專利名稱：星型多臂plga/peg兩親性嵌段共聚物及其應用的制作方法
技術領域：
針對目前尚無有效治療手段延緩慢性阻塞性肺疾患(簡稱慢阻肺，C0PD)的病程或抑制小氣道及肺實質的炎癥，提供一種新型COPD藥物載體材料，利用該材料可制備得到的多種劑型的肺靶向藥物，通過靜脈注射和吸入給藥，達到治療COPD的目的；其可增加藥物對靶組織的指向性和滯留性，降低藥物對正常細胞的毒性，減少劑量，提高藥物制劑的生物利用度。
背景技術：
慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺氣腫、慢性肺源性心臟病甚至心力衰竭、呼吸衰竭等醫(yī)學上通稱為慢性阻塞性肺疾患，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計報道，慢性支氣管炎、肺心病等慢性阻塞性肺疾患已是世界上第四位死亡原因，且呈上升趨勢，我國更為嚴峻。COPD在世界范圍內的重要性和發(fā)病率的日益增加已引起廣泛的關注，然而，COPD 的藥物治療鮮有進展，有的針對炎性過程，或針對結構細胞。有些特殊的治療方法是阻止 COPD發(fā)生發(fā)展中炎癥細胞進入氣道以及肺實質，包括采用拮抗黏附分子和化學因子的藥物，以及拮抗TNF-α和增加IL-10的治療方法。目前抑制纖維化的療法主要是針對轉化生長因子-β 1和蛋白酶激活受體-2的研究。針對絲氨酸蛋白酶和MMP的抑制劑，阻止對肺的破壞，阻斷肺氣腫的發(fā)展。在新療法治療COPD的早期臨床研究中，一個需著重考慮的問題是如何將藥物有效地運送到周圍肺病變區(qū)，以及尋找有效的生化標記物和導引技術，而不影響正常的組織和器官。設計和構建能夠特異性導向病變器官、組織或細胞的靶向性傳遞系統(tǒng)，可將藥物或顯影劑富集于病變部位，而在正常部位分布很少，可以大大降低藥物的毒副作用。靶向性給藥還對研究疾病的發(fā)病機理、提高臨床影像診斷的靈敏度、實現(xiàn)個性化治療具有非常重要的意義，是目前臨床治療COPD的迫切需求。國內外有研究發(fā)現(xiàn)，粒徑在5 30um范圍內的藥物分子通過被動靶向濃集于肺， 過小易到達肝，過大易在靜注時栓塞。金屬氧化物類、多肽與蛋白類(酶)、核苷酸類、糖類及其它生物活性小分子等具有主動靶向作用。金屬氧化物或金屬螯合物作為物理靶向材料，通過溫場、磁場的導向作用，將包載藥物的納米粒子濃集或固定于生物體內的某一個特定部位或區(qū)域，并通過擴散和滲透作用使藥物得以緩慢釋放，且對周圍正常組織不產(chǎn)生毒副作用。如在磁共振影像(MRI)中，為得到某一部位的清晰圖像，防止其他器官干擾，通過磁靶向作用，將磁性對比劑富集到這個器官附近，藥物形成高濃度區(qū)域，緩慢釋放。多肽和蛋白類靶向分子包括單克隆抗體或抗體片段、RGD短肽類、細胞生長因子的受體等。單克隆抗體或抗體片段是最普遍的靶向分子，常用的抗體有抗血小板內皮細胞粘附分子(PECAM)-I抗體、抗腫瘤相關抗原(TAA)抗體、抗組織因子(TF)單克隆抗體一因子 VIKfactor, f VII)、抗血管內皮生長因子(VEGF)單克隆抗體等，是炎癥、心血管及腫瘤疾病靶向治療中常用的靶向抗體分子。RGD短肽是指含精-甘-天冬序列片段的短肽分子，靶向于內皮細胞表面的整合素類粘附受體，可以調控內皮細胞與纖維蛋白原、層粘連蛋白的粘附，是藥理學干預的主要靶標。
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糖類靶向分子包括乳糖、半乳糖為末端的糖蛋白、肝素等，作用于肝實質細胞(PC) 上的去唾液酸蛋白受體，該受體介導的胞吞作用使其攜載的藥物定向轉運。天然或人工合成與SLeX結構類似的低聚糖，如甘草多糖、路易斯寡糖及其衍生物等，能與選擇素特異性識別和結合，從而靶向到處于激活狀態(tài)的血管內皮表面，阻斷選擇素的生理效用，達到抗炎的目的。理論上，如果我們能夠設計同時高效載藥和靶向分子的載體，通過靶向分子的主動靶向作用，將藥物導向病變部位，即實現(xiàn)直接對病癥細胞釋放藥物，可大大降低藥物的全身毒副作用，將從根本上改變目前的COPD治療現(xiàn)狀。因此研究和發(fā)展多功能靶向性藥物傳遞系統(tǒng)具有非常重要的意義，是當今醫(yī)學界的迫切需求?；谝陨闲枨蟮闹鲃影邢蛩幬锏脑O計和合成，成為生物醫(yī)藥領域研究的核心挑戰(zhàn)。要求藥物載體分子在載靶分子、載藥前后不僅具有穩(wěn)定性、體內安全性，還要求具有多個活性基團以連接靶向分子、連接后不影響靶向分子的活性；具有靈活可調的親水性和疏水性鏈段，可通過化學或物理結合包載診斷顯影劑、治療藥物，實現(xiàn)高載藥容量；具有相對簡單的制備工藝，可制成不同劑型適應不同靶向部位、不同給藥途徑的需要。當前靶向藥物由于存在靶點選擇的不準確性，會引起免疫原性，單一靶點結合不強，會導致肝臟的快速清除作用或對肝臟或心臟造成損害，并導致給藥系統(tǒng)的靶向效率很低。例如，最近用于乳腺癌治療的曲妥珠單抗引起了的嚴重并發(fā)癥，出現(xiàn)心衰和心功能下降，而抗血管生成靶向治療藥物的常常引起高血壓等副作用。設計具有多個活性位點的載體分子，可以同時結合多個靶向分子和多種藥物，實現(xiàn)靶向多價性和藥物的協(xié)同作用，可以更加精確定位藥物在病灶部位的分布，更快地促進病癥消失。具有這些特性的候選載體有聚乳酸PLA，聚乙醇酸(PGA)以及共聚物(PLGA)， PLGA/聚乙二醇(PEG)類嵌段共聚物、PEG與聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚氰基丙烯酸丁酯、聚3-羥丁酸酯、殼聚糖和聚己內酯(PCL)的接枝或共混產(chǎn)物、聚乙烯亞胺(PEI)、聚酰胺-胺型(PAMAM)樹枝狀大分子(dendrimer)、聚丙二撐胺(PPI)和肽類樹枝狀大分子(含肽鍵結構)等。但已有的PLGA/PEG嵌段共聚物主要為線型共聚物，分子結構中缺乏可修飾位點， 無法連接有效劑量的靶向分子，不能滿足體內靶向載體的要求。有的研究者在PLGA微球表面修飾多糖類聚合物，如殼聚糖等，增加表面的可修飾性功能基團，這種方法雖然可解決靶向分子的修飾問題，但是卻喪失了 PLGA/PEG膠束的長循環(huán)功能。具有體內導向和靶向功能的載體材料尚處于初始研究階段，缺乏系統(tǒng)性和規(guī)律性，迄今尚沒有任何一種成功主動靶向藥物傳遞載體用于臨床COPD治療。

發(fā)明內容
本發(fā)明采用具有優(yōu)良生物相容性和兩親性的系列新型的星型多臂PLGA/PEG兩親性嵌段共聚物，其以PEG為親水鏈段，PLGA為疏水鏈段，不改變聚合物化學成分，而是通過分子構型的改變調控其性能，保持了單聚物原有的生物安全性和性能可控性；并通過其豐富的可修飾端基，攜帶多種靶向分子，并在體內復雜環(huán)境中能靈活機動地導向靶分子，從而可極大提高體內與靶分子結合的能力；其兩親性結構可組裝形成核殼膠束，星型多臂的分子構型可使膠束外殼的PEG親水層更具有穩(wěn)定性，從而可更有效保護載體不被人體網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)清除，實現(xiàn)體內長循環(huán)。有報道顯示，相同分子量的六臂聚合物對于藥物的包封率要高于線型共聚物，星型多臂PLGA/PEG兩親性嵌段共聚作為體內靶向藥物載體將具有獨特的優(yōu)越性。PLGA/PEG兩親性嵌段共聚物膠束，其特征在于該嵌段共聚物具有星型多臂結構； 其以PEG為親水鏈段，PLGA為疏水鏈段；該共聚物的端基攜帶靶向分子，并在體內復雜環(huán)境中能導向靶分子；其兩親性結構可組裝形成核殼膠束，星型多臂的分子構型可使膠束外殼的PEG親水層穩(wěn)定。該共聚物膠束與靶向分子進行共價連接，靶向分子為糖分子、多肽或蛋白分子、核酸分子中的一種或多種。其中糖分子選自乳糖、半乳糖、甘露糖、甘草多糖、唾液酸化或者巖藻糖化N-乙酰氨基乳糖中的一種或多種；多肽或蛋白分子選自單克隆抗體或抗體片段、RGD肽、細胞生長因子的受體中的一種或多種，其中多肽或蛋白分子與端胺基 PLGA/PEG嵌段共聚物載體的連接，采用胺基偶連方法與端羧基載體偶連、羧基偶連方法與端氨基載體偶連或巰基偶連方法與端氨基載體偶連。如上所述的PLGA/PEG兩親性嵌段共聚物與藥物分子制成的靶向復合載藥膠束， 其特征在于，該膠束對兩種以上靶向分子及藥物分子體系進行組裝，先分別連接靶向分子和藥物分子，然后將兩個體系混合，得到復合膠束；或在載體自組裝載藥以后，分步偶連每種靶向分子，得到復合膠束。上述共聚物膠束可包載納米超順磁四氧化三鐵；該膠束包載納米超順磁四氧化三鐵的嵌段共聚物的制備方法，其步驟如下將星型PLGA/PEG共聚物溶于疏水性有機溶劑中，將納米四氧化三鐵超聲分散于有機相中，在高速攪拌下將有機相滴加到蒸餾水中，持續(xù)攪拌使有機溶劑揮發(fā)后即可得到包有鐵磁流體的納米膠束。如上所述的兩親性嵌段共聚物用于制備體內肺部器官的靶向藥物載體中的應用； 如上所述的兩親性嵌段共聚物用于制備體內靶向治療慢性阻塞性肺疾患的藥物載體中的應用；如上所述的兩親性嵌段共聚物，其特征在于治療慢性阻塞性肺疾患的藥物為皮質類固醇或支氣管擴張。發(fā)明詳述如下(1)系列多臂星型PLGA/PEG嵌段共聚物膠束包載納米超順磁四氧化三鐵納米超順磁四氧化三鐵(SPIO)可用于磁靶向定位、MRI顯影。制備方法是將星型 PLGA/PEG共聚物溶于疏水性有機溶劑中，將納米四氧化三鐵超聲分散于有機相中，在高速攪拌下將有機相滴加到蒸餾水中，持續(xù)攪拌使有機溶劑揮發(fā)后即可得到包有鐵磁流體的納米膠束，如附圖1所示。(2)星型PLGA/PEG嵌段共聚物與靶向分子的共價連接分別與糖、肽或蛋白、核酸靶向分子與載體分子的連接。(i)糖類分子，如乳糖、半乳糖、甘露糖、甘草多糖、唾液酸化及巖藻糖化N-乙酰氨基乳糖(sLeX及sLeA)等。對于不含胺基的糖類，對其羥基進行羧化后，通過羧基與端胺基星型PLGA/PEG嵌段共聚物進行偶連，對于含有胺基的糖類，直接用其氨基偶連。如圖3所
7J\ ο(ii)多肽或蛋白類分子，如單克隆抗體或抗體片段、RGD肽、細胞生長因子的受體等。靶向分子或多肽及蛋白類藥物分子與端胺基星型PLGA/PEG嵌段共聚物載體的連接，采用胺基偶連方法與端羧基載體偶連、采用羧基偶連方法與端氨基載體偶連、采用巰基偶連方法與端氨基載體偶連。對于蛋白質多肽類大分子與載體分子的偶連，考慮偶連后蛋白質的失活問題，因此將選擇特定的蛋白質偶連劑，如sulfo-SMCC，在溫和的條件下進行偶連， 盡量避免蛋白的失活。同時，在蛋白質的偶連反應中，由于蛋白的分子量較大，需要考慮靶向分子偶連后對共聚物結構以及自組裝形態(tài)的影響。因此，采用兩種偶連-組裝方式先偶連后組裝；或先組裝后偶連。(iii)核酸配體(aptamer)分子。通過端胺基星型PLGA/PEG嵌段共聚物連接抗核酸抗體、親合素-生物素、慢病毒、腺病毒等基因載體系統(tǒng)后再結合核酸分子；也可通過端氨基星型PLGA/PEG共聚物載體的正電荷作用直接結合核酸分子，通過電荷相互作用自組裝形成高分子載體-核酸聚電解質復合物，但需要考慮核酸配體空間結構變化而引起的靶向性失活。(3)具有靶向分子的星型PLGA/PEG嵌段共聚物膠束的載藥實驗(i)抗體、核酸配體、藥物前體(prodrug)類藥物的連接，同上節(jié)。(ii)其它親水、疏水性藥物的膠束自組裝方法，疏水性(以皮質類固醇為例)、親水性(以異丙托溴銨為例)。對于疏水性藥物，將星型PLGA/PEG嵌段共聚物、疏水性藥物共同溶解于疏水性有機溶劑中，將該有機相緩慢滴加到大量蒸餾水中，持續(xù)攪拌，使有機溶劑蒸發(fā)，有機相固化后即可得到含有疏水性藥物的納米膠束，如附圖2所示。對于親水性藥物，采用復乳法包埋，通過調節(jié)兩親性星型PLGA/PEG嵌段共聚物的親水鏈段與疏水鏈段的比例，使其在水溶液中自組裝形成納米微囊結構，通過其內水相包載親水性藥物，如附圖3 所示。為克服當前COPD治療藥物的半衰期短、易受酶解和難以通過肺毛細血管等缺點， 結合皮質類固醇和支氣管擴張劑等多種臨床有效COPD治療藥物，以達到更好的臨床治療效果。(4)多功能靶向復合載藥膠束體系的組裝及表征對于兩種以上靶向分子及藥物分子體系的組裝，可以采用以上方法分別連接靶向分子和藥物分子，然后將兩個體系混合，得到復合膠束；也可以在載體自組裝載藥以后，分步偶連每種靶向分子，最終得到的復合膠束如圖4所示。按照中國藥典2005版的方法測定制備后膠束的載藥量、包封率和體外釋放。采用表面等離子共振檢測技術，在檢測芯片上固化對應的靶標分子，在模擬血流條件下測定修飾后納米膠束與靶標分子之間的結合常數(shù)和結合量，動態(tài)、量化地評價載體靶向分子與靶標分子的結合活性，結合容量和結合穩(wěn)定性。靶向載藥復合物的臨界膠束濃度擬采用芘為探針，用熒光方法測定。膠束的形態(tài)、尺寸、電性，分散度、平均聚集數(shù)及內核密度、聚集體穩(wěn)定性擬通過低溫掃描電鏡(SEM)，透射電鏡(TEM)、原子力顯微鏡(AFM)、動態(tài)光散射(DLS)、靜態(tài)光散射 (SLS)、zeta電位儀等方法表征。采用表面紅外光譜、X射線光電子能譜儀(XPQ、熒光及化學發(fā)光法測定靶向分子在納米膠束中的結合量。(5)生物體外靶向定位性能研究(i)體外細胞培養(yǎng)研究多功能靶向載藥納米膠束的細胞靶向性、藥物緩釋性和生物利用度。采用雙熒光探針分別標記膠束內藥物和膠束表面的靶向分子，通過激光共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察納米膠束在細胞黏附和細胞攝入過程中的狀態(tài)，觀察細胞過程、測定細胞
6攝入量；通過標記物及溶酶體檢測試劑等，研究細胞攝入途徑和機制，評價藥物的體外生物利用度。(ii)在外磁場作用下，研究各種流變力學因素對測試系統(tǒng)內的磁性納米膠束的定位性能的影響。(iii)采用離體肺灌流系統(tǒng)研究各種流變力學因素對活性聚合物黏附的影響。測定時，按一定流速灌注血液后，采用形態(tài)學或放射性核素的方法，觀察血小板在內皮下組織的黏附情況。采用離體肺灌流系統(tǒng)研究各種流變力學因素對靶向納米載藥膠束的血管黏附影響。通過體外熒光標記法觀察納米膠束對血管損傷部位特異性結合情況，以及體內觀察納米膠束對靶向血管損傷部位以及黏附性的情況。(6)生物安全性評價根據(jù)生物材料國家評價標準，對靶向藥物載體納米膠束的生物安全性包括細胞毒性(如通過噻唑藍比色法，即MTT法)等進行安全性評價；觀察降解產(chǎn)物對局部生理環(huán)境的影響，包括PH值、離子濃度等；研究各種載藥納米粒子在體內的降解過程及分布；研究載體分子降解后共價或鰲合的靶向診斷與治療分子的細胞毒性、免疫毒性及體內清除機制；采用小鼠急性毒性試驗、致敏試驗對新型聚合物進行初步生物安全性評價。本發(fā)明選用的治療藥劑，均是批準上市的或已經(jīng)進入臨床實驗的藥品，如皮質類固醇和異丙托溴銨。綜上所述，本發(fā)明申請的內容未見文獻報導，具有新穎性/創(chuàng)造性和切實的可行性。


1、附圖1為磁性納米膠束示意圖。2、附圖2為連接有靶向分子的載體包載疏水性藥物示意圖。3、附圖3為連接有靶向分子的載體包載親水性藥物(如異丙托溴銨)所形成的微囊結構示意圖。4、附圖4兩種以上載靶分子及靶藥分子體系的混合示意圖
權利要求
1.一種PLGA/PEG兩親性嵌段共聚物膠束，其特征在于該嵌段共聚物具有星型多臂結構；其以PEG為親水鏈段，PLGA為疏水鏈段；該共聚物的端基攜帶靶向分子，并在體內復雜環(huán)境中能導向靶分子；其兩親性結構可組裝形成核殼膠束，星型多臂的分子構型可使膠束外殼的PEG親水層穩(wěn)定。
2.如權利要求1所述的PLGA/PEG兩親性嵌段共聚物膠束，其特征在于膠束包載納米超順磁四氧化三鐵。
3.如權利要求1所述的PLGA/PEG兩親性嵌段共聚物膠束，其特征在于所述共聚物膠束與靶向分子進行共價連接，靶向分子為糖分子、多肽或蛋白分子、核酸分子中的一種或多種。
4.如權利要求3所述的PLGA/PEG兩親性嵌段共聚物膠束，其特征在于糖分子選自乳糖、半乳糖、甘露糖、甘草多糖、唾液酸化或者巖藻糖化N-乙酰氨基乳糖中的一種或多種。
5.如權利要求3所述的PLGA/PEG兩親性嵌段共聚物膠束，其特征在于多肽或蛋白分子選自單克隆抗體或抗體片段、RGD肽、細胞生長因子的受體中的一種或多種，其中多肽或蛋白分子與端胺基PLGA/PEG嵌段共聚物載體的連接，采用胺基偶連方法與端羧基載體偶連、 羧基偶連方法與端氨基載體偶連或巰基偶連方法與端氨基載體偶連。
6.一種如權利要求1-5之一所述的PLGA/PEG兩親性嵌段共聚物與藥物分子制成的靶向復合載藥膠束，其特征在于，該膠束對兩種以上靶向分子及藥物分子體系進行組裝，先分別連接靶向分子和藥物分子，然后將兩個體系混合，得到復合膠束；或在載體自組裝載藥以后，分步偶連每種靶向分子，得到復合膠束。
7.如權利要求2所述的包載納米超順磁四氧化三鐵的嵌段共聚物的制備方法，其步驟如下將星型PLGA/PEG共聚物溶于疏水性有機溶劑中，將納米四氧化三鐵超聲分散于有機相中，在高速攪拌下將有機相滴加到蒸餾水中，持續(xù)攪拌使有機溶劑揮發(fā)后即可得到包有鐵磁流體的納米膠束。
8.如權利要求1-6之一所述的兩親性嵌段共聚物用于制備體內肺部器官的靶向藥物載體中的應用。
9.如權利要求1-6之一所述的兩親性嵌段共聚物用于制備體內靶向治療慢性阻塞性肺疾患的藥物載體中的應用。
10.如權利要求1-6之一所述的兩親性嵌段共聚物，其特征在于治療慢性阻塞性肺疾患的藥物為皮質類固醇或支氣管擴張劑。
全文摘要
提供一種新型COPD藥物載體材料，采用具有優(yōu)良生物相容性和兩親性的系列新型的星型多臂PLGA/PEG兩親性嵌段共聚物，其以PEG為親水鏈段，PLGA為疏水鏈段不改變聚合物化學成分；并通過其豐富的可修飾端基，攜帶多種靶向分子，并在體內復雜環(huán)境中能靈活機動地導向靶分子，從而可極大提高體內與靶分子結合的能力；其兩親性結構可組裝形成核殼膠束，星型多臂的分子構型可使膠束外殼的PEG親水層更具有穩(wěn)定性，從而可更有效保護載體不被人體網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)清除，實現(xiàn)體內長循環(huán)；利用該材料可制備得到的多種劑型的肺靶向藥物，達到治療COPD的目的；其可增加藥物對靶組織的指向性和滯留性，降低藥物對正常細胞的毒性，減少劑量，提高藥物制劑的生物利用度。
文檔編號A61K49/12GK102464874SQ20101054111
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月12日 優(yōu)先權日2010年11月12日
發(fā)明者王小倩, 王蕾, 韓雙紅 申請人:王小倩, 王蕾, 韓雙紅