專利名稱：一種金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種金屬硫蛋白脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，具體地說涉及一種金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，屬于生物制藥領(lǐng)域。
發(fā)明背景
金屬硫蛋白是一類富含半胱氨酸基團(tuán)，對多種重金屬有高度親和性，在一定的酸堿度(PH值)及細(xì)胞氧化-還原電位環(huán)境(可藉細(xì)胞器某處谷胱甘肽有還原型和氧化型比例，GSH/GSSG比例顯示)條件下易與多個鎘、鋅等金屬離子結(jié)合的多肽蛋白質(zhì)。哺乳動物的金屬硫蛋白由約61個氨基酸組成，含有20個半胱氨酸和7個金屬離子。金屬硫蛋白作為一種應(yīng)激蛋白、抗自由基氧化劑、細(xì)胞鋅離子介導(dǎo)劑等，具有提高人體免疫力、抵抗重金屬中毒、參與微量元素的貯存、運輸和代謝、排鉛補(bǔ)鋅、抗輻射、延緩衰老、保護(hù)人體心肺各器官等多種獨特有效的生物學(xué)功能?？墒?，金屬硫蛋白作為一個無細(xì)胞膜跨膜傳遞序列 (MTS)以及細(xì)胞核定位序列(NLS)的非膜蛋白大分子，在單獨裸露使用、或作為金屬離子螯合金屬硫蛋白使用、或作為金屬硫蛋白與其它物質(zhì)復(fù)合體(如普通納米脂質(zhì)體)使用時，難以自由穿過細(xì)胞膜或細(xì)胞核膜而發(fā)揮其功效。將金屬硫蛋白制成柔性納米脂質(zhì)體，可提高其穩(wěn)定性、尤其是細(xì)胞膜透過性可穿過比脂質(zhì)體本身小數(shù)百倍的微孔通道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，針對無論是裸體金屬硫蛋白、金屬離子螯合金屬硫蛋白還是現(xiàn)有已知金屬硫蛋白與其它物質(zhì)復(fù)合體(如普通納米脂質(zhì)體)都難以自由穿過細(xì)胞膜的缺點，提出了具有更好細(xì)胞膜孔等生物微小孔道透過性金屬硫蛋白產(chǎn)品，一種金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的一種金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝， 實現(xiàn)該工藝的方法的主要特征包括下列步驟
1、取一定量的任何一種來源的金屬硫蛋白、蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑或凍干保護(hù)劑(0. l-5w/ v% ),配制成濃度為10-500mM的(緩沖)水溶液，控制溶液的pH值在6. 5到9. 0之間。
2、取一定比例的磷脂(0. 5-10w/v % )、膽固醇(0. 5-10w/v % )、表面活性劑 (0. 5-10w/v% )、溶劑(5-95V/V% )等制成有機(jī)相液；
3、將以上緩沖液與有機(jī)相溶液導(dǎo)入高壓泵，在包括氮氣保護(hù)的條件下充分混合制成混合分散液；
4、將以上混合分散液在均質(zhì)工作壓力5_480MPa、均質(zhì)工作溫度4 80°C，包括氮氣保護(hù)的條件下通過超高壓納米均質(zhì)機(jī)，制成納米分散液；
5、將以上納米分散液經(jīng)過孔徑為100-200nm的超濾膜，包括氮氣保護(hù)條件下過濾，制成金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體；
6、將以上金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體經(jīng)冷凍干燥、裝瓶、充氮氣、封口，于4 20°C保存。
本發(fā)明的理論依據(jù)是
嵌入金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體包膜層的表面活性劑分子能在高壓力部位蓄積而產(chǎn)生形變，形成較大的高曲度結(jié)構(gòu)；這種結(jié)構(gòu)可減少納米粒子形成及儲存過程中的能量耗散，從而使柔性納米脂質(zhì)體具有高度的形狀可變性，使之能高效地穿透孔徑比它本身粒徑小5倍的微孔通道，而普通的納米脂質(zhì)體當(dāng)其粒徑為微孔通道的1. 7倍時，則完全不能通過。柔性納米脂質(zhì)體還賦予了脂質(zhì)體高度的親水性、滲透性與穩(wěn)定性，從而克服了金屬硫蛋白由于缺少跨膜傳遞序列(MTS)以及細(xì)胞核定位序列(NLS)引起的向細(xì)胞體、細(xì)胞器、生物體遞送的諸多障礙。
本發(fā)明的效果作用是
1、通過使用高壓泵混合、超高壓納米均質(zhì)機(jī)造粒、超濾膜過濾等一系列現(xiàn)代納米藥劑制作技術(shù)，嚴(yán)格控制納米脂質(zhì)體的質(zhì)量，制備出粒徑分布更均勻、可控的納米脂質(zhì)體；
2、通過上述制備工藝，選用合理的脂質(zhì)、表面活性劑、蛋白質(zhì)穩(wěn)定保護(hù)劑配方，得到高性能的柔性納米脂質(zhì)體；
3、通過氮氣保護(hù)、柔性納米脂質(zhì)體制備技術(shù)，提高了脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，包括儲存穩(wěn)定性；
4、通過上述制備工藝，所制得的納米脂質(zhì)體粒徑分布為30-300nm、典型的為 80-120nm,平均粒徑為80_200nm、典型的為lOOnm，包裹率為50-99%、典型的為80-90%，儲存穩(wěn)定期為4-12個月，典型的為6-8個月；
5、通過制得的柔性納米脂質(zhì)體，使金屬硫蛋白高效地透過孔徑小至10-30nm的細(xì)胞體、細(xì)胞器、生物體上的微孔通道等。
具體實施方式
實施例一將IOOmg由兔肝提取的純度為99%的金屬硫蛋白、1.5g海藻酸鈉、 IOOmg谷胱甘肽，溶解在IOOml由注射級水配成的pH值為6. 8濃度為IOOmM磷酸鹽PBS緩沖溶液中，混合均勻，過濾除去不溶物，置于5°C冰浴或冰箱中；取3g卵磷脂、IOOmg膽固醇、 200mg膽酸鈉、200mg 二硬脂酰磷脂酰膽堿，溶解在由25ml水及75ml無水乙醇組成的混合溶劑中，混合均勻，過濾除去不溶物，置于5°C冰浴或冰箱中。
將以上緩沖液與有機(jī)相溶液導(dǎo)入高壓泵中，在小于15°C、氮氣保護(hù)的條件下充分混合5分鐘，制成混合分散液。
將以上混合分散液導(dǎo)入均質(zhì)工作壓力進(jìn)料器，開通氮氣保護(hù)，在150MPal5°C條件下通過超高壓納米均質(zhì)機(jī)，制成納米分散液。
將以上納米分散液經(jīng)過孔徑為IOOnm的超濾膜，在氮氣保護(hù)條件下過濾，制成金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體，其粒徑分布為60-120nm、包封率為91%。
將以上金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體經(jīng)冷凍干燥、裝瓶、充氮氣、封口，于4°C保存。
實施例二 將150mg由兔肝提取的純度為99%的金屬硫蛋白、2. Og甘露醇、200mg 葡聚糖，溶解在IOOml由注射級水配成的pH值為6. 8濃度為IOOmMTris-HCl緩沖溶液中， 混合均勻，過濾除去不溶物，置于5°C冰浴或冰箱中；取5g卵磷脂、150mg膽固醇、250mg膽酸鈉、200mg聚山梨酯、250mg 二硬脂酰磷脂酰膽堿，溶解在由20ml水及IOOml無水乙醇組成的混合溶劑中，混合均勻，過濾除去不溶物，置于5°C冰浴或冰箱中。
將以上緩沖液與有機(jī)相溶液導(dǎo)入高壓泵中，在小于15°C、氮氣保護(hù)的條件下充分混合5分鐘，制成混合分散液。
將以上混合分散液導(dǎo)入均質(zhì)工作壓力進(jìn)料器，開通氮氣保護(hù)，在150MPal5°C條件下通過超高壓納米均質(zhì)機(jī)，制成納米分散液。
將以上納米分散液經(jīng)過孔徑為IOOnm的超濾膜，在氮氣保護(hù)條件下過濾，制成金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體，其粒徑分布為75-120nm、包封率為87%。
將以上金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體經(jīng)冷凍干燥、裝瓶、充氮氣、封口，于4°C保存。
權(quán)利要求
1.一種金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，其特征包括下列步驟A、取一定量的金屬硫蛋白、蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑或凍干保護(hù)劑，配制成一定濃度的緩沖溶液。B、取一定比例的磷脂、膽固醇、表面活性劑、蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑或凍干保護(hù)劑、溶劑等制成有機(jī)相溶液。C、將以上緩沖液與有機(jī)相溶液通過高壓泵充分混合制成混合分散液。D、將混合分散液通過超高壓納米均質(zhì)機(jī)制成粒徑比較均勻分布的納米脂質(zhì)體。E、將納米脂質(zhì)體通過納米超濾膜過濾。F、冷凍干燥、保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，其特征是步驟A所述金屬硫蛋白包括天然提取、人工合成、基因工程-基因重組表達(dá)的、人-動物-植物-微生物來源的所有金屬硫蛋白；所述蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑或凍干保護(hù)劑為蔗糖、海藻糖、甘露醇、谷胱甘肽、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、葡聚糖、白蛋白、L-絲氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、 甘氨酸、肌氨酸、磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、?；撬?、殼聚糖、殼寡糖等的一種或兩種以上； 所述濃度為10-500mM ；所述溶液包括去離子水、無菌去離子水、注射用水、PBS或其它磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液等類似溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，其特征是步驟B所述磷脂為磷脂酰膽堿(卵磷脂，PC)、磷脂酰乙醇胺(腦磷脂，PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)，磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)、二磷脂酰甘油(心磷脂)等甘油磷脂(含改性甘油磷脂、甘油磷脂衍生物如二硬脂酰磷脂酰膽堿DSPC)的一種或兩種以上；所述表面活性劑為膽酸鈉、膽酸鉀、去氧膽酸鈉、去氧膽酸鉀、脂肪酸山梨坦、聚山梨酯、蔗糖酯、二辛基琥珀酸磺酸鈉、月桂酸鈉等的一種或兩種以上；所述溶劑為乙醇、水等溶劑的等一種或兩種以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，其特征是步驟C的條件是混合溫度-5-30°C，混合時間30秒至30分鐘、包括氮氣保護(hù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，其特征是步驟D所述超高壓納米均質(zhì)機(jī)均質(zhì)工作壓力為5-480MPa、均質(zhì)工作溫度為4 80°C， 包括氮氣保護(hù)；經(jīng)此步驟制成的體系稱為納米分散液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，其特征是步驟E所述超濾膜孔徑為100-200nm，過濾過程包括氮氣保護(hù)，經(jīng)此步驟制成的體系稱為柔性納米脂質(zhì)體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，其特征是步驟A-E包含溶液的儲罐、溶液流量計量閥，以及由儲罐、閥門、高壓泵、超高壓納米均質(zhì)機(jī)、生產(chǎn)過程質(zhì)量檢測儀器儀表等構(gòu)成的自動控制系統(tǒng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝，其特征是制得的金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體粒徑分布為30-400nm、平均粒徑為80_200nm、包裹率為50-99 %、 儲存穩(wěn)定期為4-12個月。
全文摘要
本發(fā)明針對金屬硫蛋白及金屬硫蛋白與其它物質(zhì)復(fù)合體(如普通納米脂質(zhì)體)都難以自由穿過細(xì)胞膜的缺點，向人們公開了一種金屬硫蛋白柔性納米脂質(zhì)體的生產(chǎn)工藝。本生產(chǎn)工藝的步驟包括取一定量的金屬硫蛋白、蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑或凍干保護(hù)劑，配制成一定濃度的緩沖液；取一定比例的磷脂、膽固醇、表面活性劑、溶劑等制成有機(jī)相溶液；用高壓泵將緩沖液與有機(jī)相溶液充分混合制成混合分散液；將混合分散液通過超高壓納米均質(zhì)機(jī)制成粒徑比較均勻分布的納米脂質(zhì)體；將納米脂質(zhì)體通過納米超濾膜過濾；冷凍干燥、保存。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)工藝所生產(chǎn)的產(chǎn)品具有更好的保存穩(wěn)定性、細(xì)胞透過性，可廣泛的用于美容化妝品、心腦血管病等各種疾病的預(yù)防與治療。
文檔編號A61P37/04GK102512368SQ20111041888
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者汪志友 申請人:汪志友