專利名稱：一種藏藥唐古特青蘭提取物及其在制備抗病毒藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗病毒藥物。具體地講，涉及了一種唐古特青蘭提取物及其在制備抗病毒藥物中的應用。
背景技術(shù)：
藏藥唐古特青蘭為唇形科植物唐古特青蘭(Dracocephalum tanguticum Maxim)的干燥地上部分，多年生草本。產(chǎn)于西藏、青海、四川西部和甘肅西南部，是青藏高原特有植物，又稱“甘青青蘭”，藏語稱“知羊格”，具有清肝熱、胃熱、干黃水、愈瘡、止血的功效，主治肝熱病、胃熱病、黃水病、使血、瘡瘍不愈。地上部分含黃酮類、氨基酸、甾醇、酸性成分，并呈揮發(fā)油類反應。藥理研究表明青蘭苷為唐古特青蘭全草中的有效成分。經(jīng)青海省高原醫(yī)學研究所研究表明，唐古特青蘭具有抗缺氧及抗氧化作用，[中草藥，1995，26(12)641-644]，[中草藥，1994，25(3)134-137]。張曉峰，王生新等從唐古特青蘭分離到8種化合物，經(jīng)化學和光譜分析鑒定為齊墩果酸(1)、熊果酸(II)、胡蘿卜甙(II)、茵芋甙(IV)、大波斯菊甙(V)、胡麻素(VI)、胡麻甙(VII)、胡麻甙-6-乙酸酯(VII)[植物學報，1994，36(8)645-648]。雖然唐古特青蘭在藏藥中用途廣泛，歷史悠久，其藥理活性有關(guān)抗缺氧作用報道甚多，但其抗病毒作用國內(nèi)外未見報道。
病毒性疾病治療藥物發(fā)展較遲緩，主要由于病毒有嚴格寄生性，與細胞關(guān)系密切，病毒感染細胞后，進入細胞內(nèi)，在宿主細胞內(nèi)利用細胞酶系統(tǒng)復制；有些病毒核酸整合于細胞染色體，難于清除。病毒嚴格寄生在細胞內(nèi)，使得藥物殺傷病毒的同時對機體細胞也有損害?，F(xiàn)有的抗病毒化學藥物即因為毒性太大或耐藥性的產(chǎn)生，其臨床難以取得令人滿意的效果。本發(fā)明以單純皰疹病毒為例，闡明唐古特青蘭提取物在制備抗病毒藥物中的應用。單純皰疹病毒引起的性傳播性疾病，與宮頸癌關(guān)系密切。目前國內(nèi)外研究的抗病毒藥物已接近50種，但真正應用于臨床的只有阿昔洛韋、拉米夫定等少數(shù)幾類核苷類藥物，這類藥物作用靶點為病毒DNA聚合酶。它們以酶反應底物類似物的形式與正常底物競爭，直接降低或阻斷病毒DNA聚合酶活性，其共同缺點是易產(chǎn)生耐藥毒株，抗病毒譜窄，毒副作用大，價格高昂或藥理特性不理想。因此，尋求更新更好的抗病毒藥物已勢在必行。
本發(fā)明提供了一種唐古特青蘭提取物，該提取物可以在制備抗病毒藥物中應用，與現(xiàn)有抗病毒合成藥相比，其毒性低，安全可靠，藥效作用強，而且唐古特青蘭原料豐富、價廉、萃取工藝簡單、制備成本低，可以制成各種劑型。

發(fā)明內(nèi)容
唐古特青蘭提取物的制備將稱取干燥唐古特青蘭生藥，粉碎，用適量濃酒精浸泡過夜，熱水浴回流1～5h，提取1～4次，合并提取液，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，冷凍凍干，紫外線照射滅菌獲得總浸膏。
本發(fā)明所提供的唐古特青蘭提取物可以在抑制病毒吸附、預防病毒侵染、抑制病毒基因復制、直接滅活病毒等多環(huán)節(jié)發(fā)揮明顯的抗病毒作用，故而該提取物可以在制備抗病毒藥物中應用。本發(fā)明提供的唐古特青蘭提取物可以在制備抗病毒藥物中以單味或者復方方式制備成藥物組合物，尤其是單味或者復方方式在制備治療生殖器皰疹的藥物組合物中應用。由于軟膠囊、硬膠囊、滴丸、片劑、分散片、顆粒劑、注射液、口服液、栓劑等藥物劑型的制備是本領(lǐng)域的研究人員所能理解的，可以方便地實現(xiàn)唐古特青蘭提取物與相應載體組合而制備成各種藥物劑型軟膠囊、或硬膠囊、或滴丸、或片劑、或分散片、或顆粒劑、或注射液、或口服液、或栓劑。
本發(fā)明的優(yōu)點在于1、唐古特青蘭為純藏藥，毒性低，安全性高。
2、唐古特青提取物可通過抑制病毒吸附、預防病毒侵染、抑制病毒基因復制、直接滅活病毒等多環(huán)節(jié)發(fā)揮明顯的抗病毒作用，唐古特青蘭提取物可以在制備抗病毒藥物中應用。
3、原料豐富、價廉、萃取工藝簡單、制備成本低，可以方便地制備成各種劑型。
具體實施例方式實施例一唐古特青蘭提取物的制備將稱取干燥唐古特青蘭生藥，粉碎，用適量濃酒精浸泡過夜，熱水浴回流1～5h，提取1～4次，合并提取液，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，冷凍凍干，紫外線照射滅菌獲得總浸膏。
實施例二唐古特青蘭提取物的體外抗病毒作用(一)唐古特青蘭提取物對細胞的毒性1 病毒和細胞株單純皰疹病毒II型毒株是來源于武漢大學病毒研究所的HSV-II333株。Vero細胞購于美國ATCC公司。
2動物昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～22g，蘭州生物制品研究所實驗動物中心提供。
3藥物以1％DMSO為溶劑配制唐古特青蘭總浸膏藥液，阿昔洛韋(武漢普生制藥有限公司)作為陽性對照。
培養(yǎng)細胞，待96孔板細胞長成單層后傾去培養(yǎng)基，加入倍半稀釋的5個稀釋度的藥液16、8、4、2、1mg/ml，每孔加藥液150微升，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于24h和48h觀察藥物對細胞的毒性，設(shè)無藥物細胞對照。由于藥液顏色深，不能用MTT染色法觀察藥物對細胞的毒性，采用顯微鏡觀察細胞病變(CPE)為指標。唐古特青蘭提取物對Vero細胞的毒性表現(xiàn)為細胞顆粒較多，折光性強，細胞形態(tài)由棱形收縮成圓形，部分細胞脫落破碎，根據(jù)細胞病變的級別來判定細胞病變程度。我們將病變程度分為5級完全圓化變形病變＞75％為4，病變＞50％＜75％為3，病變＞25％＜50％為2，病變＞15％＜25％為1，無病變?yōu)?。并按Reed-Meuench法計算半數(shù)有毒濃度(CC50)結(jié)果。結(jié)果顯示唐古特總提取物的CC50為4.5±0.1mg/ml。
(二)唐古特青蘭提取物半數(shù)有效濃度將倍半稀釋的5個稀釋度藥液4、2、1、0.5、0.25mg/ml與等量TCID50(組織半數(shù)感染量)的病毒混合，加入到96孔板上長成單層的Vero細胞上，每孔加樣量為200微升，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于24h和48h觀察藥物對病毒的抑制性，設(shè)無藥物細胞對照。采用顯微鏡觀察細胞病變(CPE)為指標。病變程度分同前，以Reed-Muench法計算藥物對病毒生長抑制率及半數(shù)有效濃度(EC50)。結(jié)果表明唐古特青蘭提取物EC50分別為0.96±0.07mg/ml。
(三)唐古特青蘭提取物對病毒的直接滅活作用將濃度為4mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml的唐古特青蘭總浸膏藥液分別與100PFU 0.1ml的HSV2-II等體積混合，37℃作用90min后，以此病毒藥物混合液感染Vero細胞。37℃，5％CO2吸附90min，加甲基纖維素覆蓋液，37℃，5％CO2培養(yǎng)。72h后，結(jié)晶紫染色，計數(shù)蝕斑，計算抑制率。每一藥物濃度重復4孔，同時設(shè)置正常細胞對照、溶劑對照、陽性藥物對照及病毒對照。
病毒抑制率(％)＝(病毒對照組平均出斑數(shù)-給藥試驗組平均出斑數(shù))/病毒對照組平均出斑數(shù)結(jié)果顯示，在唐古特青蘭總浸膏具有很強的對HSV-II的直接滅活作用，在濃度為4mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml，抑制率分別為99.0％，81.5％，50.0％，15.2％，0％。陽性對照阿昔洛韋在濃度為0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.0625mg/ml，0.03125mg/ml，抑制率分別為79.5％，45.5％，30.8％，3.2％，0％。
(四)唐古特青蘭提取物對病毒侵入細胞的阻斷作用將濃度為4mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml的唐古特青蘭總浸膏藥液用藥物預先處理細胞90min，洗滌后以100PFU 0.1ml的HSV2-II攻擊，37℃，5％C02吸附90min后洗滌，同上法培養(yǎng)與檢查。
結(jié)果顯示，在唐古特青蘭總浸膏能夠阻斷HSV-II對細胞的侵入，在濃度為4mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml，抑制率分別為100％，56.6％，23.2％，15.4％，9.8％。陽性對照阿昔洛韋在濃度為0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.0625mg/ml，0.03125mg/ml，抑制率分別為87.5％，43.3％，26.2％，23.0％，14.8％。
(五)唐古特青蘭提取物阻止HSV-2病毒顆粒對靶細胞的吸附將供試藥物與TCID500.1ml的HSV-2等體積混合，以此病毒混合物感染Vero細胞。37℃，5％CO2吸附90min后洗滌，同上法培養(yǎng)與檢查。
4、2、1、0.5、0.25mg/ml的唐古特青蘭總浸膏對HSV-2病毒的抑制率分別為100.0％、100.0％、99.0％、62.3％、34.3％，阿昔洛韋在濃度為0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.0625mg/ml，0.03125mg/ml時，對病毒的抑制率為90.1％、29.2％、27.9％、9.9％、0.0％。
(六)唐古特青蘭提取物對病毒DNA合成的抑制作用以熒光PCR方法測定病毒DNA，將濃度為4mg/ml，2mg/ml的唐古特青蘭總浸膏藥液和病毒等量混合感染細胞，設(shè)立病毒對照及細胞對照，37℃，5％CO2培養(yǎng)24小時，消化，收獲細胞，按標準方法從細胞中提取病毒DNA，作為熒光定量PCR的模板，按照熒光定量PCR HSV試劑盒程序操作，同時設(shè)立一系列濃度的HSV DNA定量陽性標準品。以起始拷貝數(shù)的自然對數(shù)為橫坐標，循環(huán)閾值為縱坐標，得到的回歸直線為標準曲線據(jù)此對樣品的拷貝數(shù)進行定量。
熒光PCR結(jié)果表明，唐古特青蘭總浸膏能夠顯著抑制HSV-IIDNA的復制，濃度為4mg/ml，2mg/ml時，DNA拷貝數(shù)分別為(3.87±0.2)×102，(2.12±0.52)×103，而不加藥液的病毒對照DNA拷貝數(shù)為(7.93±0.84)×108。
實施例三唐古特青蘭提取物的體內(nèi)抗病毒作用(一)唐古特青蘭提取物對小鼠的急性毒性(LD50)
根據(jù)孫氏綜合法，首先進行預試實驗，算出D0和D100。在D0和D100的劑量范圍內(nèi)設(shè)5個劑量組，組間劑量比值為1∶0.8，觀察一次給藥后15d內(nèi)動物死亡情況，計算LD50。小鼠中毒癥狀軟弱無力，葡伏不動，四肢下垂于鐵絲籠鐵絲的間隙中，呼吸緩慢，最后抽搐死亡。尸體解剖，觀察心、肺、肝、脾、腎、消化管道，肉眼未見明顯病變。經(jīng)統(tǒng)計學計算，結(jié)果LD50為5.12g/kg。
(二)唐古特青蘭提取物對病毒感染小鼠的保護作用選取18～22g清潔級昆明小鼠，雌雄各半，隨機分組每組10只。感染部位常規(guī)消毒后，經(jīng)右側(cè)腦腔注射病毒懸液，感染劑量為0.05ml/只，感染24h后灌胃給藥治療。在藥物LD50的1/2～1/10范圍內(nèi)確定高、中和低三個劑量組，另設(shè)陽性藥物對照組(阿昔洛韋0.1g/kg)、安慰劑量組(生理鹽水)、病毒對照組和正常組。連續(xù)治療7d，每天觀察小鼠的死亡情況、是否毛發(fā)蓬松、步態(tài)不穩(wěn)及抽搐等存活狀態(tài)。所得試驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(t檢驗)處理，試驗結(jié)果重復三次，生命延長率計算公式如下生命延長率＝(給藥組平均存活天數(shù)-病毒對照組平均存活天數(shù))/病毒對照組平均存活天數(shù)×100％表1 唐古特青蘭總浸膏對HSV-2腦炎小鼠的治療效果(n＝10)

表1中，腦炎模型小鼠經(jīng)過供試藥物治療以后，平均存活天數(shù)有所延長，唐古特青蘭總浸膏高、中和低三個劑量組與生理鹽水組、病毒對照組差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且與陽性藥物阿昔洛韋組療效相同(P＞0.05)。其中1g/kg劑量組對小鼠的生命延長作用最強，其生命延長率達到312.9％；其次為0.5g/kg劑量組，其生命延長率為112.9％，2g/kg劑量組的最弱，其生命延長率為29％。
通過以上具體實施方案，唐古特青蘭總浸膏體外抗病毒療效的治療指數(shù)(TI)為4.56(病毒等量作用于細胞)。體內(nèi)試驗表明能夠顯著延長平均存活時間，提高病毒感染腦炎小鼠存活率，說明唐古特青蘭提取物具有很強的抗病毒作用，適宜在制備各種抗病毒藥物包括在制備治療生殖器皰疹藥物中應用。
權(quán)利要求
1.一種藏藥唐古特青蘭提取物，其特征是該提取物可以在制備抗病毒藥物中應用，尤其是在制備抗單純皰疹病毒藥物中應用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的唐古特青蘭提取物，其特征在于該提取物按下列方法制備將稱取干燥唐古特青蘭生藥，粉碎，用適量的濃酒精浸泡過夜，熱水浴回流1～5h，提取1～4次，合并提取液，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，冷凍凍干，紫外線照射滅菌獲得總浸膏。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至2所述的唐古特青蘭提取物，其特征在于該提取物可以單獨或與其它藥物配伍或加入藥學上可以接受的輔料，制備成軟膠囊、或硬膠囊、或滴丸、或片劑、或分散片、或顆粒劑、或注射液、或口服液、或栓劑經(jīng)口服或皮膚或粘膜或直腸方式應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗病毒藥物。具體地講，涉及了一種唐古特青蘭提取物及其在制備抗病毒藥物中的應用。本發(fā)明所提供的唐古特青蘭提取物可以在抑制病毒吸附、預防病毒侵染、抑制病毒基因復制、直接滅活病毒等多環(huán)節(jié)發(fā)揮明顯的抗病毒作用，故而該提取物可以在制備抗病毒藥物中應用。本發(fā)明提供的唐古特青蘭提取物可以在制備抗病毒藥物中以單味或者復方方式制備成藥物組合物，尤其是單味或者復方方式在制備治療生殖器皰疹的藥物組合物中應用，同時，其原料豐富、價廉、萃取工藝簡單，成本低，并可很方便地做成各種劑型。具有重要的開發(fā)與應用前景。
文檔編號A61P31/22GK101084991SQ20071020108
公開日2007年12月12日 申請日期2007年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月16日
發(fā)明者李紅玉, 張春江, 允田, 傅永紅, 支德娟 申請人:李紅玉, 蘭州大學