專利名稱：雞新城疫、禽流感(h9亞型)、大腸埃希氏菌病三聯(lián)滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雞新城疫、禽流感(H9亞型)、大腸埃希氏菌病三聯(lián)滅活疫苗，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
新 城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一種禽類急性、高度接觸性傳染病。臨床上新城疫常呈敗血癥經(jīng)過，主要特征是呼吸困難，下痢一排出綠色或黃色稀糞，神經(jīng)機能紊亂一出現(xiàn)陣發(fā)性痙攣、頭頸扭轉(zhuǎn)、角弓反張、運動失調(diào)以及麻癥狀，粘膜和漿膜出血和壞死。該病發(fā)病急、致死率高，對養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重的威脅，被國際獸醫(yī)局定為A類烈性傳染病，一直是影響世界養(yǎng)雞業(yè)的最主要疾病之一。禽大腸埃希氏菌病又稱禽大腸桿菌病(Avian Colibacillosis),指部分或全部由大腸埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli)所引起的局部或全身性感染的疾病,可以引起胚胎死亡、臍炎、敗血癥、肉芽腫、卵黃性腹膜炎和全眼球炎(Calnek Bff主編，高福，蘇敬良主譯).禽病學(xué).第10版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1999，158-171)等一系列病征，是2至12周齡的雞和火雞的一種常見傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。大腸桿菌血清型極多，已知大腸桿菌有菌體(O)抗原173種，表面(K)抗原103種，鞭毛抗原60種。病原性大腸桿菌的許多血清型可引起多種動物發(fā)病。世界許多國家已經(jīng)做了詳細(xì)調(diào)查，確定最常與禽病有關(guān)的血清型是01、02、036和078，很少分離到其他血清型。國內(nèi)學(xué)者紹華斌、霍龍飛和劉瑞田等也得出過相同結(jié)論(李樹博.當(dāng)前禽大腸桿菌病的流行特點與防控措施.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī).2011.12，39-40)。低致病性禽流感(Mildlypathogenic avian influenzavirus, MPAIV)在實驗室條件下，受感染雞死亡率很低，但是和E.coli混合感染時，死亡率會有不同程度的提高，雞產(chǎn)蛋率銳減，肉雞增重減少(Swayne D E, Pathobiology of H5N2Mexican avian influenzavirus infections of chickens.Vet Pathel.1997，34 (6): 557-567)。其中，H9 亞型禽流感病毒是導(dǎo)致低致病性禽流感發(fā)生、流行的諸多因素中較為重要的一種。隨著養(yǎng)雞業(yè)的快速發(fā)展和養(yǎng)殖環(huán)境的污染，近年來蛋雞疾病尤其是傳染病不斷增多和復(fù)雜化。雞群混合感染嚴(yán)重，發(fā)病率和死亡率都較高，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。其中，雞新城疫、低致病性禽流感和禽大腸埃希氏菌病三種疾病混合感染較為常見，損失也較為嚴(yán)重。這種背景下，研制一種可同時預(yù)防這三種疾病的疫苗顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過新城疫病毒La Sota株、自行分離的一株H9亞型禽流感病毒株、自行分離的四株禽源大腸埃希氏菌菌株(血清型分別為:01、02、078、036)，提供一種可同時預(yù)防雞新城疫、H9亞型禽流感和禽大腸埃希氏菌病三種疾病的疫苗，一次免疫即可預(yù)防三種疾病。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案在于:1.雞新城疫、禽流感(H9亞型)、大腸埃希氏菌病三聯(lián)滅活疫苗含有雞新城疫病毒LaSota株病毒LaSota株、H9亞型禽流感病毒LGl株和禽源大腸埃希氏菌菌株血清型01的QLl株、血清型02的QL2株、血清型036的QL36株、血清型078的QL78株，以上菌株已與2013年01月31日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號:QL1株為CGMCC N0.7241，QL2株為 CGMCC N0.7242，QL36 株為 CGMCC N0.7243 和 QL78 株為 CGMCC N0.7244。2.本發(fā)明所述的雞新城疫、禽流感(H9亞型)、大腸埃希氏菌病三聯(lián)滅活疫苗的制備方法:(I)分別按常規(guī)方法用雞胚繁殖雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒制備成滅活并經(jīng)濃縮的病毒液；用含0.1%微量鹽溶液的馬丁肉湯分別培養(yǎng)四型禽源大腸埃希氏菌菌株制備成滅活并經(jīng)濃縮的菌液，再按3:3:2:2的體積比例混合；(3)將以上制備的滅活并經(jīng)濃縮的雞新城疫病毒液、H9亞型禽流感病毒液與四型禽源大腸埃希氏菌滅活濃縮混合菌液按1:1:1體積比混合后制備成水相，再按常規(guī)方法制備滅活佐劑疫苗。3.給雞接種有效劑量的雞新城疫、禽流感(H9亞型)、大腸埃希氏菌病三聯(lián)滅活疫苗能使接種雞獲得對 雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和禽源大腸埃希氏菌國內(nèi)流行菌毒株產(chǎn)生有效預(yù)防的免疫力。
具體實施方式
1.疫苗生產(chǎn)用菌毒株(1)菌毒株來源本發(fā)明疫苗制備用毒株為新城疫病毒La Sota株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。本發(fā)明生產(chǎn)用毒株為一株H9亞型禽流感病毒株LGl株，為我單位自行分離、保存，并已經(jīng)商品化，產(chǎn)品名稱:雞新城疫、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗，產(chǎn)品批準(zhǔn)文號:獸藥生字(2010) 150252152。本發(fā)明生產(chǎn)用菌株為四株禽源大腸桿菌菌株QLl株、QL2株、QL78株、QL36，分別為四個血清型:01、02、036、078，是由本發(fā)明人由野外分離得到。以上菌株已與2013年01月31日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號=QLl株為CGMCC N0.7241，QL2株為CGMCCN0.7242，QL36 株為 CGMCC N0.7243 和 QL78 株為 CGMCC N0.7244。(2)菌毒株特性I)免疫原性新城疫病毒La Sota株對I月齡雛雞滴鼻免疫，最小免疫量應(yīng)< 5000EID5(I，免疫原性良好。H9亞型禽流感病毒株LGl株免疫雞HI抗體幾何平均滴度應(yīng)> 6.51og2,免疫原性良好。
禽源大腸埃希氏菌菌株用I月齡SPF雞10只，每只頸部皮下注射疫苗0.3ml，21日后連同條件相同的對照雞10只，各肌肉或腹腔注射強毒菌株QLl株(01)、QL2株(02)、QL78株(078)、QL36株(036)的混合菌液0.5ml (按照菌數(shù)1:1:1:1混合，共含活菌2 5億)。觀察10日，對照雞應(yīng)全部發(fā)病或死亡，剖檢后全部具有典型病變(反應(yīng)在++以上)；免疫雞至少保護(hù)8只。判定標(biāo)準(zhǔn):土有輕微臨床反應(yīng)，減食、排白色糞便I 3日，內(nèi)臟無肉眼可見病變。+臨床減食4日以上或停食I日以上，排黃白色糞便4日以上，剖檢見心臟或肝臟有輕度纖維素滲出性炎癥。++臨床同(+)，可見明顯心包積液及纖維素滲出性炎癥。+ + +臨床同(+)，有嚴(yán)重心包膜炎，并與肝或胸膜發(fā)生粘連。`+ + + +試驗雞死亡，其他同(+ ++ )。2)毒力雞新城疫病毒La Sota株將毒種用滅菌生理鹽水作50 150倍稀釋，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚10個，每胚0.1 0.3ml，置36 37°C繼續(xù)孵育，雞胚于接種后24 120小時死亡70%以上，胎兒有明顯充血、出血病痕。H9亞型禽流感病毒株LGl株將毒種用滅菌生理鹽水作5 15倍稀釋，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚20個，每胚0.1 0.3ml，置37°C孵育，在接種后48 96小時內(nèi)，至少有15個雞胚死亡。禽源大腸埃希氏菌QLl株(01)、QL2株(02)、QL36株(036)、QL78株(078)菌株含0.1%微量鹽溶液(制作方法見中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程，二〇〇〇版，81頁)的馬丁肉湯20 24小時培養(yǎng)菌液0.3 0.6ml(含活菌2 5億)，肌肉或腹腔注射I月齡SPF雞5只，應(yīng)出現(xiàn)明顯臨床癥狀，于14日內(nèi)死亡或活雞內(nèi)臟有明顯病變，應(yīng)在(++)以上。3)禽源大腸埃希氏菌血清型根據(jù)國內(nèi)目前禽源大腸埃希氏菌病流行情況，本發(fā)明選取了四個血清型中免疫原性優(yōu)良的菌株作為制苗用菌株，分別為01，02，036，078血清型中的QLl株、QL2株、QL36株、QL78 株。2.雞新城疫、禽流感(H9亞型)、大腸埃希氏菌病三聯(lián)滅活疫苗(I)抗原液制備I)雞新城疫病毒液制備①毒種繁殖將毒種用滅菌生理鹽水稀釋5000 15000倍，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚，每胚0.1 0.3ml，選接種后72 96小時死亡且病痕明顯的雞胚，分別收獲雞胚液(尿囊腔液及羊水)，裝于滅菌容器內(nèi)，雞胚液紅細(xì)胞凝集價不低于1:512。②接種取生產(chǎn)用種毒，用滅菌生理鹽水作5000 15000倍稀釋，尿囊腔內(nèi)接種9 11日齡易感雞胚，每胚0.1 0.3ml，接種后密封針孔，置36 37°C繼續(xù)孵育，不必翻蛋。③孵育和觀察雞胚接種后每日照蛋I次，將60小時以前死亡的雞胚棄去。以后每4 6小時照蛋I次，死亡的雞胚隨時取出，直至96小時，不論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置2 8°C冷卻4 24小時。
④收獲將冷卻的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無菌方法剝除氣室部卵殼，揭去卵殼膜，剪破絨毛尿囊膜及羊膜(謹(jǐn)防卵黃破裂)，吸取胚液。應(yīng)對每個雞胚仔細(xì)檢查，凡胎兒腐敗、胚液混濁及有任何污染可疑者，棄去不用。死胚和活胚分別收獲，每若干個雞胚分為一組，吸取胚液放入同一滅菌的容器內(nèi)，每組抽樣測定血凝價，血凝價低于1:256 (微量法)者應(yīng)棄去。收獲的胚液取樣作無菌檢驗，應(yīng)無菌生長，置_15°C以下保存，應(yīng)不超過6個月。2 ) H9亞型禽流感病毒液制備①毒種繁殖將H9亞型禽流感病毒株LGl株生產(chǎn)用毒種用滅菌生理鹽水作500 1500倍稀釋，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚，每胚0.1 0.3ml，收獲24 96小時內(nèi)死亡的雞胚液，裝于滅菌容器內(nèi)，紅細(xì)胞凝集價不低于1:256。②接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作500 1500倍稀釋，尿囊腔內(nèi)接種9 11日齡健康易感雞胚，每胚0.lml。接種后密封針孔，置36 37°C繼續(xù)孵育，不必翻蛋。

③孵育和觀察雞胚接種后，24小時照蛋I次，棄去死胚。以后每4 8小時照蛋I次，死亡的雞胚隨時取出，直至96小時，不論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置2 8°C冷卻4 24小時。④收獲將冷卻的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無菌方法剝除氣室部卵殼，揭去卵殼膜，剪破絨毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黃破裂)，吸取雞胚液。在收獲胚液的同時，應(yīng)逐個檢查雞胚，如胎兒腐敗、胚液混濁及有任何污染可疑者棄去不用。死胚和活胚分別收獲，每若干個雞胚的胚液混合為一組，吸取胚液放入同一滅菌的容器內(nèi)，每組抽樣測定血凝價，死胚液血凝價應(yīng)不低于1:256 (微量法),活胚液血凝價應(yīng)不低于1:64。收獲的胚液取樣作無菌檢驗，應(yīng)無菌生長，置-15°C以下保存，應(yīng)不超過3個月。3)禽源大腸埃希氏菌菌液制備將四個禽源大腸埃希氏菌菌株QLl株(01)、QL2株(02)、QL78株(078)、QL36株
(036)分別接種含0.1%微量鹽溶液的馬丁肉湯(制作方法見中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程，二〇〇〇版，附錄339頁)，35 36°C培養(yǎng)20 24小時，分別收獲菌液后按照3:3:2:2的體積比例混合,再將混合后的菌液按照2% 4%的接種量接種含0.1%微量鹽溶液的馬丁肉湯，35 36°C通氣培養(yǎng)10 14小時候后收獲菌液。(3)滅活雞新城疫病毒液滅活按0.1 0.2%加入甲醛溶液，經(jīng)37°C滅活16小時，其間每隔4 6小時振搖I次。H9亞型禽流感病毒液滅活按0.1 0.2%加入甲醛溶液，經(jīng)37°C滅活48小時，其間每隔4 6小時振搖I次。禽源大腸埃希氏菌菌液滅活按0.4% 0.8%加入甲醛溶液，經(jīng)38°C滅活48 72小時，期間每隔4 6小時振搖一次。(4)濃縮雞新城疫病毒液濃縮用中空纖維超濾器將滅活后的病毒液濃縮成全量的30% 50%。H9亞型禽流感病毒液濃縮用中空纖維超濾器將滅活后的病毒液濃縮成全量的40 60%ο禽源大腸埃希氏菌菌液濃縮將滅活菌液于2 8°C靜置2 3日，抽棄上清，濃縮成全量的50% 70%。(5)乳化1)油相制備取注射用白油94份，加司本-806份，混合后，加硬脂酸鋁2份，隨加隨攪拌至透明為止，121°C高壓滅菌30分鐘，置室溫下保存?zhèn)溆谩?)水相制備取滅菌吐溫-804份，加入滅活胚液96份(雞新城疫滅活病毒液、H9亞型禽流感滅活病毒液與禽源大腸埃希氏菌滅活菌液按1:1:1的比例混合)，充分振搖，使吐溫-80完全溶解。3)乳化取油相2份放于膠體磨或乳劑缸內(nèi)，開動電機慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時徐徐加入水相I份，加完后再以10000r/min攪拌2 5分鐘，在終止攪拌前加入1%硫柳汞溶液，使其最終濃度為0.01%。乳化后，取3 5ml以3000r/min離心15分鐘，若有分層現(xiàn)象，應(yīng)重復(fù)攪拌一次。3.雞新城疫、禽流感(H9亞型)、大腸埃希氏菌病三聯(lián)滅活疫苗成品檢驗( I)性狀外觀應(yīng)為乳白色乳劑。劑型油包水型。取I清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第I滴外，均應(yīng)不擴散。穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，經(jīng)3000r/min離心15min，管底析出的水相應(yīng)不多于0.5ml。黏度按現(xiàn)行《中國獸藥典》(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典，二〇一〇年版三部.中國農(nóng)業(yè)出版社，2011，本發(fā)明簡稱為“現(xiàn)行《中國獸藥典》”)規(guī)定方法進(jìn)行檢驗，應(yīng)符合規(guī)定。(2)無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》規(guī)定方法進(jìn)行檢驗，應(yīng)無菌生長。(3)安全檢驗用3 5周齡SPF雞10只，各頸部皮下或肌肉注射疫苗2ml，觀察14日，應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。(4)效力檢驗I)新城疫部分用30 60日齡SPF雞15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20 μ 1(1/25羽份)，另5只作對照。接種后21 28日，每只雞各肌肉注射雞新城疫病毒北京株強毒(CVCCAV1611株)IO5 tlELD5tl，觀察14日。對照組應(yīng)全部死亡，免疫組應(yīng)至少保護(hù)7只。2)禽流感部分用7 10日齡SPF雞15只，其中10只各肌肉或頸部皮下注射疫苗0.3ml，另5只不接種作為對照。21日后，采血，分離血清，用禽流感病毒H9亞型抗原測定HI抗體。免疫雞HI抗體幾何平均滴度應(yīng)≥6.51og2，對照雞應(yīng)為陰性。3)禽源大腸埃希氏菌部分
用I月齡SPF雞10只，每只頸部皮下注射疫苗0.3ml，21日后連同條件相同的對照雞8只，各肌肉或腹腔注射禽源大腸埃希氏菌菌株QLl株(01)、QL2株(02)、QL36株(036)、QL78株(078)的混合菌液0.5ml (按照菌數(shù)1:1:1:1混合，共含活菌2 5億CFU)。觀察10日，對照雞應(yīng)全部發(fā)病或死亡，剖檢后全部具有典型病變(反應(yīng)在++以上)；免疫雞至少保護(hù)8只。(5)甲醛、汞類防腐劑殘留量測定按現(xiàn)行《中國獸藥典》規(guī)定方法進(jìn)行測定，應(yīng)符合規(guī)定。本發(fā)明涉及的微生物菌種本發(fā)明涉及到的雞新城疫病毒株La Sota株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。本發(fā)明涉及到的H9亞型禽流感病毒株LGl株，為本發(fā)明人自行分離、保存。并已經(jīng)商品化，產(chǎn)品名稱:雞新城疫、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗，產(chǎn)品批準(zhǔn)文號:獸藥生字(2010)150252152。本發(fā)明涉及到的禽源大腸埃希氏菌(Escherichia coli)有四個菌株，QLl株(01)、QL2株(02)、QL78株(078)、QL36株(036)，為本發(fā)明人自行分離，以上菌株已與2013年01月31日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號=QLl株為CGMCCN0.7241，QL2株為CGMCCN0.7242，QL36 株為 CGMCCN0.7243 和 QL78 株為 CGMCCN0.7244。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明涉及一種雞新城疫、禽流感(H9亞型)、大腸埃希氏菌病三聯(lián)滅活疫苗及其制備方法。該疫苗是針對國內(nèi)禽類疫病中，新城疫、H9亞型禽流感與禽源大腸埃希氏菌多血清型混合感染的流行形勢，提出了一個有效應(yīng)對策略，并做到一次免疫同時防控兩種疾病。該疫苗利用新城疫病毒La Sota株、H9亞型禽流感病毒LGl株和禽源大腸埃希氏菌QLl株
(01)、QL2株(02 )、QL36株(036 )、QL78株(078 )作為疫苗制備用菌毒株，經(jīng)過抗原液制備、滅活、濃縮、按照一定比例混合制備而成。本發(fā)明涉及到的新城疫病毒、H9亞型禽流感毒株、禽源大腸埃希氏菌菌株均為國內(nèi)流行菌毒株，能夠有效預(yù)防目前流行疾病。實施例以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實施例1—生產(chǎn)用菌毒種制備(I)雞新城疫病毒La Sota株生產(chǎn)用毒種的制備將毒種用滅菌生理鹽水稀釋10000倍，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚，每胚
0.1ml，選接種后72 96小時死亡且病痕明顯的雞胚，分別收獲雞胚液(尿囊腔液及羊水)，裝于滅菌容器內(nèi)。將檢驗無菌且紅細(xì)胞凝集價不低于1:512 (微量法)的雞胚液混合，定量分裝，冷凍保存，注明收獲日期、毒種代次等。(2) H9亞型禽流感病毒LGl株生產(chǎn)用毒種制備將毒種用滅菌生理鹽水作1000倍稀釋，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚，每胚0.1ml，收獲24 96小時內(nèi)死亡的雞胚液，裝于滅菌容器內(nèi)。將檢驗無菌且紅細(xì)胞凝集價不低于1:256的雞胚液混合，定量分裝，冷凍保存。(3)禽源大腸埃希氏菌菌株生產(chǎn)用毒種制備一級種子繁殖將禽源大腸埃希氏菌QLl株(01)、QL2株(02)、QL36株(036)、QL78株(078)各株凍干菌種分別接種于馬丁肉湯中，36°C培養(yǎng)24小時，然后劃線接種麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)，選取粉紅色或磚紅色、邊緣整齊、表面光滑、菌落隆起的典型菌落10個混合于少量馬丁肉湯中，接種馬丁瓊脂斜面若干支、置36°C培養(yǎng)24小時，作為一級種子。二級種子繁殖取一級種子接種于馬丁肉湯中，36°C培養(yǎng)24小時，作為二級種子。實施例2 —疫苗制備(I)抗原液制備I)雞新城疫病毒液制備

①接種取生產(chǎn)用種毒，用滅菌生理鹽水作10000倍稀釋，尿囊腔內(nèi)接種9 11日齡易感雞胚，每胚0.1 0.3ml，接種后密封針孔，置36 37°C繼續(xù)孵育，不必翻蛋。②孵育和觀察雞胚接種后每日照蛋I次，將60小時以前死亡的雞胚棄去。以后每4 6小時照蛋I次，死亡的雞胚隨時取出，直至96小時，不論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置2 8°C冷卻4 24小時。③收獲、滅活和濃縮將冷卻的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無菌方法剝除氣室部卵殼，揭去卵殼膜，剪破絨毛尿囊膜及羊膜(謹(jǐn)防卵黃破裂)，吸取胚液。應(yīng)對每個雞胚仔細(xì)檢查，凡胎兒腐敗、棄去胚液混濁及有任何污染可疑者。死胚和活胚分別收獲，每若干個雞胚分為一組，吸取胚液放入同一滅菌的容器內(nèi)，每組抽樣測定血凝價，棄去血凝價低于1:256 (微量法)的胚液。收獲的胚液取樣作無菌檢驗，均無菌生長；將病毒液混合后，再按0.1% (V/V)加入甲醛溶液，經(jīng)37°C滅活16小時，其間每隔4小時振搖I次；用中空纖維超濾器將滅活后的病毒液濃縮成全量的40% (V/V)02 ) H9亞型禽流感病毒液制備①接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作1000倍稀釋，尿囊腔內(nèi)接種10日齡健康易感雞胚，每胚0.1ml ο接種后S封針孔，直37 C繼續(xù)鮮育，不必翻蛋。②孵育和觀察雞胚接種后，24小時照蛋I次，棄去死胚。以后每4小時照蛋I次，死亡的雞胚隨時取出，直至96小時，不論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置2 8°C冷卻。③收獲、滅活和濃縮將冷卻4 24小時的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無菌手術(shù)剝除氣室部卵殼，揭去卵殼膜，剪破絨毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黃破裂)，吸取雞胚液。在收獲胚液的同時，應(yīng)逐個檢查雞胚，如胎兒腐敗、胚液混濁及有任何污染可疑者棄去不用。死胚和活胚分別收獲，每若干個雞胚的胚液混合為一組，吸取胚液放于同一滅菌的容器中，每組抽樣測定血凝價，死胚液血凝價> 1:256，活胚液血凝價> 1:64 ;將病毒液混合后按0.1% (V/V)加入甲醛溶液，經(jīng)37°C滅活48小時，其間每隔4小時振搖I次；用中空纖維超濾器將滅活后的病毒液濃縮2倍(V/V)。3)禽源大腸埃希氏菌菌液制備
將禽源大腸埃希氏菌QLl株(01)、QL2株(02)、QL36株(036)、QL78株(078)各菌株的二級種子液按照3:3:2:2的體積比混合，接種含0.1%微量鹽溶液的馬丁肉湯(制作方法見中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程，二〇〇〇版，附錄339頁)，接種量為培養(yǎng)基量的3%，36°C培養(yǎng)12小時，收獲菌液；按0.6% (V/V)加入甲醛溶液，經(jīng)38°C滅活60小時，期間每隔4小時振搖一次；再將滅活菌液于2 8°C靜置3日，抽棄上清，濃縮至全量的60% (V/V)0(2)乳化I)油相制備取注射用白油94份(體積計)，加司本-806份(體積計)，混合后，加硬脂酸鋁2份(質(zhì)量計)，隨加隨攪拌至透明為止，121°C高壓滅菌30分鐘。2)水相制備取滅菌吐溫-804份(體積計),加入抗原液96份(體積計)(該抗原液是由雞新城疫滅活病毒液、H9亞型禽流感滅活病毒液與禽源大腸埃希氏菌滅活菌液按1:1:1體積比混合)，充分振搖，使吐溫-80完全溶解。3)乳化取油相2份放于膠體磨或乳劑缸內(nèi)，開動電機慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時徐徐加入水相I份，加完后再以10000r/min攪拌5分鐘，在終止攪拌前加入1%硫柳汞溶液，使其最終濃度為0.01%。乳化后，取3 5ml以3000r/min離心15分鐘，無分層現(xiàn)象。實施例3-疫苗成品檢驗本實施例使用疫苗是本申請人按本發(fā)明提供的技術(shù)方案制備的6批雞新城疫、禽流感(H9亞型)、大腸埃希氏菌病三聯(lián)滅活疫苗，批號為301、302、303、304、305和306批。(1)性狀外觀應(yīng)為乳白色乳劑。劑型油包水型。取I清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第I滴外，均未見擴散。穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，經(jīng)3000r/min離心15min，管底無的水相析出。黏度按現(xiàn)行《中國獸藥典》(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典，二〇一〇年版三部.中國農(nóng)業(yè)出版社，2011，本發(fā)明簡稱為“現(xiàn)行《中國獸藥典》”)規(guī)定方法進(jìn)行檢驗，結(jié)果均為38cP,符合規(guī)定。(2)無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》規(guī)定方法進(jìn)行檢驗，均無菌生長。(3)安全檢驗用3 5周齡SPF雞10只，各頸部皮下或肌肉注射疫苗2ml，觀察14日，均未出現(xiàn)由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反應(yīng)(見表I)。表I雞新城疫、禽流感(H9亞型)、大腸埃希氏菌病三聯(lián)滅活疫苗成品安全檢驗結(jié)果
運音批號I注射劑量I雞只數(shù)量I全身反應(yīng)I注射部f
權(quán)利要求
1.一種雞新城疫、禽流感(H9亞型)、大腸埃希氏菌病三聯(lián)滅活疫苗，其特征是該疫苗含有滅活的雞新城疫病毒，滅活的H9亞型禽流感病毒，滅活的01、02、078和036四型禽源大腸埃希氏菌。
2.—種權(quán)利要求1所述的雞新城疫、禽流感(H9亞型)、大腸埃希氏菌病三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其特征在于: (O分別按常規(guī)方法用雞胚繁殖雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒制備成滅活并經(jīng)濃縮的病毒液；用含0.1%微量鹽溶液的馬丁肉湯分別培養(yǎng)的四型禽源大腸埃希氏菌菌液，經(jīng)滅活和濃縮，再按3:3:2:2的體積比例混合成四型禽源大腸埃希氏菌滅活濃縮菌液； (2)將以上制備的滅活并經(jīng)濃縮的雞新城疫病毒液、H9亞型禽流感病毒液與四型禽源大腸埃希氏菌滅活濃縮混合菌液按1:1:1體積比混合后制備成水相，再按常規(guī)方法制備滅活佐劑疫苗。
3.—種權(quán)利要求1所述的雞新城疫、禽流感(H9亞型)、大腸埃希氏菌病三聯(lián)滅活疫苗的應(yīng)用，其特征在于給雞接種有效劑量的雞新城疫、禽流感(H9亞型)、大腸埃希氏菌病三聯(lián)滅活疫苗能使接種雞獲得對雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和禽源大腸埃希氏菌國內(nèi)流行菌毒株產(chǎn)生有效預(yù)防的免疫 力。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雞新城疫、禽流感(H9亞型)、大腸埃希氏菌病三聯(lián)滅活疫苗及其制備方法。該疫苗是針對國內(nèi)禽類疫病中，雞新城疫、H9亞型禽流感與大腸桿菌多混合感染的流行形勢，提出了一個有效應(yīng)對策略，并做到一次免疫同時防控兩種疾病。該疫苗利用雞新城疫病毒La Sota株，H9亞型禽流感病毒LG1株和禽大源腸埃希氏菌QL1株(O1)、QL2株(O2)、QL78株(O78)、QL36株(O36)作為疫苗制備用菌毒株，經(jīng)過抗原液制備、滅活、濃縮、按照一定比例混合制備而成。本發(fā)明涉及到的雞新城疫病毒La Sota株、H9亞型禽流感毒株、禽源大腸埃希氏菌菌株均為國內(nèi)流行菌毒株，能夠有效預(yù)防目前流行疾病。
文檔編號A61P31/16GK103143010SQ20131004247
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月4日
發(fā)明者鮑海忠, 鞠洪濤, 宋曉飛, 王蕾, 徐龍濤, 吳昊 申請人:齊魯動物保健品有限公司