專利名稱：一種工程化脂肪組織的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物材料的組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種工程化脂肪組織的制備 方法。
背景技術(shù)：
每年全世界有數(shù)百萬例因創(chuàng)傷、腫瘤切除術(shù)和先天性缺陷導(dǎo)致的軟組織缺損患 者，需要通過手術(shù)進(jìn)行修復(fù)重建。這些缺損常因脂肪組織的缺失而導(dǎo)致正常組織的形態(tài)改 變和功能障礙。隨著對(duì)功能性恢復(fù)的要求和美觀考慮，對(duì)一些深部軟組織的缺損需要塑型， 使患者的心理創(chuàng)傷降到最低。目前軟組織重建常用的方法包括各種組織瓣移植或人工合成替代物的植入，但目 前尚無一種填充材料可以滿足所有的臨床需要。利用自體脂肪組織移植(游離移植或真皮 脂肪瓣移植)修復(fù)軟組織缺損的歷史比較久遠(yuǎn)，也有不少臨床應(yīng)用的報(bào)告，但因游離移植 的脂肪成活率低、容易吸收，真皮脂肪瓣移植操作復(fù)雜、不易塑形，效果并不理想。隨著組織 工程學(xué)技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建工程化的脂肪組織已成為組織工程研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。工程化脂肪組織是應(yīng)用正常脂肪組織的活細(xì)胞或可向脂肪細(xì)胞分化的干細(xì)胞，在 體外進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，再接種到三維結(jié)構(gòu)的生物相容性支架上培養(yǎng)，然后將其從體外培養(yǎng) 環(huán)境轉(zhuǎn)移至體內(nèi)，能促進(jìn)與受區(qū)細(xì)胞整合和血管長(zhǎng)入；最終，工程化脂肪組織中的支架材料 在降解過程中逐步被宿主健康的軟組織取代。為使工程化脂肪組織成功地應(yīng)用于臨床上的 軟組織重建，需要處理好工程化脂肪組織構(gòu)建程序中的各環(huán)節(jié)，包括種子細(xì)胞和支架材料 的選擇、細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境和轉(zhuǎn)移方式等。種子細(xì)胞的選擇應(yīng)用前脂肪細(xì)胞(preadi pocyte)和成熟脂肪細(xì)胞(Mature adipocyte)作為種子細(xì)胞構(gòu)建工程化脂肪組織來修復(fù)組織缺損，存在以下缺點(diǎn)在移植后 由于新生血管不能快速長(zhǎng)入工程化脂肪組織中心區(qū)域，成熟脂肪細(xì)胞無法得到充足的血 供，很快液化壞死，使組織難以長(zhǎng)期存活，常常導(dǎo)致移植的脂肪組織被吸收。成熟的脂肪細(xì) 胞在培養(yǎng)過程中處于分化終末期，其增殖能力有限，不能輕易地?cái)U(kuò)增。前脂肪細(xì)胞，雖然容 易培養(yǎng)、擴(kuò)增，而且能分化為成熟的脂肪細(xì)胞，但是前脂肪細(xì)胞經(jīng)多次傳代后，也會(huì)喪失分 化能力。干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化能力的細(xì)胞，能產(chǎn)生表現(xiàn)型和基因型與自 己完全相同的子細(xì)胞，同時(shí)還能分化為祖細(xì)胞；本發(fā)明人研究認(rèn)為，應(yīng)用干細(xì)胞作為工程化 脂肪組織的種子細(xì)胞是理想的選擇。支架材料在組織工程組織的構(gòu)建中占有舉足輕重的地位。理想的三維支架應(yīng)具有 臨時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的作用，為脂肪組織工程種子細(xì)胞提供附著、增殖、分化和營(yíng)養(yǎng)代謝 的場(chǎng)所。細(xì)胞以其附著的三維支架為微環(huán)境，發(fā)展形成新的脂肪組織?，F(xiàn)已開發(fā)有許多不 同種類的人工合成支架材料，包括聚乙醇酸(PGA)、聚對(duì)苯二甲酸乙酯(PET)、多聚共乳乙 交酯酸(PLGA)和聚四氟乙烯(PTEF)，以及天然衍生材料，例如膠原，透明質(zhì)酸衍生物，基質(zhì) 膠和纖維蛋白等也已得到應(yīng)用。在設(shè)計(jì)支架時(shí)需要考慮支架的機(jī)械性能、降解特性、免疫 原性、細(xì)胞對(duì)材料的反應(yīng)性、臨床應(yīng)用是否易于操作并能減少成本等?？捎糜诠こ袒窘M
3織構(gòu)建的支架材料很多，合適的支架材料選擇，應(yīng)具有適合細(xì)胞的黏附、增殖和分化，良好 的生物相容性，可降解及易于操作的特性。美國(guó)航天局(NASA)制備的微重力旋轉(zhuǎn)發(fā)生器(rotary cell culturesysterm RCCS)是采用水平旋轉(zhuǎn)、無氣泡的膜擴(kuò)散式氣體交換的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)中細(xì)胞通過膜 式氣體交換器完成吸氧和排出CO2，任何氣泡都會(huì)被清除，消除了旋渦對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響； 細(xì)胞和微載體在水平的旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)容器內(nèi)產(chǎn)生一個(gè)均勻的、極低剪切力的液體懸浮軌 道，細(xì)胞可在微載體表面均勻生長(zhǎng)，隨著細(xì)胞的增殖，可調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)的速度來抵償沉降速率； 由于該系統(tǒng)沒有推進(jìn)器、空氣升液器，細(xì)胞顆粒不會(huì)與容器壁或任何易致傷的物體相碰，故 沒有破壞性的剪切力；RCCS最重要的優(yōu)勢(shì)是可以模擬微重力環(huán)境，對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn) 生一定的影響。微重力條件對(duì)細(xì)胞的增殖和分化有著不同的作用，可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，影 響間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨和成軟骨分化。本發(fā)明在研究中發(fā)現(xiàn)，微重力也有利于脂肪組織的 形成。目前的組織工程脂肪是采用各種材料結(jié)合脂肪前體細(xì)胞或是干細(xì)胞，通過誘導(dǎo)后 在體內(nèi)形成脂肪。其存在以下缺點(diǎn)血管化不足，體內(nèi)移植容易液化壞死；誘導(dǎo)時(shí)機(jī)不確 切，體外誘導(dǎo)時(shí)間太長(zhǎng)；不能夠大規(guī)模生產(chǎn)；可注射的種類較少。因此研發(fā)新的制備方法已 成為脂肪組織工程的發(fā)展趨勢(shì)。經(jīng)檢索，未見有與本發(fā)明相同的工程化脂肪組織制備方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種工程化脂肪組織的制備方法，使所獲得的工程化脂肪組 織具有粒徑大小可調(diào)和可注射的優(yōu)點(diǎn)，適用于軟組織充填、修復(fù)軟組織缺損造成的凹陷畸 形、美容塑形，快速成活形成脂肪組織。本發(fā)明所提出的工程化脂肪組織的制備方法，其特征在于，在微重力條件下，將間 充質(zhì)干細(xì)胞接種到微?；纳镏Ъ懿牧仙希⑾蛑炯?xì)胞方向誘導(dǎo)，在微重力旋轉(zhuǎn)發(fā)生 器中生長(zhǎng)、成熟形成具有活性的工程化脂肪組織；所述的微?；镏Ъ懿牧鲜敲髂z、膠 原、透明質(zhì)酸、殼聚糖、硫酸軟骨素、聚乳酸、聚羥基乙酸、脫細(xì)胞真皮、脫細(xì)胞豬小腸粘膜下 層的任一種或是任幾種的組合；所述的微?；镏Ъ懿牧狭綖?0 1000 μ m。所述的 間充質(zhì)干細(xì)胞為可向脂肪細(xì)胞分化的間充質(zhì)干細(xì)胞，是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪源性間充 質(zhì)干細(xì)胞、牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞的任一種。本發(fā)明所述的工程化脂肪組織的制備方法，包括有微?；镏Ъ艿闹苽?、培養(yǎng) 基的配制、以及工程化脂肪組織的三維培養(yǎng)，具體步驟包括步驟一.選擇微?；镏Ъ芪⒘；镏Ъ懿牧峡梢赃x擇已商品化的產(chǎn)品或 自行制備；其材質(zhì)為機(jī)體可接受的生物可降解材料，包括明膠、膠原、透明質(zhì)酸、殼聚糖、硫 酸軟骨素、聚乳酸、聚羥基乙酸、脫細(xì)胞真皮、脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層的任一種或是幾種的 組合；微?；镏Ъ懿牧狭綖?0 1000 μ m，是空心球狀、或?qū)嵭那驙?、或多孔微粒?結(jié)構(gòu)的任一種；步驟二 .配制培養(yǎng)基按9 1的體積比將α-MEM商用培養(yǎng)液與胎牛血清混合為 基礎(chǔ)液；按500ml基礎(chǔ)液標(biāo)準(zhǔn)加入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 50ng，腺嘌呤12 17mg， 轉(zhuǎn)鐵蛋白1 10mg，維生素C5 30mg，制備成基礎(chǔ)培養(yǎng)基；再用基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制以下培養(yǎng)基；誘導(dǎo)培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10 200 μ M地塞米松，0. 1 ImM異丁基甲基 黃嘌呤，100 300 μ M吲哚美辛，10 100 μ g/ml胰島素；維持培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加有10 100 μ g/ml胰島素；步驟三.細(xì)胞的獲取將原代間充質(zhì)干細(xì)胞按20 200個(gè)細(xì)胞/cm2接種到細(xì)胞 培養(yǎng)板上，用α-MEM商用培養(yǎng)液與胎牛血清按4 1的體積比混合的培養(yǎng)液，在體外經(jīng)過 擴(kuò)增培養(yǎng)10 15天，每3天換液一次；間充質(zhì)干細(xì)胞呈克隆樣生長(zhǎng)，而摻雜其中的非間充 質(zhì)干細(xì)胞由于接種密度低，其生長(zhǎng)受到抑制，從而獲取多克隆的干細(xì)胞；將多克隆的間充質(zhì) 干細(xì)胞經(jīng)過傳代培養(yǎng)，獲取第3 5代的間充質(zhì)干細(xì)胞；步驟四.將獲取的間充質(zhì)干細(xì)胞與微粒化生物支架重量按IO6 IO7個(gè)細(xì)胞/g的 比例加入微重力旋轉(zhuǎn)發(fā)生器中，培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；接種后靜置0. 5 1小時(shí)，旋轉(zhuǎn)5 15分鐘后再靜置，如此靜置旋轉(zhuǎn)反復(fù)3 4次后，開始旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速15轉(zhuǎn)/分；步驟五.在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過程中，每2天排空在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的氣泡；培養(yǎng)3 4天后，更換培養(yǎng)液為維持培養(yǎng)基；再培養(yǎng)3天后，更換培養(yǎng)液為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 4天，完成工程化脂肪組織的制備。所形成的脂肪，細(xì)胞圍繞微?；镏Ъ苌L(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)有 大量脂滴堆積。本發(fā)明采用可向脂肪細(xì)胞分化的間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合可降解的微粒化生物支架材 料，在微重力條件下向脂肪細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化，獲得在體內(nèi)可發(fā)育再生的微?；窘M織。 所制備的工程化脂肪組織不僅與天然脂肪結(jié)構(gòu)相似，具有一定的彈性和韌性，其形狀和大 小能根據(jù)具體需求制備，大量生產(chǎn)、長(zhǎng)期貯存；且適于Iml注射器注射，便于臨床應(yīng)用，適用 于大面積軟組織缺損的手術(shù)修復(fù)；其在體內(nèi)可以繼續(xù)發(fā)育為成熟的脂肪組織，易于血管長(zhǎng) 入；在臨床治療中可提高脂肪移植成功率，主要功能有用于凹陷畸形的修復(fù)(如顳部、頰 部凹陷)，美容充填，軟組織功能重建等；尤其在美容充填中，本發(fā)明制備的工程化脂肪組 織可促進(jìn)外形恢復(fù)、防止液化壞死。本發(fā)明方法中的間充質(zhì)干細(xì)胞在微?；镏Ъ懿牧媳砻娉嗜S方向生長(zhǎng)，且隨 著材料的不同可向微粒中心生長(zhǎng)，所形成的脂肪結(jié)構(gòu)與天然脂肪相似；在培養(yǎng)過程中，誘導(dǎo) 時(shí)間短，啟動(dòng)了間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪分化的信號(hào)通路，但又不在體外達(dá)到終末分化，將該工 程化脂肪組織植入體內(nèi)，可防止脂肪組織的液化，在體內(nèi)隨著微?；镏Ъ懿牧系慕到猓?最終形成與天然脂肪類似的結(jié)構(gòu)。附圖及其說明附

圖1為本發(fā)明實(shí)例1所制備工程化脂肪組織的照片，圖A為相差顯微鏡觀察間 充質(zhì)干細(xì)胞在明膠微球表面生長(zhǎng)的照片，可以看出脂肪干細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)中可以很好 的與明膠微球黏附并在其表面生長(zhǎng)；圖B為激光共聚焦觀察脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在微球上生 長(zhǎng)的照片，可以看出通過細(xì)胞膜和細(xì)胞核兩種熒光染色可見，脂肪干細(xì)胞均勻分布在明膠 微球的表面；圖C為掃描電鏡觀察脂肪干細(xì)胞在明膠微球表面生長(zhǎng)的照片，可看出脂肪干 細(xì)胞在明膠微球上黏附并伸展。附圖2為本發(fā)明實(shí)例1所制備的工程化脂肪組織移植動(dòng)物 體內(nèi)生長(zhǎng)情況的照片，圖A為未經(jīng)向脂肪細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化的脂肪干細(xì)胞與微球移植動(dòng)物 體內(nèi)8周的照片；圖B為經(jīng)向脂肪細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化的脂肪干細(xì)胞與微球移植動(dòng)物體內(nèi)8 周的照片，與圖A相比沒有明顯的差別；圖C為未經(jīng)向脂肪細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化的脂肪干細(xì)胞
5與微球移植動(dòng)物體內(nèi)8周后油紅0染色的組織學(xué)照片，可見只有少量的脂滴形成；圖D為經(jīng) 向脂肪細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化的脂肪干細(xì)胞與微球移植動(dòng)物體內(nèi)8周后油紅0染色的組織學(xué)照 片，可見大量的脂滴形成，與天然脂肪組織類似。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)例1、步驟一.微?；镏Ъ苓x擇明膠為材料，制備成粒徑100 150 μ m的實(shí)心 球狀結(jié)構(gòu)；方法參考(Adipose tissue engineering based on humanpreadipocytes combined with gelatin microspheres containing basicfibroblast growth factor. Biomaterials. 2003 Jun ；24 (14) :2513_21·)。步驟二 .將α-MEM商用培養(yǎng)液與胎牛血清按9 1的體積比混合為基礎(chǔ)液；按 500ml基礎(chǔ)液標(biāo)準(zhǔn)加入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10ng，腺嘌呤15mg，轉(zhuǎn)鐵蛋白5mg，維生素 C 30mg,制備成基礎(chǔ)培養(yǎng)基；再用基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制以下培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入100 μ M地塞米松(dexamethasone，美國(guó)Sigma 公司)，0· 5mM 異丁基甲基黃嘌呤(isobutyl-methyl xanthine，美國(guó) Sigma 公司)，200 μ M 吲哚美辛(indomethasone)和50 μ g/ml胰島素；維持培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入50 μ g/ml胰島素；步驟三.細(xì)胞的獲取將自體或者異體來源的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，在體外按200個(gè) 細(xì)胞/cm2接種到細(xì)胞培養(yǎng)板上，用α-MEM商用培養(yǎng)液與胎牛血清按4 1體積比混合的培 養(yǎng)液，經(jīng)過擴(kuò)增培養(yǎng)10天，每3天換液一次；獲得多克隆干細(xì)胞；經(jīng)過傳代培養(yǎng)，獲取第3 5代的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；步驟四.將體外培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與微?；镏Ъ馨碔O6 IO7個(gè)/g的 比例加至微重力旋轉(zhuǎn)發(fā)生器(美國(guó)國(guó)家航空航天局(NASA)旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng))中，加入 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，靜置0. 5小時(shí)，旋轉(zhuǎn)15分鐘后再靜置，如此靜置旋轉(zhuǎn)反復(fù)4次，再以15轉(zhuǎn)/分 的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)；步驟五.在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過程中，每2天用基礎(chǔ)培養(yǎng)基排空在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的 氣泡；培養(yǎng)3天后，更換培養(yǎng)液為維持培養(yǎng)基；再培養(yǎng)3天后，更換培養(yǎng)液為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼 續(xù)培養(yǎng)4天，則完成工程化脂肪組織的制備。
0034]所形成的微?；窘M織，細(xì)胞圍繞微?；镏Ъ苌L(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴堆 積(參見附圖1)；其適用于顏面部微小軟組織注射充填美容。實(shí)例2、步驟一.微粒化生物支架選擇脫細(xì)胞真皮基質(zhì)為材料，制備成粒徑為300 800 μ m 白勺多孑L球狀結(jié)構(gòu)；方法參考(Expansion and delivery of humanfibroblasts on micronized acellular dermal matrix for skinregeneration. Biomaterials. 2009May ； 30(14) 2666-74)；步驟二 .將α-MEM商用培養(yǎng)液與胎牛血清按9 1的體積比混合為基礎(chǔ)液；按 500ml基礎(chǔ)液標(biāo)準(zhǔn)加入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子50ng，腺嘌呤12mg，轉(zhuǎn)鐵蛋白10mg，維生素C IOmg,制備成基礎(chǔ)培養(yǎng)基；再用基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制以下培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10 μ M地塞米松(dexamethasone，美國(guó)Sigma 公司)，ImM 異丁基甲基黃嘌呤(isobutyl-methyl xanthine，美國(guó) Sigma 公司)，100 μ M 吲 哚美辛(indomethasone)禾口 10 μ g/ml 胰島素；維持培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10 μ g/ml胰島素；步驟三.細(xì)胞的獲取將自體或者異體來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在體外按60個(gè) 細(xì)胞/cm2接種到細(xì)胞培養(yǎng)板上，用α-MEM商用培養(yǎng)液與胎牛血清按4 1體積比混合的 培養(yǎng)液，經(jīng)過擴(kuò)增培養(yǎng)，培養(yǎng)15天，每3天換液一次；獲得多克隆干細(xì)胞；經(jīng)過傳代培養(yǎng)，獲 取第3 5代的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；步驟四.將體外培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與微?；镏Ъ馨碔O6 IO7個(gè)/g的 比例加至微重力旋轉(zhuǎn)發(fā)生器中，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，靜置0. 5小時(shí)，旋轉(zhuǎn)10分鐘后再靜置，如 此靜置旋轉(zhuǎn)反復(fù)4次，再以15轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)；步驟五.在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過程中，每2天用基礎(chǔ)培養(yǎng)基排空在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的 氣泡；培養(yǎng)4天后，更換培養(yǎng)液為維持培養(yǎng)基；再培養(yǎng)3天后，更換培養(yǎng)液為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼 續(xù)培養(yǎng)4天，則完成工程化脂肪組織的制備。所形成的微?；窘M織，細(xì)胞圍繞微?；镏Ъ苌L(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴堆 積。其適用于大面積軟組織缺損的充填修復(fù)。
權(quán)利要求
一種工程化脂肪組織的制備方法，包括有微?；镏Ъ艿闹苽洌涮卣髟谟?，在微重力條件下，將間充質(zhì)干細(xì)胞接種到微?；纳镏Ъ苌?，并向脂肪細(xì)胞方向誘導(dǎo)，在微重力旋轉(zhuǎn)發(fā)生器中生長(zhǎng)、成熟形成具有活性的工程化脂肪組織；所述的微粒化生物支架材料為明膠、膠原、透明質(zhì)酸、殼聚糖、硫酸軟骨素、聚乳酸、聚羥基乙酸、脫細(xì)胞真皮、脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層的任一種或是任幾種的組合，其粒徑為20～1000μm；所述的間充質(zhì)干細(xì)胞為可向脂肪細(xì)胞分化的間充質(zhì)干細(xì)胞，是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞、牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞的任一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，具體步驟包括步驟一.選擇微?；镏Ъ芪⒘；镏Ъ懿牧蠟槊髂z、膠原、透明質(zhì)酸、殼聚糖、 硫酸軟骨素、聚乳酸、聚羥基乙酸、脫細(xì)胞真皮、脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層的任一種或是幾種 的組合；微?；镏Ъ転榭招那驙?、或?qū)嵭那驙?、或多孔微粒狀結(jié)構(gòu)的任一種；步驟二 .配制培養(yǎng)基按9 1的體積比將α-MEM商用培養(yǎng)液與胎牛血清混合為基礎(chǔ) 液；按500ml基礎(chǔ)液標(biāo)準(zhǔn)加入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 50ng，腺嘌呤12 17mg，轉(zhuǎn)鐵 蛋白1 10mg，維生素C 5 30mg，制備成基礎(chǔ)培養(yǎng)基；再用基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制以下培養(yǎng)基； 誘導(dǎo)培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10 200 μ M地塞米松，0. 1 ImM異丁基甲基黃嘌 呤，100 300 μ M吲哚美辛，10 100 μ g/ml胰島素；維持培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加有10 100 μ g/ml胰島素；步驟三.細(xì)胞的獲取將原代間充質(zhì)干細(xì)胞按20 200個(gè)細(xì)胞/cm2接種到細(xì)胞培養(yǎng) 板上，用α-MEM商用培養(yǎng)液與胎牛血清按4 1的體積比混合的培養(yǎng)液，在體外經(jīng)過擴(kuò)增 培養(yǎng)10 15天，每3天換液一次；將多克隆的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過傳代培養(yǎng)，獲取第3 5 代的間充質(zhì)干細(xì)胞；步驟四.將獲取的間充質(zhì)干細(xì)胞與微?；镏Ъ苤亓堪碔O6 IO7個(gè)細(xì)胞/g的比例 加入微重力旋轉(zhuǎn)發(fā)生器中，培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；接種后靜置0. 5 1小時(shí)，旋轉(zhuǎn)5 15分 鐘后再靜置，如此靜置旋轉(zhuǎn)反復(fù)3 4次后，開始旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速15轉(zhuǎn)/分；步驟五.在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過程中，每2天排空在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的氣泡；培養(yǎng)3 4 天后，更換培養(yǎng)液為維持培養(yǎng)基；再培養(yǎng)3天后，更換培養(yǎng)液為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 4 天，完成工程化脂肪組織的制備。
全文摘要
一種工程化脂肪組織的制備方法，本發(fā)明是在微重力條件下，將間充質(zhì)干細(xì)胞接種到微?；纳镏Ъ苌?，并向脂肪細(xì)胞方向誘導(dǎo)，在微重力旋轉(zhuǎn)發(fā)生器中生長(zhǎng)、成熟形成具有活性的工程化脂肪組織；本發(fā)明所制備的工程化脂肪組織不僅與天然脂肪結(jié)構(gòu)相似，具有一定的彈性和韌性，其形狀和大小能根據(jù)具體需求制備，大量生產(chǎn)、長(zhǎng)期貯存；且適于注射，便于臨床應(yīng)用，適用于大面積軟組織缺損的手術(shù)修復(fù)；其在體內(nèi)可以繼續(xù)發(fā)育為成熟的脂肪組織，易于血管長(zhǎng)入；在臨床治療中可提高脂肪移植成功率，可用于凹陷畸形的修復(fù)、美容充填、軟組織功能重建等；尤其在美容充填中可促進(jìn)外形恢復(fù)、防止液化壞死。
文檔編號(hào)A61L27/24GK101954120SQ201010280320
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者楊改葉 申請(qǐng)人:陜西博鴻生物科技有限公司