專(zhuān)利名稱(chēng)：一種新的肋脈羊肚菌m8-13液體發(fā)酵物在保健品及醫(yī)藥開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新分離的羊肚菌M8-13及其在醫(yī)藥及保健品開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
羊肚菌(Morchella sp.)是世界著名的(藥)食用菌，在美國(guó)被稱(chēng)為“陸地魚(yú)”， 歐美一些發(fā)達(dá)國(guó)家認(rèn)為它是人體營(yíng)養(yǎng)的高級(jí)補(bǔ)品。在世界各地均有分布。羊肚菌子實(shí)體含有多種化學(xué)成分，據(jù)分析測(cè)定，每IOOg干品羊肚菌中含水分12. 869g，脂肪3. 829g,蛋白質(zhì) 22. 069g，其中蛋白質(zhì)含量是木耳的2倍，香菇的1. 5倍(龍正海等，1997)，且極易被人體吸收，這一點(diǎn)是其他高蛋白食品難以比擬的。羊肚菌含有10種氨基酸，特別是人體所必需的氨基酸含量豐富，高出一般食用菌的25% — 40%。羊肚菌中維生素和礦物質(zhì)元素種類(lèi)齊全，含量高，含維生素B及煙酸、生物素、 哆醇、葉酸、多種氨基酸等。每100克羊肚菌含礦物質(zhì)元素鉀2. 89g，磷1. 59g，分別是冬蟲(chóng)夏草的7倍和4倍鋅的含量是香菇的4. 3倍，猴頭菌的4倍；鐵的含量是香菇的31倍，猴頭菌的12倍(陳向東等，2002)。羊肚菌中還含有鈣、鎂、鈉、鉻等人體所需的元素，尤以有機(jī)鍺含量高。多種礦物質(zhì)的存在，使羊肚菌更顯得身價(jià)不凡。國(guó)內(nèi)外的研究主要集中在多糖、氨基酸和脂肪類(lèi)化合物，另外關(guān)于酶、吡喃酮抗生素、無(wú)機(jī)元素、色素、醇、留醇和皂苷類(lèi)也有報(bào)道1-3。由于羊肚菌的菌絲體不但含有子實(shí)體的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和活性成分，而且還能較好的保持子實(shí)體獨(dú)特的風(fēng)味，并適于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，所以羊肚菌菌絲體深層發(fā)酵研究近年來(lái)得到了迅速的發(fā)展，開(kāi)發(fā)利用菌絲體、發(fā)酵液的報(bào)道也很多。深層發(fā)酵技術(shù)具有易操作、菌絲體增殖快、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量大等優(yōu)點(diǎn)， 以深層發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵液為主要原料提取羊肚菌各種營(yíng)養(yǎng)成分和活性成分，可明顯降低成本，提高生產(chǎn)效率。但是，目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有成熟羊肚菌菌絲體及多糖等方面的產(chǎn)品上市。羊肚菌營(yíng)養(yǎng)豐富具有較高的藥用價(jià)值，開(kāi)發(fā)出系列保健品將具有廣闊的市場(chǎng)前景。野生羊肚菌資源量有限、人工栽培不成功、野生羊肚菌國(guó)際市場(chǎng)供不應(yīng)求等因素，使羊肚菌價(jià)格逐年上漲(達(dá)2000元/公斤)。因此，通過(guò)羊肚菌發(fā)酵開(kāi)發(fā)保健品將為解決人類(lèi)在免疫機(jī)能低下、抗藥性等多方面醫(yī)學(xué)難題。大型真菌多糖免疫增強(qiáng)機(jī)制主要是從免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子各層次刺激巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、殺傷細(xì)胞、B細(xì)胞，增加他們的數(shù)量，增強(qiáng)他們的活性，進(jìn)而促使免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用。多糖從免疫器官層次上促進(jìn)胸腺和脾臟的生長(zhǎng)和分化，增加他們的重量，進(jìn)而促進(jìn)免疫器官中的T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量增加。多糖從免疫細(xì)胞層次上促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞的成熟、分化和分泌。羊肚菌科(Morchellaceae)，不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，羊肚菌還具有較高的藥效，其菌體內(nèi)含有大量的多糖等成分，具有較強(qiáng)抗腫瘤作用， 調(diào)節(jié)免疫功能，抗疲勞，并能減輕癌癥患者放化療引起的毒副作用。由此可見(jiàn)，羊肚菌是是一種具有開(kāi)發(fā)前景的珍稀食用菌，并可出口創(chuàng)匯，其在醫(yī)藥、食品、健品、化妝品等領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價(jià)值。羊肚菌含有較高的蛋白質(zhì)碳水化合物多種氨基酸多種維生素等營(yíng)養(yǎng)成分；與冬蟲(chóng)夏草功能相同，是一種不含任何激素?zé)o任何副作用的天然補(bǔ)品，常吃不但可提高免疫力，還可消除面部的色斑黃斑雀斑使皮膚變白變嫩[2]。但目前，對(duì)羊肚菌有效成分的提取與純化研究尚不夠深入，關(guān)于羊肚菌對(duì)細(xì)菌等的抑制作用基本沒(méi)有查到相關(guān)報(bào)道。現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題羊肚菌作為一種珍稀食藥用真菌，其研究仍停留在形態(tài)學(xué)和生態(tài)學(xué)水平，對(duì)其營(yíng)養(yǎng)生化特征的研究很少。國(guó)內(nèi)至今沒(méi)有對(duì)羊肚菌多糖進(jìn)行過(guò)較系統(tǒng)研究。近幾年，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)羊肚菌多糖的研究取得了一定進(jìn)展。賈建會(huì)等[11]以深層發(fā)酵的羊肚菌菌絲體和發(fā)酵液為主要原料提取羊肚菌多糖，對(duì)影響多糖提取率的幾個(gè)因素分別進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，并對(duì)多糖進(jìn)行了純化及組分鑒定。魏蕓等[12]從液體深層發(fā)酵所得的羊肚菌發(fā)酵液中提取了 3 種羊肚菌純多糖，分析了其組分和結(jié)構(gòu)。李群[13]用蒽酮比色法進(jìn)行了羊肚菌多糖含量的測(cè)定，為羊肚菌多糖的深入研究奠定了基礎(chǔ)。而羊肚菌菌絲體在營(yíng)養(yǎng)成分上與子實(shí)體相當(dāng)[15]。由于羊肚菌不能進(jìn)行大規(guī)模的人工栽培，因此在食用羊肚菌子實(shí)體的同時(shí)，人們更側(cè)重于羊肚菌菌絲體的發(fā)酵研究。1958年J. Sguest首次在發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)羊肚菌菌絲球，并進(jìn)行了 25000加侖的生產(chǎn)試驗(yàn)，上世紀(jì)60年代以來(lái)，美、法等國(guó)開(kāi)始大規(guī)模生產(chǎn)其菌絲體，用以制造調(diào)味品，其產(chǎn)品深受消費(fèi)者的歡迎。目前[14]國(guó)外已經(jīng)能夠進(jìn)行500L以下規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)，并出現(xiàn)了專(zhuān)門(mén)適于羊肚菌發(fā)酵的設(shè)備。我國(guó)研究雖然較為滯后，目前仍處于中小試階段，但近年來(lái)研究取得了較大的進(jìn)展。人們對(duì)羊肚菌液體菌種、液體培養(yǎng)基進(jìn)行了廣泛的研究劉士旺等[16] (1998)探索了羊肚菌液體培養(yǎng)條件并篩選了培養(yǎng)基，趙良啟等[17](1999)通過(guò)搖瓶正交試驗(yàn)研究了尖頂羊肚菌液體發(fā)酵的合適條件。而今，人們都致力于尋找羊肚菌菌絲的最優(yōu)發(fā)酵條件，以求羊肚菌菌絲產(chǎn)量達(dá)到更高，使效益更高。

發(fā)明內(nèi)容
在實(shí)踐中已經(jīng)證明，只有獲得較高活力、生產(chǎn)性能優(yōu)良的菌株，才有可能實(shí)現(xiàn)成功發(fā)酵和生產(chǎn)，降低生產(chǎn)成本。通過(guò)自然選育淘汰活力差、發(fā)酵能力弱的菌株，為進(jìn)一步菌株改良和發(fā)酵生產(chǎn)打下一個(gè)堅(jiān)實(shí)的起點(diǎn)和基礎(chǔ)。因此，本發(fā)明從菌種選育著手，主要對(duì)本實(shí)驗(yàn)室已有的M株羊肚菌進(jìn)行產(chǎn)多糖和菌絲體干重的初步篩選。從菌種方面的優(yōu)勢(shì)作為以后大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的前提，旨在提高胞外多糖量的同時(shí)生物量也達(dá)到較高水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種肋脈羊肚菌(M0rChellaC0Stata)M8-13，其保藏號(hào)為CGMCC3899。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了所述肋脈羊肚菌M8-13用于發(fā)酵生產(chǎn)肋脈羊肚菌菌絲體的用途。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了所述肋脈羊肚菌M8-13或其菌絲體在制備保健品中的用途。優(yōu)選地，其中所述保健品用于降血脂、抑氧化、抗輻射、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能、抗疲勞，以及減輕癌癥患者放化療引起的毒副作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了所述肋脈羊肚菌M8-13或其菌絲體在制備用于治療疾病藥物中的用途。優(yōu)選地，其中所述疾病包括腫瘤、高血脂、免疫功能失調(diào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用所述肋脈羊肚菌M8-13或其菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)真菌多糖的方法，包括
(1)發(fā)酵培養(yǎng)所述肋脈羊肚菌M8-13的孢子；(2)離心沉淀步驟(1)的發(fā)酵液中多糖；(3)提取并純化步驟O)中沉淀的多糖。優(yōu)選地，其中步驟(3)的提純方法為水提醇沉法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了所述肋脈羊肚菌M8-13或其菌絲體在用于抑菌的藥物的制備中的用途，優(yōu)選地，其中所述細(xì)菌為金黃色葡萄球菌。


圖1示出了羊肚菌M8-13子實(shí)體(左)及培養(yǎng)的菌絲體(右)。圖2示出了羊肚菌M8-13固體培養(yǎng)物(左)及M8-13胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制(中)，對(duì)照菌株(右)。圖3示出了 M8系列羊肚菌生物量的比較，小寫(xiě)字母表示5%差異顯著水平，大寫(xiě)字母表示差異顯著水平；相同字母表示差異不顯。圖4示出了 M8系列羊肚菌第5天產(chǎn)胞外多糖的比較，小寫(xiě)字母表示5%差異顯著水平，大寫(xiě)字母表示差異顯著水平；相同字母表示差異不顯著，不同字母表示差異顯
-frh-
者O圖5示出了 M8和M9系列羊肚菌第5天產(chǎn)胞內(nèi)多糖的比較，小寫(xiě)字母表示5%差異顯著水平，大寫(xiě)字母表示差異顯著水平；相同字母表示差異不顯著，不同字母表示差異
顯者ο
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的菌株的篩選、鑒定、多糖的測(cè)定篩選、抗菌活性的篩選等都是在中國(guó)，青海西寧，青海大學(xué)謝占玲教授的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的。羊肚菌是世界著名的野生食(藥)用菌， 肉質(zhì)脆嫩鮮美、營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值極高，故在食品、醫(yī)藥、保健、化妝品等領(lǐng)域顯示出極大的開(kāi)發(fā)潛力。近年來(lái)，由于人工砍伐森林、水土流失、鼠害、人類(lèi)的過(guò)度活動(dòng)及對(duì)經(jīng)濟(jì)利益追逐等，青藏高原羊肚菌資源急劇減少。本發(fā)明的發(fā)明人收集并成功分離純化青藏高原羊肚菌屬M(fèi)株分離株純培養(yǎng)物 (分別屬黃羊肚菌和黑羊肚菌涵蓋了 5-6個(gè)種)，試驗(yàn)菌株:M8和M9系列菌由青海大學(xué)生物科學(xué)系微生物實(shí)驗(yàn)室2008年5月和2009年5月從青藏高原采羊肚菌分離得到。發(fā)明人還選用羊肚菌51009 (Morchella esculenta 51009，中國(guó)農(nóng)科院)菌株做對(duì)照。實(shí)施例1羊肚菌的收集將采集自青藏高原的羊肚菌表面處理干凈，用95 %的乙醇擦拭后，放于干凈的平皿或廣口瓶中，置于烘箱中40°C下，待孢子大量彈出后，挑取其孢子，在PDA(土豆20%、蔗糖2%、瓊脂1. 5-2%, pH自然)平板上劃線(xiàn)。25°C培養(yǎng)一天后用顯微鏡觀察，待觀察到有單個(gè)孢子萌發(fā)后，再將萌發(fā)處的培養(yǎng)基切下轉(zhuǎn)移于另一 PDA平板上。保存在PDA斜面培養(yǎng)基中。發(fā)明人對(duì)這些菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，所有菌株都先在PDA固體培養(yǎng)基上活化，液體發(fā)酵培養(yǎng)基(KH2PO4 0. 1%,MgSO4 0. 1%，蔗糖2%，蛋白胨0. 5%)，再其轉(zhuǎn)到150mL三角瓶裝的液60mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25°C下、lOOr/min的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
在所培養(yǎng)的M株羊肚菌中，對(duì)其生物量、胞外多糖及其對(duì)應(yīng)黃色葡萄球菌的抑制作用進(jìn)行研究。通過(guò)對(duì)其形態(tài)學(xué)特征的分析(子實(shí)體的形態(tài)特征，例如菌絲體的寬度和生長(zhǎng)習(xí)性)及它的ITS序列，鑒定菌株肋脈羊肚菌(Morchella Costata)M8-13。對(duì)23株羊肚菌進(jìn)行了胞內(nèi)和胞外抗菌實(shí)驗(yàn)篩選，供試菌種為乳酸大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌；并用蒽酮硫酸法測(cè)定了 23株羊肚菌的菌絲體胞內(nèi)多糖含量。實(shí)施例2篩選生物量及胞外多糖產(chǎn)量高的菌株將斜面液體石蠟封存的菌種轉(zhuǎn)接至PDA固體培養(yǎng)基上，25°C下恒溫光照培養(yǎng)，其中M8系列和M51009培養(yǎng)5天。在PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行菌種活化后，再將其轉(zhuǎn)到150mL三角瓶裝液60mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，每種菌株做3個(gè)平行對(duì)照，25°C和lOOr/min的條件下進(jìn)
行培養(yǎng)。(1)胞外多糖的沉淀分別將培養(yǎng)到第3天、第4天、第5天的羊肚菌發(fā)酵液吸出4mL，以3500r/min離心 15min，每個(gè)離心管吸3mL上清液，加入9mL無(wú)水乙醇，_10°C沉淀M小時(shí)。(2)胞外多糖的測(cè)定將沉淀的多糖以3500r/min離心15min，棄上清，加入3mL蒸餾水在60°C水浴中溶解，稀釋30倍，配成多糖溶液，用蒽酮硫酸法測(cè)定多糖，取多糖溶液2mL，置于冰水浴5min 后，在冰水浴中加蒽酮顯色劑(蒽酮&S04=lg 500mL，待蒽酮溶解后即成)6mL，混勻， 沸水浴15min，然后再次置于冰水浴中5min，室溫下平衡lOmin，使用UV-9200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司)在620nm處比色，結(jié)果如圖4所示。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為:y = 9. 5256x-0. 0027 (R2 = 0. 9993)表1菌株的胞外多糖含量
菌株編號(hào)胞外多糖(g/L)
M8-10.272
M8-20.265
M8-90.264
Γ_οο Μ8-140.256
Μ8-110.254
Μ8-70.243
Μ510090.240
Μ8-50.236
Μ8-130. 194
Μ8-3_0. 125_(3)菌絲體干重的測(cè)定將發(fā)酵8天的發(fā)酵液以紗布過(guò)濾以獲得菌絲體，用蒸餾水反復(fù)沖洗3次，置烘箱中 55°C下烘至恒重，稱(chēng)重，結(jié)果如圖3所示。表2菌株的菌絲體干重處理菌絲體干重均值(g/L)
權(quán)利要求
1.一種肋脈羊肚菌(Morchella Costata)M8-13，其保藏號(hào)為 CGMCC3899。
2.權(quán)利要求1所述的肋脈羊肚菌M8-13用于發(fā)酵生產(chǎn)肋脈羊肚菌菌絲體的用途。
3.權(quán)利要求1所述的肋脈羊肚菌M8-13或其菌絲體在制備保健品中的用途。
4.權(quán)利要求3所述的用途，其中所述保健品用于降血脂、抑氧化、抗輻射、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能、抗疲勞，以及減輕癌癥患者放化療引起的毒副作用。
5.權(quán)利要求1所述的肋脈羊肚菌M8-13或其菌絲體在制備用于治療疾病藥物中的用途。
6.權(quán)利要求5所述的用途，其中所述疾病包括腫瘤、高血脂、免疫功能失調(diào)。
7.一種用權(quán)利要求1所述的肋脈羊肚菌M8-13或其菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)真菌多糖的方法， 包括(1)發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的肋脈羊肚菌M8-13的孢子；(2)離心沉淀步驟(1)的發(fā)酵液中多糖；(3)提取并純化步驟中沉淀的多糖。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中步驟(3)的提純方法為水提醇沉法。
9.權(quán)利要求1所述的肋脈羊肚菌M8-13或其菌絲體在用于抑菌的藥物的制備中的用途。
10.權(quán)利要求9所述的用途，其中所述細(xì)菌為金黃色葡萄球菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新分離的羊肚菌(Morchella)M8-13及其在醫(yī)藥及保健品開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102174414SQ20101062298
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2010年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月28日
發(fā)明者戚永躍, 謝占玲 申請(qǐng)人:青海大學(xué)