專利名稱：：間氯苯甲?；〈摎渌w薊賓及其制備方法和藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體而言，本發(fā)明涉及一個(gè)23位間氯苯甲?；〈?，3-脫氫水飛薊賓酯類衍生物的制備方法及其醫(yī)藥用途，該化合物具有抑制自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化物生成的活性，可以預(yù)期發(fā)展成為防治自由基引起或與之相關(guān)的疾病包括炎癥、自身免疫性疾病、放射治療后遺癥、腫瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態(tài)反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的藥物用途。該化合物還表現(xiàn)出很強(qiáng)的對(duì)抗自由基引起的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞損傷作用，即對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用，說(shuō)明其對(duì)保護(hù)腦細(xì)胞組織抗氧化和腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥有積極作用，可以預(yù)期用于制備該類藥物的用途。此外，該化合物具有強(qiáng)效抑制黃嘌呤氧化酶活性，可以預(yù)期發(fā)展成為防治由黃嘌呤氧化酶引起的疾病包括痛風(fēng)病的藥物。
背景技術(shù)：
：在眾多抗自由基天然產(chǎn)物中，水飛薊素是少數(shù)幾個(gè)在臨床上廣泛應(yīng)用的藥物之一。三十多年的臨床實(shí)驗(yàn)證明該藥具有確切的療效和低毒性(參閱FloraK.等人，Am.J.Gastroenterol,1998,93,139—143;SailerR.等人，Drugs,2001,61(14)，2035-2063)。水飛薊素中水飛薊賓含量最多，活性也相對(duì)最高，故關(guān)于水飛薊賓之藥效學(xué)研究最為廣泛。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局制訂的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)水飛薊素一欄中，要求含水飛薊素以水飛薊賓計(jì)算，不得少于68%。該天然藥物作用主要有以下幾點(diǎn)(一)抗自由基活性水飛薊素對(duì)于由四氯化碳、半乳糖胺、醇類和其他肝毒素造成的肝損害具有保護(hù)作用。1990年Lottenm等人報(bào)道了在小鼠肝微粒體內(nèi)，水飛薊素能減少由四氯化碳代謝引起的體外脂質(zhì)過(guò)氧化及由還原型輔酶單獨(dú)引起的過(guò)氧化作用，這些都表明水飛薊素為鏈中斷抗氧化劑或?yàn)樽杂苫宄齽?二)保護(hù)肝細(xì)胞膜通過(guò)抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性，保護(hù)肝細(xì)胞膜。還能阻斷真菌毒素鬼筆毒環(huán)肽和(x-鵝膏蕈堿等與肝細(xì)胞上特異受體的結(jié)合，抑制其對(duì)肝細(xì)胞的攻擊及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，中斷其肝腸循環(huán)，從而增強(qiáng)肝細(xì)胞膜對(duì)于多種損害因素的抵抗4力。(三)促進(jìn)肝細(xì)胞的修復(fù)和再生水飛薊賓進(jìn)入細(xì)胞后可以與雌二醇受體結(jié)合，并使之激活，活化的受體可以增強(qiáng)肝細(xì)胞核內(nèi)RNA聚合酶1的活性，使RNA轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，促進(jìn)酶及蛋白質(zhì)的合成，并間接促進(jìn)DNA的合成，有利于肝細(xì)胞的修復(fù)和再生。(四)抗腫瘤作用各種活性氧能氧化鳥(niǎo)嘌呤形成8-羥基鳥(niǎo)嘌呤，造成DNA損傷，進(jìn)而引起腫瘤，水飛薊賓作為一個(gè)有效的抗自由基物質(zhì)也顯示了預(yù)防和治療腫瘤的作用。水飛薊賓類化合物具有確切的抗氧化活性，但是由于其水溶性和生物利用度上的一些不足限制了該藥物的市場(chǎng)。故尋找水飛薊賓類新的衍生物，使其能夠具有更高或者更新的藥理活性，以期獲取自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新藥，實(shí)屬必要。痛風(fēng)病是常見(jiàn)的多發(fā)性疾病，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論證實(shí)痛風(fēng)病的致病因素與氧自由基有關(guān)。黃嘌呤氧化酶(EC1.2.3.2，簡(jiǎn)稱為XO)是體內(nèi)核酸代謝的一個(gè)重要酶，能催化次黃嘌呤和黃嘌呤生成尿酸和超氧陰離子，若機(jī)體不能及時(shí)清除產(chǎn)生的尿酸，使尿酸結(jié)晶鹽在關(guān)節(jié)處沉積，就會(huì)引起痛風(fēng)。產(chǎn)生過(guò)多的超氧陰離子也可引起多組織受損，因此測(cè)定化合物對(duì)XO的作用對(duì)發(fā)現(xiàn)新的XO抑制劑和其抗氧化作用有重要意義。從天然產(chǎn)物以及其衍生物中篩選出黃嘌呤氧化酶抑制劑先導(dǎo)化合物也是開(kāi)發(fā)治療痛風(fēng)病新藥的重要任務(wù)。近年來(lái)，國(guó)際醫(yī)藥界持續(xù)不斷地投入了大量的人力、物力、財(cái)力，努力尋找抗氧化作用顯著、具有強(qiáng)效神經(jīng)保護(hù)作用的抗氧化劑先導(dǎo)化合物。綜上所述，本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成出一個(gè)23位間氯苯甲?；〈?，3-脫氫水飛薊賓酯，測(cè)試了其抑制自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化物生成的活性及其對(duì)抗自由基引起的大鼠腎上腺嗜鉻瘤PC12細(xì)胞損傷作用，還測(cè)試了該化合物對(duì)于黃嘌呤氧化酶的抑制作用。測(cè)試結(jié)果顯示該化合物對(duì)上述模型有著顯著的藥效學(xué)活性，有望進(jìn)一步發(fā)展成為治療上述相關(guān)疾病的先導(dǎo)化合物和藥物。由此完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種式(I)所示的23位間氯苯甲?；〈?,3-脫氫水飛薊賓酯即化合物間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3,5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯或其可藥用鹽用于制備防治與抗氧化機(jī)制相關(guān)疾病及痛風(fēng)病藥物的用途。具體而言，本發(fā)明的目的之一是提供了一種間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3,5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯或其可藥用鹽用于制備防治腦細(xì)胞組織氧化損傷或腦神經(jīng)氧化損傷、防治早老性癡呆癥的藥物或藥物組合物的用途；其用于制備由黃嘌呤氧化酶引起的疾病包括痛風(fēng)病等疾病的藥物或藥物組合物的用途。本發(fā)明的再一目的是提供了式(I)化合物或其可藥用鹽用于制備防治肝腦脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)的生理改變或疾病的藥物的用途，尤其是用于制備防治自由基誘導(dǎo)之脂質(zhì)過(guò)氧化物生成引起的急慢性肝損傷類疾病、炎癥疾病以及由脂質(zhì)過(guò)氧化引起的自身免疫性疾病、放射治療后遺癥、腫瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態(tài)反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化癥的藥物的用途。本發(fā)明的又一目的是提供了一種用于防治由氧自由基引起或與氧自由基有關(guān)的腦細(xì)胞組織氧化損傷、腦神經(jīng)氧化損傷、老年性癡呆癥，以及防治肝腦脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)的生理改變或疾病的藥物或藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的式(I)所示之23位間氯苯甲?；〈?,3-脫氫水飛薊賓酯或其可藥用鹽和可藥用輔料。本發(fā)明的再一目的是提供一種防治由黃嘌呤氧化酶引起的疾病包括痛風(fēng)病的藥物或藥物組合物，其中含有治療有效量的式(I)所示的23位間氯苯甲?；〈?,3-脫氫水飛薊賓酯或其可藥用鹽和藥用輔料。本發(fā)明還提供了一種制備式(I)化合物的方法，其特征是水飛薊賓脫水后形成的2，3-脫氫水飛薊賓在縮合催化劑和膦鹽存在下，與間氯苯甲酸進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)而得，此處縮合催化劑優(yōu)選偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)，膦鹽優(yōu)選三苯基膦。本發(fā)明的有益之處在于本發(fā)明采用合成方法制備了23位間氯苯甲?；〈?,3-脫氫水飛薊賓酯，并用藥理實(shí)驗(yàn)揭示了其具有防治肝、腦組織抗氧化能力，從而可預(yù)期發(fā)展成為抗氧化劑藥物和防治老年性癡呆癥藥物的制6藥用途。式(I)化合物由天然藥物為母體制備而得，方法簡(jiǎn)單、步驟短，產(chǎn)率較高，成本低，污染小，適于產(chǎn)業(yè)化且符合節(jié)能減排的相關(guān)要求。此外，本發(fā)明還揭示出該23位間氯苯甲?；〈?,3-脫氫水飛薊賓酯在制備治療痛風(fēng)病藥物領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)潛力，為上述常見(jiàn)病、多發(fā)病提供了新的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有一定的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面首先用實(shí)施例的形式說(shuō)明化合物制備的過(guò)程，實(shí)施例給出了化合物的部分物理和化學(xué)及波譜學(xué)數(shù)據(jù)。必須說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1:式(I)化合物間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯的制備OHO1.12，3-脫氫水飛薊賓的制備在干燥的反應(yīng)瓶中加入1.02克水飛薊賓，10克醋酸鉀，再加入50毫升冰醋酸，冰浴下再加入溶有1克碘的冰醋酸50毫升。加熱回流5小時(shí)。降溫后加入50毫升冰水，醋酸乙酯提取(20毫升x4次)，提取液有機(jī)層合并，水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥。過(guò)濾，濾液濃縮，得紅棕色固體，加入含有6毫升鹽酸的50毫升乙醇溶液。加熱回流3小時(shí)。降溫，析出黃色固體，醋酸乙酯重結(jié)晶得粗品2,3-脫氫水飛薊賓黃色粉末0.95克，直接用于下一步反應(yīng)。1.2式(I)化合物的制備在干燥的反應(yīng)瓶中加入0.95克2,3-脫氫水飛薊賓粗品，0.62克間氯苯甲酸，1.57克三苯基膦，用20毫升無(wú)水四氫呋喃溶解后加入1.04克(0.8毫升)DEAD，室溫?cái)嚢?小時(shí)。減壓蒸除溶劑，加入少量氯仿，濾去不溶物，母液濃縮后用6克200~300目硅膠拌樣，用40克200-300目硅膠柱層析，石油醚/醋酸乙酯=2:1洗脫，薄層TLC檢測(cè)合并，純化得到式(I)化合物1.08克。Rf(石油醚/乙酸乙酯=1:1):0.31;核磁共振氫譜'HNMR(400MHz,氘代丙酮)S:4.63(多重峰，1H),4.85(多重峰，2H)，5.02(多重峰，1H),6.28(雙峰,J=2.0Hz，1H)，6.47~6.58(多重峰，3H,芳香環(huán)Ar—H)，6.62(雙峰，J=2.0Hz，1H)，6.81(雙峰，J=8.4Hz,1H)，7.287.89(多重峰，4H,芳香環(huán)Ar-H)，7.96(雙峰，J=2.0Hz，1H),8.01(雙雙峰,J=8.4，2.0Hz,1H),11.15(單峰，1H,5—OH);電噴霧質(zhì)譜ESI-MS:617(M—l)+。式(I)化合物間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3,5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡P南-2)-2，3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯具有多種重要的生物活性，本發(fā)明通過(guò)藥效學(xué)試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)該化合物之抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)其具有確切的體外抑制自由基誘導(dǎo)之脂質(zhì)過(guò)氧化物生成的活性。表明該化合物可以預(yù)期用于制備預(yù)防或治療急慢性肝損傷類疾病以及由脂質(zhì)過(guò)氧化物引起或與脂質(zhì)過(guò)氧化物有關(guān)的其他生理改變或疾病的藥物。此外，該化合物還表現(xiàn)出很強(qiáng)的對(duì)抗自由基引起的PC12細(xì)胞損傷作用，即對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用。說(shuō)明其對(duì)保護(hù)腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥有積極作用，可以用于制備保護(hù)腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥藥物的用途。再者，該化合物還顯示出強(qiáng)效抑制黃嘌呤氧化酶活性，可以預(yù)期發(fā)展成為防治由黃嘌呤氧化酶引起的疾病包括痛風(fēng)病的藥物。本發(fā)明的式(I)化合物間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3,5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯或其可藥用鹽可以與藥學(xué)上常用的輔料或載體結(jié)合，制備得到具有抗氧化活性的藥物或藥物組合物，可用于治療一些病變過(guò)程中產(chǎn)生自由基的疾病，如炎癥疾病、自身免疫性疾病、放射治療后遺癥、腫瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態(tài)反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。上述各類藥物或藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑等劑型。本發(fā)明的式(I)化合物間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3,5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯或其可藥用鹽還可以與現(xiàn)已上市的抗自由基氧化劑藥物如超氧化物歧化酶(SOD)等聯(lián)合使用，制備得到具有防御自由基引起的損害活性的抗氧化藥物組合物，用于治療上述疾病。其也可與其他保護(hù)腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥藥物聯(lián)合使用，得到抗老年性癡呆藥物組合物。上述藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑等劑型。此外，本發(fā)明的式(I)化合物或其可藥用鹽可以與藥學(xué)上常用的輔料或載體結(jié)合，制備得到抑制黃嘌呤氧化酶、治療痛風(fēng)類疾病的藥物。本發(fā)明的式(I)化合物或其可藥用鹽還可以與現(xiàn)已上市的治療痛風(fēng)病藥物如黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌醇等聯(lián)合使用，制備得到具有治療痛風(fēng)病的藥物組合物，用于痛風(fēng)病的臨床治療。上述各類藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑等劑型。本發(fā)明中所述劑型如片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑和外用搽劑以及各種緩釋、控釋劑型以及納米制劑都可以根據(jù)現(xiàn)已公認(rèn)的藥劑學(xué)常識(shí)經(jīng)由常規(guī)制備而得，在這些公知知識(shí)和技術(shù)基礎(chǔ)上制備出的含有本發(fā)明權(quán)利要求化合物的藥物或藥物組合物之其他劑型都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面分別用藥理相關(guān)實(shí)施例的形式列舉式(I)化合物間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3,5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯抑制自由基誘導(dǎo)之脂質(zhì)過(guò)氧化物生成的活性試驗(yàn)、對(duì)雙氧水&02所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用試驗(yàn)、以及其對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用試驗(yàn)之結(jié)果，說(shuō)明其在制藥領(lǐng)域中的用途以及用于制備相關(guān)抗氧化藥物和痛風(fēng)病藥物的根據(jù)。下述之藥理相關(guān)實(shí)施例給出了化合物的部分活性數(shù)據(jù)。同樣必須說(shuō)明，本發(fā)明列舉的這些實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例2:式(I)化合物間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯對(duì)雙氧水H202所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用活性試驗(yàn)2.1實(shí)驗(yàn)材料與樣品2丄1細(xì)胞大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。2丄2實(shí)驗(yàn)試劑2.1.2.1雙氧水(hydrogenperoxide,H202)、硝基四氮唑蘭(nitrobluetetrazolium,NBT)、菲咯嗪(ferrozine)購(gòu)自Sigma公司；2丄2.2槲皮素(quercetin)由浙江大學(xué)藥學(xué)院中藥與天然藥物研究室實(shí)驗(yàn)室9提供(純度為99°/。)；水飛薊賓(Silybin)購(gòu)自遼寧盤錦天源藥業(yè)有限公司，HPLC檢測(cè)純度98%。2.1.2.3Tris堿，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；2.1.2.43-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide(MTT)購(gòu)自▲mresco公司；2丄2.5小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；2丄2.6青霉素和鏈霉素由石家莊制藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)；2丄2.7其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自杭州華東醫(yī)藥試劑有限公司。2丄3儀器2.1.3.1酶標(biāo)儀Synergy-HT型，BIO-TEK公司；2丄3.2立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠;2丄3.3紫外分光光度計(jì)UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司；2丄3.4超純水系統(tǒng)UPWS-I-60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；2丄3.5除菌過(guò)濾器Sterifi脂型，Millipore公司;2丄3.6氣浴恒溫振蕩器THZ-C，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；2丄3.7C02細(xì)胞培養(yǎng)箱MMM，德國(guó)公司；2丄3.S倒置顯微鏡XD-2型，重慶光電儀器有限公司。2.2實(shí)驗(yàn)原理雙氧水H202是一種主要的活性自由基的前體，它可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的凋亡，PC12細(xì)胞(大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞)可模擬腦神經(jīng)細(xì)胞，因此常用它來(lái)作為研究藥物與神經(jīng)細(xì)胞之間關(guān)系的模型，用MTT測(cè)細(xì)胞的存活率，如果待測(cè)化合物有清除由H202引起的自由基、保護(hù)細(xì)胞抗氧化損傷的作用，則其細(xì)胞存活率就高，相應(yīng)之OD值也高，反之細(xì)胞存活率和OD值均低。本發(fā)明中的實(shí)驗(yàn)采用了對(duì)唐希燦所報(bào)道的方法(XiaoqiuXiao等，A^^wc/1999,275:73-76)加以改進(jìn)后用以測(cè)定化合物對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。2.3細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞用含10。/。小牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37。C、5%二氧化碳C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。2.4實(shí)驗(yàn)方法2.4.1細(xì)胞毒性的測(cè)定首先用改良的MTT法測(cè)定了待測(cè)化合物對(duì)PC12細(xì)胞增殖的作用。PC12細(xì)胞用胰酶-EDTA消化液消化，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至8000個(gè)/毫升的密度，然后接種于96孔細(xì)胞板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24小時(shí)后，分別將新配的待測(cè)的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中，使孔中式(I)化合物的最終濃度分別為16、8和4微克/毫升。72小時(shí)后，加入10微升MTT(5毫克/毫升)的生理鹽水溶液，繼續(xù)在37。C，5%C02潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)，棄去原液，每孔中加入150微升二甲亞砜，振蕩溶解生成的MTT晶體甲臜，用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下比色，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式如下%細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(OD溶劑對(duì)照一OD樣品)/OD溶劑對(duì)照x100^/oo2.4.2式(I)化合物對(duì)H202所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的測(cè)定PC12細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10%牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升鏈霉素。細(xì)胞以每孔8000個(gè)的密度加到96孔板中，在37°C，50。/。C02潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時(shí)。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化以及用MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活率。細(xì)胞經(jīng)36小時(shí)的孵育后，將新配的式(I)化合物的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中。作用2小時(shí)后加入新配的H202(終濃度為600微摩爾/升)作用3小時(shí)，顯微鏡觀察記錄，棄去原培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液100微升，然后加入MTT10微升，3小時(shí)后，小心吸去培養(yǎng)液，加入150微升DMSO溶解甲臜，于570nm處讀數(shù)。采用槲皮素和水飛薊賓為陽(yáng)性對(duì)照藥物。2.4.3試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表一。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>1649.24%_§_48.82%槲皮素3252.82%1647.99%845.47%2.5結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果表明，式(I)化合物具有非常強(qiáng)效的對(duì)抗自由基引起的PC12細(xì)胞損傷作用，在測(cè)試的所有高、中、低濃度情況下該化合物抗氧化損傷作用都強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照藥物槲皮素。說(shuō)明該23位間氯苯甲?；〈?,3-脫氫水飛薊賓酯屬于具有強(qiáng)效保護(hù)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞作用的抗氧化物質(zhì)。測(cè)定化合物對(duì)H202所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可作為初步探討其保護(hù)中樞腦神經(jīng)細(xì)胞的作用機(jī)理之依據(jù)。故據(jù)該化合物表現(xiàn)出對(duì)雙氧水損傷所致PC12細(xì)胞的強(qiáng)效保護(hù)作用之事實(shí)，可預(yù)期其對(duì)老年性癡呆癥的治療有非常積極的作用。實(shí)施例3:式(I)化合物間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3,5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯抑制自由基誘導(dǎo)之脂質(zhì)過(guò)氧化物生成的活性試驗(yàn)3.1實(shí)驗(yàn)原理脂質(zhì)過(guò)氧化是自由基作用于多不飽和脂肪酸的產(chǎn)物，含量與自由基的生成正相關(guān)，由于機(jī)體有抗氧化的酶系及非酶系的保護(hù)作用，使自由基不斷產(chǎn)生又不斷被清除。隨著年齡的增長(zhǎng)，體內(nèi)的抗氧化劑不斷下降，清除自由基的能力逐漸減弱，脂質(zhì)過(guò)氧化作用則增強(qiáng)，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物增多。因此，測(cè)定樣品抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，是篩選抗氧化、抗衰老藥物的重要指標(biāo)之一。本研究用維生素C-F^+系統(tǒng)誘導(dǎo)大鼠肝勻漿產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛MDA，MDA能與硫代巴比妥酸TBA反應(yīng)，產(chǎn)物在532nm處有最大吸收，通過(guò)MDA量的變化間接反映化合物對(duì)肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用。3.2實(shí)驗(yàn)材料與樣品3.2.1試驗(yàn)動(dòng)物SD(sprague-dawley)大鼠購(gòu)自浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；合格證號(hào)SCXK(浙2007-0029)。3.2.2實(shí)驗(yàn)試劑123.2.2.1硫酸亞鐵FeS04溶液國(guó)產(chǎn)FeS04分析醇試劑，購(gòu)自杭州華東試劑公司，使用前按照要求自配；3.2.2.2維生素Vc溶液國(guó)產(chǎn)Vc分析醇試劑，購(gòu)自杭州華東試劑公司，使用前按照要求自配；3.2.2.3三氯醋酸溶液國(guó)產(chǎn)CCl3C02H分析醇試劑，購(gòu)自杭州華東醫(yī)藥試劑有限公司，使用前按照要求自配；3.2.2.4磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫代巴比妥酸及其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純(杭州華東醫(yī)藥試劑有限公司)；3.2.2.5槲皮素(quercetin)由浙江大學(xué)藥學(xué)院中藥與天然藥物研究室實(shí)驗(yàn)室提供(純度為99%);水飛薊賓(Silybin)購(gòu)自遼寧盤錦天源藥業(yè)有限公司，HPLC檢測(cè)純度98。/。。。3.3實(shí)驗(yàn)材料與樣品3.3.1酶標(biāo)儀Synergy-HT型，BIO-TEK公司；3.3.2立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠；3.3.3紫外分光光度計(jì)UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司；3.3.4超純水系統(tǒng)UPWS-I-60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；3.3.5恒溫水浴箱上海森信試驗(yàn)科學(xué)儀器公司；3.3.6氣浴恒溫振蕩器THZ-C，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；3.3.7臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)TGL-16G，上海安亭儀器廠。3.4實(shí)驗(yàn)方法抑制自由基誘導(dǎo)之脂質(zhì)過(guò)氧化物生成乃通過(guò)鼠肝微粒體檢測(cè)。3.4.1肝微粒體的制備取SD實(shí)驗(yàn)大鼠5只斷頭處死，迅速取出肝臟，用超速離心法制備肝微粒體。3.4.2樣品對(duì)鼠肝脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用在含F(xiàn)eS04(4微摩爾/升)與Vc(50微摩爾/升)的1毫升緩沖液中加入200微克/毫升微粒體中，以誘導(dǎo)產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化，同時(shí)加入不同濃度的待測(cè)化合物樣品，37。C孵育30分鐘后加入l毫升三氯醋酸(20%)中止反應(yīng)加入1.5毫升硫代巴比妥酸(0.76%)，100'C沸水浴處理20分鐘，離心去除蛋白沉淀，在532nm波長(zhǎng)下測(cè)定上清吸光度。脂質(zhì)過(guò)氧化以反應(yīng)中生成的丙二醛表示，實(shí)驗(yàn)以槲皮素和水飛薊賓作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。用緩沖液代替反應(yīng)液作為空白對(duì)照組，加入同樣體積DMSO的為溶劑對(duì)照組。樣品對(duì)大鼠肝微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率的計(jì)算公式如下抑制率(％)=(OD樣品管一OD空白管)/(OD標(biāo)準(zhǔn)管一OD空白管)x100%。3.5試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表二。表二.式(I)化合物對(duì)大鼠肝微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用樣品半數(shù)抑制濃度IC50(微克/毫升)式(I)化合物10.46水飛薊賓33.89槲皮素0.53試驗(yàn)結(jié)果表明，化合物間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-l，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯具有較強(qiáng)的抑制自由基誘導(dǎo)之脂質(zhì)過(guò)氧化物生成能力，其半數(shù)抑制濃度IC5()為10.46微克/毫升。3.6結(jié)論式(I)化合物屬于具有比較強(qiáng)效的保護(hù)細(xì)胞抗氧化物質(zhì)，其抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力雖遜于陽(yáng)性對(duì)照藥物槲皮素，但遠(yuǎn)超出對(duì)照品水飛薊賓3倍之多，提示該23位間氯苯甲酰基取代的2，3-脫氫水飛薊賓酯具有一定的保肝護(hù)肝功效以及可預(yù)期用于制備預(yù)防或治療急慢性肝損傷類疾病的作用，值得進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用，或與其他相關(guān)藥物聯(lián)合使用。實(shí)施例4:式(I)化合物間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3,5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯對(duì)黃嘌呤氧化酶XO的抑制作用試驗(yàn)4.1實(shí)驗(yàn)材料與樣品4丄1試驗(yàn)動(dòng)物SD(sprague-dawley)大鼠于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)得；合格證號(hào)SCXK(浙2007-0029)。4丄2實(shí)驗(yàn)試劑4.1.2.1吩嗪硫酸甲酯(phenazinemethosulfate,PMS)、硝基四氮唑蘭(nitrobluetetrazolium,NBT)、黃嘌呤、菲咯嗪(ferrozine)購(gòu)自Sigma公司；4.1.2.2TritonX-100購(gòu)自Gibco公司；144丄2.3陽(yáng)性對(duì)照藥物別嘌醇，泰州美通藥業(yè)有限公司；4丄2.4磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀及其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純(杭州華東試劑公司)。4丄3儀器4.1.3.1酶標(biāo)儀Synergy-HT型，BIO-TEK公司；4丄3.2立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠;4丄3.3紫外分光光度計(jì)UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司；4丄3.4超純水系統(tǒng)UPWS-I-60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；4丄3.5除菌過(guò)濾器Sterifi1500型，Millipore公司；4丄3.6氣浴恒溫振蕩器THZ-C，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；4丄3.7玻璃勻漿器國(guó)產(chǎn)。4.2實(shí)驗(yàn)方法4.2.1取SD大鼠，斷頭處死，迅速取出肝臟至預(yù)冷的磷酸緩沖液(100毫摩爾/升，pH8.75)中，去除血管，剪碎后用磷酸緩沖液l:1(w/v)稀釋后在冰上直接勻漿，于-2CTC保存，用前以磷酸緩沖液(1:7)稀釋，4r:條件下離心(8000rpm/分鐘)，取上清作為酶原。4.2.2式(I)化合物對(duì)XO的抑制作用測(cè)定采用酶聯(lián)免疫ELISA法樣品孔中加入底物黃嘌呤(0.1毫克/毫升，600微升)，酶(30微升)，式(I)化合物用二甲亞砜溶解，用磷酸緩沖液稀釋，每孔30微升，使其終濃度為40微克/毫升、20微克/毫升和10微克/毫升，加入硝基蘭四氮唑和吩嗪甲硫酸酯(30微升)，最后加入TritonX-100(0.4%，IO微升)，在37。C中水浴保溫2小時(shí)，于550nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定。式(I)化合物對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制率由樣品OD值對(duì)于空白和對(duì)照OD值計(jì)算。黃嘌呤氧化酶抑制率(％)二[(OD標(biāo)準(zhǔn)管—OD空白管)一(OD樣品管—OD樣品空白管)〗/(OD標(biāo)準(zhǔn)管—OD空白管)x100%。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果式(I)化合物在40微克/毫升時(shí)對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制率為35.21%，而陽(yáng)性對(duì)照別嘌醇40微克/毫升時(shí)抑制率為89.2%，半數(shù)抑制濃度IC50=3.34xl0'5摩爾/升。4.4結(jié)論式(I)化合物對(duì)黃嘌呤氧化酶有一定的抑制活性，說(shuō)明該化合物具有進(jìn)一步發(fā)展成為療效確切的黃嘌呤酶抑制劑的潛能。權(quán)利要求1.具有式(I)所示結(jié)構(gòu)的23位間氯苯甲?；〈?，3-脫氫水飛薊賓或其可藥用鹽；式(I)化合物的名稱為間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯；id="icf0001"file="A2009100962930002C1.tif"wi="85"he="43"top="60"left="53"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>式(I)。2.—種制備式(I)化合物的方法，其特征是水飛薊賓脫水后形成的2,3-脫氫水飛薊賓在縮合催化劑和膦鹽存在下，與間氯苯甲酸進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)而得。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征是所述之縮合催化劑是指偶氮二甲酸二乙酯，膦鹽是指三苯基膦。4.式(I)所示化合物或其可藥用鹽在制備抗氧化劑藥物中的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于式(I)所示的23位間氯苯甲?；〈?,3-脫氫水飛薊賓或其可藥用鹽用于制備防治腦細(xì)胞組織氧化或腦神經(jīng)氧化所致疾病的藥物的用途。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物用途，其特征在于式(I)所示的23位間氯苯甲?；〈?,3-脫氫水飛薊賓或其可藥用鹽在制備防治老年性癡呆癥藥物中的應(yīng)用。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于式(I)所示的23位間氯苯甲?；〈?,3-脫氫水飛薊賓或其可藥用鹽在制備防治肝腦脂質(zhì)過(guò)氧化引起之疾病的藥物中的應(yīng)用。8.權(quán)利要求7中所述的肝腦脂質(zhì)過(guò)氧化引起之疾病是指急慢性肝損傷、肝炎和/或腦動(dòng)脈粥樣硬化癥。9.式(I)所示之23位間氯苯甲?；〈?，3-脫氫水飛薊賓或其可藥用鹽在制備黃嘌呤氧化酶抑制劑藥物中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物用途，其特征在于式(I)所示的23位間氯苯甲酰基取代的2，3-脫氫水飛薊賓或其可藥用鹽在制備治療痛風(fēng)病藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及間氯苯甲酰基取代脫氫水飛薊賓及其制備方法和藥物用途，具體而言，本發(fā)明涉及一個(gè)23位間氯苯甲酰基取代的2，3-脫氫水飛薊賓的制備方法和用途。該化合物具有抑制自由基誘導(dǎo)的脂過(guò)氧化物生成的活性，可以預(yù)期用于制備防治脂質(zhì)過(guò)氧化物引起的急慢性肝損傷、肝炎、腦動(dòng)脈粥樣硬化癥藥物的用途。該化合物還表現(xiàn)出很強(qiáng)的對(duì)抗自由基引起的PC12細(xì)胞損傷作用，可以預(yù)期發(fā)展成為保護(hù)腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥的藥物。此外，該化合物具有強(qiáng)效抑制黃嘌呤氧化酶活性，可以預(yù)期發(fā)展成為防治由黃嘌呤氧化酶引起的疾病的藥物。文檔編號(hào)A61P1/00GK101575335SQ20091009629公開(kāi)日2009年11月11日申請(qǐng)日期2009年3月5日優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日發(fā)明者伍義行,馮玉冰,巫秀美,蘇曾,李校堃,楊雷香,佳瞿,昱趙,黃可新,龔景旭申請(qǐng)人:溫州醫(yī)學(xué)院;李校堃