專利名稱：一種靶向性mri對比劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學材料領(lǐng)域，具體涉及一種靶向性MRI對比劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
MRI,即磁共振成像，英文全稱為Magnetic Resonance Imaging,又稱為核磁共振成像。MRI利用核磁共振原理，依據(jù)所釋放的能量在物質(zhì)內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)環(huán)境中不同的衰減， 通過外加梯度磁場檢測所發(fā)射出的電磁波，即可得知構(gòu)成這一物體原子核的位置和種類， 據(jù)此可以繪制成物體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)圖像。人體各種組織含有大量的水和碳氫化合物，所以氫核以其核磁共振靈活度高、信號強等特點作為人體MRI首選。核磁共振信號強度與樣品中氫核密度有關(guān)，人體中各種組織以及病灶組織含水比例不同，即含氫核數(shù)的多少不同，則核磁共振信號強度有差異，利用這種差異作為特征量，把各種組織分開，這就是氫核密度的磁共振圖像。MRI可對人體各部位多角度、多平面成像，其分辨力高，能更客觀更具體地顯示人體內(nèi)的解剖組織及相鄰關(guān)系，對病灶能更好地進行定位定性，對全身各系統(tǒng)疾病的診斷，尤其是早期腫瘤的診斷有很大的價值。在MRI發(fā)展早期，一般認為無需使用MRI對比劑(MRI造影劑)即可完成人體MRI 診斷檢查。但是，隨著MRI在臨床上的廣泛應用，人們需要MRI能顯示一些較小的病變，使一部分疑難病癥得以確診，例如腫瘤的早期診斷，這就需要進一步提高MRI影像的對比度。 目前提高MRI影像的對比度的常用手段就是將MRI對比劑引入被診斷者體內(nèi)，人為地改變病灶組織的磁共振(MR)特征參數(shù)，使得病灶組織與正常組織間的區(qū)別更加明顯。MRI對比劑是通過內(nèi)外界弛豫效應和磁化率效應間接地改變組織的信號強度，按增強類型可分為陽性和陰性對比劑二大類，目前應用最廣泛的陽性對比劑為Gd-DTPA，中文名為二乙三胺五醋酸釓或釓噴酸葡甲胺鹽，商品名為馬根維顯(Magnevist)，我們通常稱作釓劑；應用最廣泛的陰性對比劑為葡聚糖包被的超順磁性氧化鐵顆粒，商品名為菲立磁。釓劑能夠應用于腫瘤的診斷，但是其注射量較大，本身帶有一定的毒性，并且現(xiàn)在有關(guān)注射釓劑出現(xiàn)的過敏反應病例越來越多，使得其安全性受到質(zhì)疑；而葡聚糖包被的超順磁性氧化鐵顆粒的陰性對比劑則更加安全，由于人體能夠吸收利用鐵原子，故合理劑量的超順磁性氧化鐵不會對人體造成影響，然而如菲立磁這種的陰性對比劑只能應用于淋巴結(jié)及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)非靶向成像，無腫瘤靶向MRI顯像能力，無法應用于腫瘤的診斷中。針對上述問題，有研究者根據(jù)腫瘤細胞膜上表達的特異性蛋白為抗原，制備成抗體，連接到陰性MRI對比劑中，以便陰性MRI對比劑能夠與腫瘤細胞特異性結(jié)合，使陰性MRI 對比劑具有靶向性，從而增加腫瘤早期診斷的靈敏性和準確性。但是，陰性MRI對比劑中所連接的抗體分子量通常比較大，免疫原性較強，易被人體免疫系統(tǒng)識別、吞噬與降解，使得陰性MRI對比劑的靶向性大大降低，故MRI靶向陰性對比劑基本都停留在實驗室階段。此外，不同腫瘤細胞膜表達的特異性蛋白不同，故陰性MRI對比劑所攜帶的抗體只能針對一種腫瘤的診斷，應用范圍比較狹窄。因此，研發(fā)一種新型的靶向性、廣泛性陰性MRI對比劑對腫瘤診斷具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種靶向性MRI對比劑及其制備方法，使得該 MRI對比劑能夠靶向于腫瘤細胞，避免免疫原性問題，應用于多種腫瘤診斷中。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案一種靶向性MRI對比劑的制備方法，將外層包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒與在SEQ ID NO :1所示序列5'端修飾有氨基的RNA共價偶聯(lián)即得，所述共價偶聯(lián)為 RNA 5,端氨基與葡聚糖上的羧基共價偶聯(lián)。其中，所述超順磁性氧化鐵微粒直徑優(yōu)選為18-22nm，更優(yōu)選為20nm，所述外層包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒與所述RNA的質(zhì)量比優(yōu)選為3-4 1-1.2。本發(fā)明所述外層包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒從上海交通大學微納研究院購得，也可以通過氧化葡聚糖上羥基為羧基獲得羧基葡聚糖，然后用共沉淀一步法與FeCl3 · 6H20、FeCl2 · 4H20制備即得外層包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒。SEQ ID NO : I所示序列的核苷酸為人血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF165)的核酸適配子(Aptamer),即VEGF165_Aptamer。本發(fā)明的VEGF165_Aptamer是人工合成的經(jīng)過修飾后在空氣中不被降解的可與VEGF165特異結(jié)合的RNA。其中，除從5'端起第4、5位堿基未修飾外，其余堿基均人工修飾，所有嘧啶(C，U)為核糖環(huán)2’位被氟修飾(2’ -F-C或 2’ -F-U)，所有嘌呤(A，G)為核糖環(huán)2’位被甲基修飾(2’ -0-CH3-A或2’ -0-CH3-G)，同時， 51端修飾游離氨基。本發(fā)明所述的在SEQ ID NO :I所示序列5'端修飾有氨基的RNA(即 VEGF165-Aptamer)從大連寶生物工程有限公司修飾并購得。本發(fā)明所述共價偶聯(lián)為RNA 5,端氨基與葡聚糖上的羧基共價偶聯(lián)，偶聯(lián)的具體方法本發(fā)明不做限制，在明確了偶聯(lián)方式的前提下，利用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)即可偶聯(lián)得到。作為優(yōu)選，所述RNA 5,端氨基與葡聚糖上的羧基共價偶聯(lián)的具體方法為將外層包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒用N-(3- 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺活化后，與所述RNA在37°C、200r/min下偶聯(lián)4h。其中，所述外層包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒、N-(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺的質(zhì)量比優(yōu)選為3-4 : 2. 5 : 5。本發(fā)明還提供一種由本發(fā)明所述制備方法制備的MRI對比劑。本發(fā)明所述MRI對比劑為陰性對比劑(造影劑)，核心為超順磁性氧化鐵(USPIO)微粒，也稱四氧化三鐵微粒， USPIO外層由改性葡聚糖-羧基葡聚糖(dextran)包被，葡聚糖帶有的羧基與本發(fā)明所述 RNA的5,端游離氨基共價偶聯(lián)。本發(fā)明所述MRI對比劑的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1，圖I只是為方便理解各組分的連接關(guān)系的示意圖，并不代表所述MRI對比劑真實三維結(jié)構(gòu)以及限制所述MRI對比劑結(jié)構(gòu)為圖 I所示。其中，在本發(fā)明的某些具體實施例中，所述MRI對比劑的偶聯(lián)量為每Img外層包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒偶聯(lián)1221pmol的所述RNA。VEGF165主要生物學功能就是增加腫瘤區(qū)血管內(nèi)皮增生，增加新生血管通透性，促進腫瘤細胞增殖。一旦有腫瘤發(fā)生，腫瘤細胞高表達VEGF165，VEGF165引起內(nèi)皮細胞增殖失控以及血管通透性增加，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移起重要作用，它幾乎在所有腫瘤細胞中都表達，如腸癌、食管癌、膽管癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、甲狀腺癌、 成骨肉瘤、慢性淋巴細胞白血病、腦腫瘤、頭頸腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、宮頸癌、上皮性卵巢腫瘤、舌癌。而本發(fā)明所述RNA(即VEGF165-Aptamer)，對VEGF165有專一的高親和性，所以在進行腫瘤早期診斷時，將本發(fā)明所述靶向性MRI對比劑通過靜脈注射到被檢測者體內(nèi)，靶向性MRI對比劑就會與VEGF165特異性結(jié)合，如果有腫瘤疾病發(fā)生，則通過磁共振成像技術(shù) (MRI)就可以判讀是否發(fā)生腫瘤疾病。同時，VEGF165-Aptamer與抗體相比，分子量較小，避免了免疫源性問題。由于VEGF165_Aptamer本身帶有氨基，且沒有相關(guān)研究能夠表明 VEGF165-Aptamer本身帶有的氨基與羧基葡糖共價偶聯(lián)后是否會影響其生物活性，為了嚴謹起見，本發(fā)明人為在VEGF165_Aptamer的5'端引入游離的氨基。VEGF165_Aptamer本身帶有的氨基的結(jié)合力要遠大于引入的游離氨基的結(jié)合力，故能夠有效保證與羧基葡聚糖偶聯(lián)時是通過5'端氨基來實現(xiàn)。在本發(fā)明所述MRI對比劑的體外靶向性細胞增殖試驗中，除空白對照組(不加 VEGF165及本發(fā)明對比劑)外其余各組臍靜脈內(nèi)皮細胞均提前加入等量VEGF165，試驗結(jié)果顯示加入本發(fā)明對比劑高、中、低組的細胞數(shù)量高于空白組的細胞數(shù)量，而低于非靶向性陰性MRI對比劑(菲立磁)組，且隨加入本發(fā)明對比劑減少，臍靜脈內(nèi)皮細胞數(shù)量遞增。表明本發(fā)明所述MRI對比劑能夠在體外特異性與VEGF165有效結(jié)合，拮抗VEGF165引起細胞增殖，對VEGF165有很強靶向性。在荷瘤小鼠靶向性試驗中，注射本發(fā)明所述MRI對比劑后的腫瘤區(qū)MRI圖像的信號明顯下降、變暗，而注射非靶向性陰性MRI對比劑(菲立磁)的腫瘤區(qū)MRI圖像的信號未有明顯變化，表明本發(fā)明所述MRI對比劑在體內(nèi)也能特異性與VEGF165結(jié)合，從而改變腫瘤區(qū)域的弛豫效應和磁化率效應，間接地改變組織的信號強度。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明所述MRI對比劑為陰性對比劑，以超順磁性氧化鐵為核心微粒，其外層包被羧基葡聚糖，羧基再與所述VEGF165-Aptamer的5'端氨基共價偶聯(lián)，其連接的VEGF165-Aptamer能夠靶向于腫瘤細胞中的VEGF165，且避免了免疫源性缺陷，能夠應用于多種腫瘤診斷中。


圖I所示為本發(fā)明所述MRI對比劑結(jié)構(gòu)示意圖；圖2所示為本發(fā)明所述MRI對比劑偶聯(lián)檢測凝膠電泳圖；其中，I泳道為Marker，最下為50bp條帶；2泳道為本發(fā)明所述RNA條帶；3泳道為本發(fā)明所述MRI對比劑條帶；圖3所示為本發(fā)明所述MRI對比劑體外靶向性細胞增殖試驗柱形圖；其中，I為空白組，2為本發(fā)明所述MRI對比劑高劑量組(50 μ L)，3為本發(fā)明所述 MRI對比劑中劑量組(25 μ L)，4為本發(fā)明所述MRI對比劑低劑量組(12. 2 μ L)，5為菲立磁組(50 μ L)；柱形圖縱坐標表示HUVEC細胞光密度值，與細胞數(shù)量呈正比關(guān)系；4/7頁圖4所示為注射MRI對比劑前荷瘤小鼠的磁共振儀的平掃圖；其中，圖中白色箭頭所指為腫瘤區(qū)域，A為擬注射本發(fā)明所述MRI對比劑的平掃圖，信號強度為2346特斯拉，B為擬注射菲立磁的平掃圖，信號強度為2100特斯拉；圖5所示為注射MRI對比劑3小時后荷瘤小鼠的磁共振儀掃描圖；其中，圖中白色箭頭所指為腫瘤區(qū)域，A為注射本發(fā)明所述MRI對比劑3小時后的掃描圖，信號強度為172特斯拉，B為注射菲立磁3小時后的掃描圖，信號強度為1900特斯拉;圖6所不為注射MRI對比劑6小時后荷瘤小鼠的磁共振儀掃描圖；其中，圖中白色箭頭所指為腫瘤區(qū)域，A為注射本發(fā)明所述MRI對比劑6小時后的掃描圖，信號強度為2076特斯拉，B為注射菲立磁6小時后的掃描圖，信號強度為1900特斯拉。
具體實施例方式本發(fā)明公開了一種靶向性MRI對比劑及其制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品及方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術(shù)。依照本發(fā)明所述一種靶向性MRI對比劑的制備方法，所述外層包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒可以通過氧化葡聚糖上羥基為羧基獲得羧基葡聚糖，然后用共沉淀一步法與FeCl3 · 6H20、FeCl2 · 4H20制備即得，其具體方法為步驟I、將O. 2g/ml的葡聚糖加熱至70°C攪拌，同時加入lOmol/L的NaOH反應5h， 再加入5mol/L氯乙酸，70°C恒溫20min,待反應體系冷卻后,調(diào)節(jié)pH = 8,用甲醇沉淀反應物，然后純化、濃縮、凍干，得到帶有羧基的葡聚糖，備用；步驟2、隔絕氧氣條件下，向lmol/L的FeCl3 · 6H20中加入FeCl2 · 4H20制得 FeCl3 · 6H20-FeCl2 · 4H20混合液備用，加熱O. 33g/mL帶有羧基的葡聚糖至75°C，加入配制好的混合液，然后滴加NH4OH調(diào)節(jié)pH值為7獲得黑色懸浮液，離心取上清，利用凝膠色譜法分離并收集首峰溶液，所得首峰溶液透析后超濾濃縮成10mg/mL，制得外層包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒的濃縮液。其中，作為優(yōu)選，步驟I所述葡聚糖、NaOH、氯乙酸的體積比為50 5 3，步驟2 所述？冗13*6氏0和？冗12*4!120的質(zhì)量比為2.05 1，步驟2所述混合液與帶有羧基的葡聚糖的體積比為I : 3,步驟2所述透析時間為24h。將上述外層包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒制成MRI對比劑，其中所述 RNA 5,端氨基與葡聚糖上的羧基共價偶聯(lián)的具體方法為洗滌上述制得的濃縮液，加入5mg/mL的N-(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺和10mg/mL的N-羥基硫代琥珀酰亞胺活化，磁分離去上清后洗滌，然后加入所述RNA，PBS 調(diào)節(jié)RNA的濃度為1-1. 2 μ g/μ L進行偶聯(lián)，然后磁分離去上清后封閉，再次磁分離去上清后洗滌即得所述MRI對比劑。其中，所述包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒、Ν-(3_ 二甲氨基丙
6基)-3-乙基碳二亞胺、N-羥基硫代琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為3-4 2. 5 5，所述包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒與所述核苷酸的質(zhì)量比為3-4 1-1. 2，所述洗滌為采用 pH值為5. 0-6. O的PBS進行洗滌，所述活化為在37°C、150-200轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下活化20-30 分鐘，所述封閉為37°C下用質(zhì)量百分數(shù)為1%的BSA封閉。在上述偶聯(lián)步驟中，N-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺(EDC)與葡聚糖上的羧基反應形成可與氨基反應的O-?；逯虚g體，但是此種中間體不穩(wěn)定，容易被水解重新釋放出羧基。在N-羥基硫代琥珀酰亞胺(SUflo-NHS)存在下，EDC可將羧基轉(zhuǎn)化成氨基反應活性的SUflo-NHS酯，然后其上的羧基與本發(fā)明所述RNA共價偶聯(lián)。除上述方法外，還可以選用本領(lǐng)域其他常規(guī)方法。下面結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明。實施例I :制備本發(fā)明所述MRI對比劑將IOg葡聚糖T-40溶解在50ml水中，加熱至70°C，攪拌，同時加入5ml的IOmol/ L的NaOH反應5h，再加入3ml的5mol/L氯乙酸，70°C恒溫20min，待反應體系冷卻后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH = 8 ;用甲醇沉淀反應物，在苯乙烯型陰陽離子型樹脂(陰與陽離子型樹脂的比例為1.5 I)中純化，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上50°C真空濃縮，然后將產(chǎn)物凍干，即得到帶有羧基的葡聚糖T-40，備用。制備5ml lmol/L 的 FeCl3 · 6H20,并加入 660mg FeCl2 · 4H20，N2 保護待用。稱取上述帶有羧基的葡聚糖T-405. Og溶解在15mL —次蒸餾水中，N2保護下加熱到75°C， 加入配制好的FeCl3 · 6H20-FeCl2 · 4H20混合液，同時勻速滴加NH4OH,充分攪拌，調(diào)節(jié)PH =7,得到黑色的懸浮液，1500r/min離心IOmin,取上層清液。用凝膠色譜柱Sephacryl S-300HR(2. 6cmX40cm)分離并收集首峰溶液，洗脫液為lOmol/L的醋酸鈉(pH = 6. 5)，所得溶液在去離子水中透析24h，然后超濾濃縮為10mg/mL，制得由羧基葡聚糖T-40包被的超順磁性氧化鐵微粒的濃縮液，4°C存儲備用。取200 μ L上述濃縮液到2mL離心管，用500 μ L PBS (ρΗ5. 0-6. O)洗滌兩次，磁分離后去上清；加入 250 μ L EDC(5mg/mL)和 250 μ Lsuflo-NHS (10mg/mL)，渦旋混勻，37°C 搖床內(nèi)活化20-30分鐘，轉(zhuǎn)速150-200轉(zhuǎn)/分；離心管放入磁分離器內(nèi)磁分離去上清，加 Λ 500 μ I PBS (ρΗ8. 0-9. 0)，混勻后磁分離器內(nèi)磁分離去上清，PBS反復洗滌3_4次；加入 600 μ g 5'端帶有氨基的VEGF165-aptamer (本發(fā)明所述RNA)，用PBS將溶液調(diào)制500 μ L， 充分混勻；37°C搖床內(nèi)偶聯(lián)4小時；離心管放入磁分離器磁分離去上清，加入1% BSA 0. 5-lmL，37°C搖床內(nèi)I小時封閉磁株；離心管放入磁分離器磁分離去上清，用PBS洗滌5次即得，4°C保存。經(jīng)檢測，所述MRI對比劑VEGF165-aptamer偶聯(lián)量為1221pmol/mg。實施例2 :本發(fā)明所述MRI對比劑的偶聯(lián)檢測將實施例I制備的MRI對比劑和本發(fā)明所述RNA進行I. 8%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2。由圖2可知，未與羧基葡聚糖T-40包被的超順磁性氧化鐵微粒偶聯(lián)的RNA條帶大小在50bp以下，與實際一致。而偶聯(lián)后的條帶由于交聯(lián)了羧基葡聚糖T-40包被的超順磁性氧化鐵微粒而阻礙了其在電泳中的遷移，緊鄰點樣孔，由此表明本發(fā)明所述MRI對比成功偶聯(lián)。實施例3 :本發(fā)明所述MRI對比劑的體外靶向性細胞增殖試驗試驗設計設空白組、本發(fā)明所述MRI對比劑高劑量組、本發(fā)明所述MRI對比劑中劑量組、本發(fā)明所述MRI對比劑低劑量組以及非靶向性陰性MRI對比劑(菲立磁)組。5組內(nèi)添加同等數(shù)量的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC細胞)，空白組不添加VEGF165， 剩余4組添加等量VEGF165刺激HUVEC細胞生長，高、中、低3組分別添加50 μ L、25 μ L、
12.2 μ L本發(fā)明所述MRI對比劑，菲立磁組添加50 μ L菲立磁，用酶標儀統(tǒng)計檢測結(jié)果，見圖3。由圖3可知，50 μ L、25 μ L、12. 2 μ L各組HUVEC細胞光密度值逐漸增加，表明 HUVEC細胞數(shù)量逐漸增加，但始終大于空白組而小于菲立磁組，各組統(tǒng)計分析P < O. 05，有統(tǒng)計學意義。證明本發(fā)明所述MRI對比劑體外可與VEGF165有效結(jié)合，具有很強靶向性。實施例4 :本發(fā)明所述MRI對比劑的荷瘤小鼠活體靶向性試驗試驗荷瘤小鼠為肝癌小鼠模型，對比劑采用實施例I制備的MRI對比劑和市售菲立磁。在注射對比劑前分別用磁共振儀平掃小鼠，掃描結(jié)果見圖4，圖中清晰可見小鼠腋下移植瘤腫瘤細胞，信號強度分別為2346(圖4A)和2100(圖4B)特斯拉。然后，荷瘤鼠分別鼠尾靜脈注射本發(fā)明所述MRI對比劑和菲立磁3. 5mg后3小時 MRI掃描，結(jié)果見圖5，由圖5可以看出，注射本發(fā)明所述MRI對比劑的腫瘤細胞的信號明顯降低，信號強度為172特斯拉(圖5A);而注射菲立磁的腫瘤細胞的信號無明顯變化，信號強度為1900特斯拉(圖5B)。注射后6小時MRI掃描，結(jié)果見圖6，由圖6可以看出，隨著對比劑以及完成生物學功能的VEGF165在小鼠體內(nèi)的降解，注射本發(fā)明所述MRI對比劑的腫瘤細胞的信號開始回升，信號強度為2076特斯拉(圖6A);而注射菲立磁的腫瘤細胞的信號仍無明顯變化，信號強度為1900特斯拉(圖6B)。上述試驗結(jié)果表明本發(fā)明所述MRI對比劑在荷瘤鼠活體內(nèi)能以腫瘤區(qū)VEGF165為靶點靶向MRI成像，而注射等量的菲立磁各時間點信號降低不明顯。實施例5 :制備本發(fā)明所述MRI對比劑將IOg葡聚糖T-40溶解在50ml水中，加熱至70°C,攪拌，同時加入5ml的IOmol/ L的NaOH反應5h，再加入3ml的5mol/L氯乙酸，70°C恒溫20min，待反應體系冷卻后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH = 8 ;用甲醇沉淀反應物，在苯乙烯型陰陽離子型樹脂(陰與陽離子型樹脂的比例為1.5 I)中純化，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上50°C真空濃縮，然后將產(chǎn)物凍干，即得到帶有羧基的葡聚糖T-40，備用。制備5ml lmol/L 的 FeCl3 · 6H20,并加入 660mg FeCl2 · 4H20，N2 保護待用。稱取上述帶有羧基的葡聚糖T-405. Og溶解在15mL —次蒸餾水中，N2保護下加熱到75°C， 加入配制好的FeCl3 · 6H20-FeCl2 · 4H20混合液，同時勻速滴加NH4OH,充分攪拌，調(diào)節(jié)PH =7,得到黑色的懸浮液，1500r/min離心IOmin,取上層清液。用凝膠色譜柱Sephacryl S-300HR(2. 6cmX40cm)分離并收集首峰溶液，洗脫液為lOmol/L的醋酸鈉(pH = 6. 5)，所得溶液在去離子水中透析24h，然后超濾濃縮為10mg/mL，制得由羧基葡聚糖T-40包被的超順磁性氧化鐵微粒的濃縮液，4°C存儲備用。取150 μ L上述濃縮液到2mL離心管，用500 μ L PBS (ρΗ5. O 6. O)洗滌兩次，磁分離后去上清;加入 250yL EDC(5mg/mL)和 250 μ Lsuflo-NHS (10mg/mL)，渦旋混勻，37°C 搖床內(nèi)活化20-30分鐘，轉(zhuǎn)速150-200轉(zhuǎn)/分；離心管放入磁分離器內(nèi)磁分離去上清，加 Λ 500 μ I PBS (ρΗ8. 0-9. 0)，混勻后磁分離器內(nèi)磁分離去上清，PBS反復洗滌3_4次；加入500 μ g 5'端帶有氨基的VEGF165-aptamer (本發(fā)明所述RNA)，用PBS將溶液調(diào)制500 μ L， 充分混勻；37°C搖床內(nèi)偶聯(lián)4小時；離心管放入磁分離器磁分離去上清，加入1% BSA O. 5-lmL，37°C搖床內(nèi)I小時封閉磁株；離心管放入磁分離器磁分離去上清，用PBS洗滌5次即得，4°C保存。參照實施例2-4的方法，對本實施例制備的MRI對比劑進行檢測，其中，在荷瘤小鼠中的試驗采用腸癌小鼠模型。結(jié)果顯示，本實施例制備的MRI對比劑能夠以腫瘤區(qū) VEGF165為靶點，與VEGF165特異性結(jié)合并MRI成像，且避免了免疫源性問題。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種靶向性MRI對比劑的制備方法，其特征在于，將外層包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒與在SEQ ID NO: I所示序列5'端修飾有氨基的RNA共價偶聯(lián)即得，所述共價偶聯(lián)為RNA 5'端氨基與葡聚糖上的羧基共價偶聯(lián)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，所述超順磁性氧化鐵微粒直徑為 18_22nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于，所述外層包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒直徑為20nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，所述外層包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒與所述RNA的質(zhì)量比為3-4 1-1.2。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，所述RNA5'端氨基與葡聚糖上的羧基共價偶聯(lián)的具體方法為將外層包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒用N-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺活化后，與所述RNA在37°C、200r/min下偶聯(lián)4h。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述外層包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒、N-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為 3-4 : 2. 5 : 5。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，所述外層包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒通過以下方法獲得氧化葡聚糖上羥基為羧基獲得羧基葡聚糖，然后用共沉淀一步法與FeCl3 6H20、 FeCl2 4H20制備即得外層包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒。
8.權(quán)利要求1-7任意一項所述制備方法制備的MRI對比劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述MRI對比劑，其特征在于，偶聯(lián)量為每Img外層包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒偶聯(lián)1221pmol的所述RNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學材料領(lǐng)域，公開了一種靶向性MRI對比劑及其制備方法。本發(fā)明所述MRI對比劑的制備方法、將外層包被有羧基葡聚糖的超順磁性氧化鐵微粒與在SEQ ID NO1所示序列5′端修飾有氨基的RNA共價偶聯(lián)即得，所述共價偶聯(lián)為RNA 5′端氨基與葡聚糖上的羧基共價偶聯(lián)。本發(fā)明所述MRI對比劑為陰性對比劑，其上連接的在SEQ ID NO1所示序列5′端引入氨基的RNA為修飾后的VEGF165-Aptamer，能夠靶向于腫瘤細胞中的VEGF165，且避免了免疫原性缺陷，能夠應用于多種腫瘤診斷中。
文檔編號A61K49/10GK102580120SQ201210076269
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月21日
發(fā)明者尤曉光, 涂蓉, 白玉杰 申請人:海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院