用乙醇反復(fù)沖洗幾次，以除去過量氨水與過氧化氫，然后蒸干、真空干燥，得到橙色固體。(e)向橙色固體中加入IOmL高純水溶解并過濾，濾液用Mw = 3500透析袋透析除去小分子雜質(zhì)，透析后將溶液使用200nm微孔濾膜過濾，將濾液濃縮蒸干得到亮黃色固體即為基于金屬富勒烯GdOC82的雙模態(tài)(磁/熒光)一體化分子影像探針。由圖2可知，其平均水合半徑為15. 69nm。由圖3得到，在0.5T場(chǎng)強(qiáng)下，新制備的雙模態(tài)(磁/熒光)一體化分子影像探針的縱向弛豫率T1為47. ImT1iT1,且在生理鹽水(巧為45. OmT1iT1)也沒有明顯下降。圖4可知在高場(chǎng)強(qiáng)(7.1T)下分子影像探針的縱向弛豫率。有一定下降。由圖3和圖5得到的縱向弛豫率巧比較可知，本發(fā)明制備的分子影像探針的造影效率是臨床使用Gd-DTPA的10倍以上。圖6說明該物質(zhì)的造影效果明顯優(yōu)于臨床所用的Gd-DTPA，即使在低濃度下 (0. 054mM)成像效果依然明顯。由圖7可知
權(quán)利要求
1.一種制備熒光分子影像探針的方法，包括下述步驟將碳納米材料加入過氧化氫與氨水的混合溶液中進(jìn)行反應(yīng)，得到含熒光雙模態(tài)分子影像探針的溶液；其中，所述碳納米材料選自下述任意一種內(nèi)嵌金屬富勒烯、空心富勒烯和氧化石墨烯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述內(nèi)嵌金屬富勒烯選自下述至少一種 GdiC82, LuOC82、YOC82、Gd3N@C8Q、Y3NiC80, Lu3N@C8(1、Gd2@C8(1、Lu2@C8(1、Y2iC80 ；所述空心富勒烯為 C60 或 C70。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述內(nèi)嵌金屬富勒烯選自下述至少一種 GdiC82,LuiC82,Gd3NiC80,Lu3NiC80,Gd2iC80 和 Lu2@C8(1，所述熒光分子影像探針為磁 / 熒光雙模態(tài)分子影像探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)在攪拌條件下進(jìn)行， 所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為45-90°C，反應(yīng)時(shí)間為2-16小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述過氧化氫與氨水的混合溶液中過氧化氫的質(zhì)量濃度為70% _80%，氨水的質(zhì)量濃度為20% -30%;所述碳納米材料與所述過氧化氫與氨水的混合溶液的配比為(5-100)mg (10-40)mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述過氧化氫與氨水的混合溶液是由質(zhì)量濃度30%的過氧化氫溶液和質(zhì)量濃度的氨水按照體積比7 3混合得到的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述碳納米材料為內(nèi)嵌金屬富勒烯，所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為45-55°C、時(shí)間2-3小時(shí)，所述內(nèi)嵌金屬富勒烯與所述過氧化氫與氨水的混合溶液的配比為(3-5)mg 20mL；所述碳納米材料為空心富勒烯，所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為55-65°C、時(shí)間10-12小時(shí)，所述空心富勒烯與所述過氧化氫與氨水的混合溶液的配比為IOOmg (70-80)mL ；所述碳納米材料為氧化石墨烯，所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為80-90°C、時(shí)間12-16小時(shí)，所述氧化石墨烯與所述過氧化氫與氨水的混合溶液的配比為5mg (20-40)mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述方法還包括將所述含磁 /熒光雙模態(tài)分子影像探針的溶液離心，除去不溶物，再濃縮至l_2mL，得到濃縮液；向所述濃縮液中加入乙醇并振蕩，生成沉淀，收集沉淀并用乙醇沖洗，然后干燥，得到所述熒光分子影像探針。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述方法還包括下述步驟對(duì)所述熒光分子影像探針進(jìn)行純化的步驟，具體方法如下將所述熒光分子影像探針溶于水中，過濾收集濾液，將濾液用Mw = 3500透析袋透析除去小分子雜質(zhì)，透析后將溶液使用200nm微孔濾膜過濾，將濾液濃縮蒸干得到純化的熒光分子影像探針。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述方法制備得到的熒光分子影像探針。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型雙模態(tài)(磁/熒光)一體化分子影像探針及其制備方法。該分子影像探針是按照包括下述步驟的方法制備得到的將碳納米材料加入過氧化氫與氨水的混合溶液中進(jìn)行反應(yīng)，得到含磁/熒光雙模態(tài)分子影像探針的溶液；離心，除去不溶物濃縮；向濃縮液中加入乙醇并振蕩，生成大量沉淀，收集沉淀并用乙醇沖洗，然后干燥，得到所述磁/熒光雙模態(tài)分子影像探針；其中，所述碳納米材料選自下述任意一種內(nèi)嵌金屬富勒烯、空心富勒烯和氧化石墨烯。本發(fā)明方法不需有機(jī)溶劑的介入，無需分離中間產(chǎn)物，無需無水無氧等條件，具有制備方法簡單經(jīng)濟(jì)、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K49/06GK102284067SQ20111022548
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月8日
發(fā)明者王春儒, 甄明明, 舒春英, 鄭俊鵬 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所