專利名稱：黃芪甲苷在制備促進創(chuàng)面愈合上皮化藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及黃芪甲苷在制藥領域中的新用途，具體地說，是黃芪甲苷在制備促進創(chuàng)面愈合上皮化藥物中的應用。
背景技術：
中藥黃芪具有補齊、托毒、生肌之功效?！侗静菥V目》中記載其有排膿止痛，活血生肌，內托陰疽之功效，有“瘡家圣藥”的美譽，臨床常用于治療各種難愈性潰瘍。黃芪甲苷則是中藥黃芪的主要有效成分之一，其結構式為
該化合物的分子式是=C41H68O14,分子量784. 98，20%-30%的黃芪甲苷為黃色粉末，90% 的黃芪甲苷為白色粉末，98%的黃芪甲苷則為無色針晶，稍溶于甲醇，幾乎不溶于乙酸乙酯、 丙酮及水，在乙醇中加熱溶解。該化合物可從豆科植物黃芪(Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge)的干燥根部提取獲得，也可直接從公司購買，如上海中國藥品生物制品鑒定所。已知黃芪甲苷具有多種藥理作用，如可改善心肺功能，加強心臟收縮力，擴張血管，降低血壓，改善皮膚血液循環(huán)和營養(yǎng)狀況；保護肝臟，防止肝糖元減少，對慢性活動性肝炎有良好作用；誘生干擾素和調動機體免疫功能，抑制病毒繁殖和腫瘤生長；還可增強免疫力， 增加能量，抗疲勞。 慢性皮膚潰瘍又稱難治性潰瘍或難愈性潰瘍，往往是由于各種原因，如糖尿病、下肢靜脈曲張、創(chuàng)傷和長期壓迫等，導致的體表皮膚組織缺損，而缺損部位皮膚組織不能及時修復，進一步影響其正常生理功能，甚至繼發(fā)感染等，最終導致的一種常見于多種疾病的并發(fā)癥。該病具有病程長，反復發(fā)作，花費巨大的特點，對患者生活、心理和工作質量都具有極大影響。臨床實踐顯示，慢性難愈性皮膚潰瘍主要涉及創(chuàng)傷性潰瘍、下肢靜脈曲張性潰瘍、 老年性壓迫性潰瘍及糖尿病潰瘍等。在歐洲，下肢靜脈曲張性潰瘍發(fā)病率為0.1%-1% ；在美國，糖尿病人群中發(fā)生潰瘍的患者為5. 8%，因下肢潰瘍而住院的患者占20%，其中截肢患者約為6% ；在我國，因體表慢性難愈性創(chuàng)面在外科進行住院治療的患者占外科住院患者的 1.5%-3%。另外，我國目前約有3000萬糖尿病患者，其中I型糖尿病伴有下肢血管并發(fā)癥者占2. 6%, II型糖尿病為5. 2%，總計為5%。而且，我國糖尿病患者發(fā)病率逐年增高，目前已經成為全世界糖尿病患者最多的國家。慢性皮膚潰瘍花費巨大。據統(tǒng)計，英國每年治療慢性皮膚潰瘍的費用超過3億英鎊。美國每位患者的年治療費用超過2000美元。盡管我國沒有確切的衛(wèi)生經濟學統(tǒng)計數據，但勿容置疑的是，罹患慢性皮膚潰瘍的患者正承受無比沉重的經濟壓力。因此，積極研究中醫(yī)藥防治糖尿病及其并發(fā)癥，如皮膚、足潰瘍等慢性皮膚潰瘍，努力開發(fā)促進創(chuàng)面愈合的藥物，具有重要的社會意義及廣泛的經濟效益。現代醫(yī)學研究將創(chuàng)面愈合過程分為炎癥期、肉芽及血管組織增殖期、上皮化期與重塑期等不同階段。其中，創(chuàng)面上皮化是創(chuàng)面愈合的重要階段，該階段涉及角質形成細胞的增殖與遷移，特別是創(chuàng)緣角質形成細胞的向內遷移，有效覆蓋創(chuàng)面形成上皮，是創(chuàng)面愈合的關鍵步驟。所以，研究和開發(fā)可加快上皮化進程、促進角質形成細胞增殖和遷移的藥物，對攻克和治愈慢性皮膚潰瘍，意義十分重大。在對創(chuàng)面愈合機制的研究中，人們發(fā)現，Wnt信號通路與創(chuàng)面修復關系密切，涉及成纖維細胞、角質形成細胞的增殖與遷移、細胞外基質及膠原收縮、血管新生等諸多方面。 Wnt信號轉導通路是由Wnt基因編碼的Wnt蛋白及其受體、調節(jié)蛋白等一起組成的復雜的信號通路。該信號通路主要有3個①經典Wnt-β -catenin-LEF/TCF信號通路(簡稱經典Wnt信號通路)，這條通路激活后將募集細胞內的β -鏈蛋白(β -catenin)，將后者活化后轉移入細胞核，與轉錄因子LEF/TCF等共同作用激活特異基因的轉錄。而在未活化下， β-catenin則被磷酸化后降解；②細胞極性通路，主要調控細胞骨架的重排；③Wnt/Ca2+通路，通過鈣依賴性激酶、鈣調蛋白和轉錄因子激活T細胞核因子(NF-AT)起作用。已有研究證實經典Wnt信號通路相關糖蛋白與創(chuàng)面愈合有密切關系。在成年機體，Wnt基因則多處于相對靜止狀態(tài)。而在慢性皮膚潰瘍中，Wnt分子通過旁分泌和自分泌的方式作用于細胞膜(目前已知Wnt蛋白家族成員中，能激活經典Wnt信號通路的有Wntl、Wnt-3a和Wr^8)，與跨膜受體frizzelds及其共同受體低密度脂蛋白受體相關蛋白結合，進而降低β-catenin磷酸化的降解，使得β-catenin在細胞內聚集，最后進入細胞核與T細胞因子(TCF)結合，激活下游靶基因，例如c-myc、K6、K16、MMP-7、FN等。 其中，c-myc能夠促進細胞從Go期進入S期，被認為可能與細胞的增殖及分化相關。在正常人表皮中，c-myc的表達僅局限在表皮的基底細胞層，然而，有研究表明，在慢性皮膚潰瘍中，c-myc則在表皮全層表達增強，失衡的c-myc可能使干細胞耗竭，而抑制細胞生長并刺激其終末分化，同時還可導致細胞外骨架物質K6/K16蛋白降低，影響細胞遷移，不遷移的終末分化細胞堆積在創(chuàng)周阻礙上皮化形成?？茖W家通過對難愈性潰瘍與正常人皮膚相比較發(fā)現，慢性皮膚潰瘍患者創(chuàng)面β-catenin核表達、c-myc蛋白表達明顯增強。將潰瘍創(chuàng)緣 β -catenin核表達的角質形成細胞進行體外培養(yǎng)，發(fā)現其遷移能力與正常對照組相比顯著降低。因此，我們期望發(fā)現一種藥物，用來抑制慢性皮膚潰瘍患者的經典Wnt信號通路的過度激活，下調β-catenin以及通路下游基因的表達，從而促進角質形成細胞增殖和遷移，即促進創(chuàng)面愈合的上皮化進程，最終達到治愈慢性皮膚潰瘍的目的。但是，目前關于黃芪甲苷在制備促進創(chuàng)面愈合上皮化藥物中的應用還未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種黃芪甲苷在制藥中的新用途。為實現上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是 黃芪甲苷在制備促進創(chuàng)面愈合上皮化藥物中的應用。所述的上皮化為角質形成細胞的增殖； 所述的上皮化為角質形成細胞的遷移。所述的創(chuàng)面愈合上皮化是慢性皮膚潰瘍的創(chuàng)面修復。本發(fā)明優(yōu)點在于
1、本發(fā)明發(fā)掘了黃芪甲苷在制藥上的新用途，開拓了一個新的應用領域。2、黃芪甲苷可促進角質形成細胞的增殖和遷移，即可加快創(chuàng)面愈合過程中的上皮化進程，具有治療創(chuàng)面愈合的功效，為防治慢性皮膚潰瘍提供了重要的臨床依據。3、黃芪甲苷物質原料來源豐富、價格低廉、制備工藝簡單，具有廣闊的產業(yè)化前景，適于廣泛推廣使用。


附圖1是氯化鋰對小鼠角質形成細胞增殖的影響。附圖2是氯化鋰處理的小鼠角質形成細胞BrDU染色圖。附圖3是氯化鋰誘導角質形成細胞發(fā)生S期阻滯的分析圖。附圖4是氯化鋰對蛋白β -catenin和PCNA表達的影響。附圖5是黃芪甲苷在氯化鋰模擬激活經典Wnt信號通路下對角質形成細胞增殖的影響圖。附圖6是不同濃度黃芪甲苷在干預氯化鋰模擬激活經典Wnt信號通路7 時對角質形成細胞增殖的影響圖。附圖7是黃芪甲苷改善氯化鋰對角質形成細胞的遷移抑制圖。附圖8是黃芪甲苷降低氯化鋰誘導角質形成細胞引起的β -catenin核表達圖。附圖9是黃芪甲苷降低氯化鋰對角質形成細胞S期阻滯效應圖。附圖10是黃芪甲苷干預氯化鋰模擬激活經典Wnt信號通路下對β-catenin、 c-myc和PCNA表達的影響圖。附圖11是BrDU檢測顯示黃芪甲苷提高氯化鋰干預下細胞陽性率圖。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明。本具體實施方式
是以小鼠角質形成細胞為主要研究對象，探討氯化鋰(LiCL)模擬激活Wnt信號通路下，黃芪甲苷(Astragaloside IV，簡寫為AS-IV)對細胞增殖與遷移的影響。試驗所用AS-IV購自上海中國藥品生物制品鑒定所，取20mg AS-IV溶于Iml 二甲基亞砜(DMS0)，配成濃度為20mg/ml的儲存液，4°C冰箱備用，臨用時用Cnt_07培養(yǎng)液倍比稀釋，使其最終濃度分別為4(^8/1111，8(^8/1111，和160yg/ml ；所用LiCL購自美國Sigma 公司，使用無菌IX磷酸鹽緩沖液PBS配制為4M濃度，尼龍篩過濾，-4°C保存?zhèn)溆?；MTS/PMS 液購自美國!Iomega公司；β -catenin、c_myc、PCNA等試劑分別購于美國Cell Signaling Technology公司及Santa Cruz公司；Cnt-07細胞培養(yǎng)液，購自瑞士 CELLnTEC公司；二甲基亞砜(DMSO)購自Amreson公司；所用小鼠角質形成細胞是通過培養(yǎng)美國癌癥研究會的原代角質形成細胞制得。實施例1
LiCL模擬激活經典Wnt信號通路
1、MTS/PMS法檢測LiCL模擬激活經典Wnt信號通路及對角質形成細胞增殖的影響使用MTS/PMS法檢測LiCL對角質形成細胞增殖的影響，結果顯示采用從0. 5mM到 40mM不同濃度的LiCL，分別干預處理小鼠角質形成細胞24h，4 i和72h，LiCL在大于5mM 濃度時開始顯著抑制角質形成細胞生長(見圖9)。LiCL在Mh，48h，7a!時候的小鼠角質形成細胞半數抑制濃度IC50分別為25. 85士5. 03，16. 16士0. 95，12. 35士 1. 38mM。因此，本實驗采用20mM濃度培養(yǎng)48h開展后續(xù)對AS-IV的研究。2、BrDU染色法測定LiCL對角質形成細胞增殖的影響
BrDU染色的原理是在細胞周期的S期，和細胞一起孵育的BrdU能滲入DNA分子中， 再結合BrdU抗體與滲入DNA的BrdU特異性結合，就能夠檢測到DNA復制活躍的細胞。因此，利用BrDU在特定時間內摻入細胞的多少就可以反應出細胞增殖的狀態(tài)。我們采用BrDU 摻合法進一步觀察LiCL對角質形成細胞增殖的影響。結果如圖IOA所示正常空白對照組細胞生長正常，BrDU陽性率在對照組為71. 81 士6. 79%，提示細胞增生活躍，處于增殖指數期。采用LiCL培養(yǎng)干預細胞后發(fā)現，LiCL顯著抑制細胞增殖，隨著LiCL濃度的增加， BrDU 細胞陽性率細胞在 10mM，20mM，40mM 處理 24h 后分別為 57. 91 士6. 57%, 23. 48士3. 19% 和9. 67士2. 45% (見圖10A)，呈現隨LiCL干預濃度增加而增殖降低趨勢(見圖10B)。同時，Wfestern blot檢測顯示隨著LiCL濃度的增加，β-catenin蛋白表達也逐漸增強(見圖 10C),從而發(fā)揮顯著的抑制效應。3、LiCL抑制角質形成細胞增殖的機理研究 3. 1 LiCL誘導角質形成細胞發(fā)生S期阻滯
為進一步了解LiCL對角質形成細胞細胞周期的影響，我們采用流式細胞儀檢測了細胞周期的分布情況。如圖11所示以不同濃度的1^仏處理對11，4811，7211，細胞周期發(fā)生明顯改變。特別是在72h，隨劑量增加，S期與M期細胞明顯增多，尤以M期為主，Gl期細胞顯著降低，結合前述MTS/PMS檢測結果可知，細胞發(fā)生了 S期與M期的阻滯。3. 2 LiCL對β -catenin及TGF β信號通路相關蛋白的影響
如圖12所示=LiCL干預處理可引起β-catenin蛋白表達上調，且其上調水平與濃度有一定相關性。與此同時，隨著濃度的增加，細胞增殖指標PCNA蛋白水平亦顯著降低，結合前面的MTS/PMS檢測結果，提示細胞增殖受到抑制。
綜上所述，LiCL可模擬激活經典Wnt信號通路，特異性上調β -catenin的核表達， 顯著抑制角質形成細胞的增殖和遷移，其作用機制與誘導細胞S期阻滯、激活TGF β凋亡信號通路相關。實施例2
AS-IV改善LiCL對角質形成細胞的增生抑制
在利用LiCL模擬激活經典Wnt信號通路下，我們觀察AS-IV對角質形成細胞增生的影響。結果如圖5所示，經20mM的LiCL干預，細胞增生得到明顯抑制，而不同濃度的AS-IV對這一抑制均有明顯的糾正作用，可改善細胞受到的抑制情況，其作用效果在72小時最強。 由圖6可以看出，隨著AS-IV濃度的升高，糾正作用越明顯。實施例3
AS-IV改善LiCL對角質形成細胞的遷移抑制
為觀察AS-IV在體外對角質形成細胞的遷移功能影響，我們用LiCL模擬激活經典Wnt 信號通路后，采用刮擦實驗予以證實。結果顯示如圖7A所示，LiCL激活下的角質形成細胞，其遷移能力明顯減弱，刮擦損傷需要更長的時間修復，而在加入表皮生長因子(EGF)或 AS-IV的對照組，其細胞遷移抑制效應均能在一定程度上得到改善。如圖7B所示，LiCL處理的創(chuàng)緣角質形成細胞免疫熒光顯示核表達β-catenine，LiCL干預后的人工劃痕邊緣， 角質形成細胞遷移阻滯在β-catenine核表達最明顯的地方，而AS-IV可降低這一效應，細胞遷移開始從非核表達的細胞突破。圖7C顯示的是三次平均遷移結果，提示AS-IV能夠改善角質形成細胞的遷移。因此，該試驗亦表明AS-IV改善角質形成細胞遷移功能與降低經典Wnt信號通路的過度表達有關。實施例4
AS-IV的糾正作用的機制研究
通過實施例2和實施例3，我們初步觀察到LiCL模擬激活經典Wnt信號通路下， 對角質形成細胞具有兩方面的影響，即抑制細胞增殖與遷移，而AS-IV對這一效應均有一定程度的糾正作用。下面探討AS-IV是通過何種機制發(fā)揮作用的。1、AS-IV降低LiCL誘導角質形成細胞引起的β-catenin核表達
由于LiCL可明顯上調Wnt信號通路中的β -catenin,因此，我們對AS-IV干預下的 β-catenin表達進行檢測。借助熒光免疫檢測，我們發(fā)現，LiCL干預角質形成細胞后， β -catenin表達明顯增強，且呈現出典型的核表達。而顯著促進細胞增殖的陽性對照組藥物EGF并沒有出現該現象，仍然為明顯的膜表達。如圖8A所示，在LiCL干預4 后加入 AS-IV，72h以后觀察，發(fā)現由LiCL誘導的β-catenin核表達情況有所降低。進一步采用 Western blot法檢測相關蛋白，結果如圖8B所示，80 μ g/ml濃度的AS-IV，能顯著降低LiCL 誘導的β-catenin上調。我們可以推斷，在角質形成細胞中，LiCL可激活抑制細胞增殖與遷移，且與經典 Wnt信號通路激活，上調β-catenin及其相關下游調控蛋白密切相關。而AS-IV能糾正這一效應的機制，與拮抗這一過程有關。2、AS-IV降低LiCL對角質形成細胞S期阻滯效應
如實施1所述，LiCL模擬激活經典Wnt信號通路可觀察到角質形成細胞阻滯于S期， 細胞增殖水平明顯降低，為觀察AS-IV對細胞周期的影響，我們在LiCL干預模型基礎上，采用AS-IV同步處理，4 后，流式細胞儀檢測顯示，LiCL誘導的角質形成細胞S期阻滯得到一定程度改善(圖9)。對照組細胞GO期，S期與G2/M期細胞百分比分別為50. 83士0. 12%， 29. 69士 1. 83%和19. 14士2. 17%，提示大部分細胞均處于GO期。經LiCL干預48h后， GO期細胞降低至37. 22士2. 03%，而S期細胞顯著增加至48. 81 士7. 43%，G2/M期細胞則同步降低為13. 88士5. 42%。 經AS-IV同步干預的角質形成細胞組，其S期細胞則降至 35. 08士2. 14%，與LiCL干預組比較具有統(tǒng)計學差異(P=O. 019)，與正常對照組比較亦有統(tǒng)計學差異(P=O. 039)。同時，G2/M期細胞增加至19. 50士 1. 42%，與正常對照組比較無統(tǒng)計學差異(P=O. 690)，提示AS-IV同步處理的角質形成細胞可越過S期進入G2/M期，進行細胞增殖。同時，我們檢測了細胞增殖指標PCNA，結果如圖10所示，顯示反映細胞增殖水平的 PCNA蛋白在LiCL處理后表達量明顯降低，而在AS-IV同步干預下，PCNA蛋白表達有一定程度上調。另外，經典Wnt信號通路下游的表達基因c-myc的表達則有一定程度降低，亦從側面證實AS-IV可減弱LiCL對經典Wnt信號通路的激活。3、BrDU檢測顯示AS-IV提高LiCL干預下的細胞陽性率
實施例1已經表明AS-IV可降低LiCL誘導的細胞S期阻滯，為了解細胞在S期細胞增殖的情況，我們采用BrDU摻合法進一步檢測。結果如圖IlA所示，AS-IV可使20mM的LiCL 干預下細胞增殖明顯增多，如圖IlB所示，顯示AS-IV可使得20mM的LiCL干預下，角質形成細胞的 BrDU 陽性率由 23. 48士3. 19% 提升至 31. 05士7. 75% (p=0. 03)。Western bot 同時檢測β-catenine蛋白表達，發(fā)現AS-IV同時降低了 β-catenine的表達(圖11C)。綜上所述，LiCL模擬激活經典Wnt信號通路可誘導角質形成細胞增殖抑制和遷移，使細胞阻滯于S期。而AS-IV可減弱這一抑制效應，其作用機理與降低β-catenine蛋白核表達，降低LiCL對角質形成細胞S期阻滯效應和下調通路下游基因有關。而我們知道，慢性皮膚潰瘍疾病的創(chuàng)面愈合困難是因為經典Wnt信號通路過度激活，導致β -catenine蛋白核表達過量，進而導致下游c-myc等基因過量表達，最終抑制角質形成細胞的增殖和遷移，即創(chuàng)面愈合的上皮化進程。而創(chuàng)面上皮化又是創(chuàng)面愈合的關鍵步驟，因此，AS-IV對于加快創(chuàng)面愈合的上皮化進程，促進創(chuàng)面愈合和治療慢性皮膚潰蕩，將發(fā)揮重要的作用。實施例5
AS-IV治療創(chuàng)面愈合的臨床試驗
稱取6.3g的AS-IV粉末(購自上海中國藥品生物制品鑒定所)，加入1000ml 95%的乙醇。使用前，70°C水浴，充分溶解。病例來源2008年3月-2009年10月在上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院皮膚科住院及門診慢性皮膚潰瘍患者，共計63例。其中男性34例，女性四例；年齡18-80 歲，平均(50. 02士 14. 35)歲。隨機分為治療組21例，外用本實施例制備的AS-IV溶液，對照組21例，外用生肌散(購于天津宏仁堂藥業(yè)有限公司)，空白組21例，外用生理鹽水。治療方法三組治療方法均是用消毒棉簽蘸取涂抹物，直接涂到慢性皮膚潰瘍的病灶處，一日3次，連續(xù)使用4周。療效評價標準參考國家中醫(yī)藥管理局制定的《中醫(yī)外科病證診斷療效標準》，治療4周后進行療效評價。療效等級分為痊愈創(chuàng)面完全愈合，臨床癥狀消失；顯效創(chuàng)面縮小75%，臨床癥狀消失；好轉創(chuàng)面縮小25%，臨床癥狀改善；無效創(chuàng)面縮小不足25%，臨床癥狀無改善。臨床試驗結果如表1所示。表 權利要求
1.黃芪甲苷在制備促進創(chuàng)面愈合上皮化藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的上皮化為角質形成細胞的增殖。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的上皮化為角質形成細胞的遷移。
4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的創(chuàng)面愈合上皮化是慢性皮膚潰瘍的創(chuàng)面修復。
全文摘要
本發(fā)明涉及黃芪甲苷在制備促進創(chuàng)面愈合上皮化藥物中的應用，所述黃芪甲苷可以糾正氯化鋰模擬激活經典Wnt信號通路下對角質形成細胞增殖和遷移的抑制效應，因此它對創(chuàng)面愈合過程中的上皮化階段有促進作用，可用于制備治療慢性皮膚潰瘍或其它皮膚創(chuàng)面的藥物。本發(fā)明優(yōu)點在于發(fā)掘了黃芪甲苷在制藥上的新用途，開拓了一個新的應用領域；黃芪甲苷可促進角質形成細胞的增殖和遷移，即加快創(chuàng)面愈合過程中的上皮化進程，因此，具有治療創(chuàng)面愈合的功效，為防治慢性皮膚潰瘍提供了重要的臨床依據；黃芪甲苷物質原料來源豐富、價格低廉、制備工藝簡單，具有廣闊的產業(yè)化前景，適于廣泛推廣使用。
文檔編號A61K31/7048GK102349925SQ201110242219
公開日2012年2月15日 申請日期2011年8月23日 優(yōu)先權日2011年8月23日
發(fā)明者徐蓉, 李斌, 李欣, 李福倫, 王一飛, 范斌, 陳潔 申請人:上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院