專利名稱：一種鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及一種鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
鴨坦布蘇病毒病又名“鴨黃病毒病”、“鴨出血性卵巢炎”、“蛋鴨黃病毒病”和“新型黃病毒BYD引起的產(chǎn)蛋下降綜合征”，它是2010年在中國浙江、福建、山東、廣東等地首次發(fā)現(xiàn)的一種新鴨病，主要發(fā)生于蛋鴨、也發(fā)生于種鵝、肉鴨。蛋鴨發(fā)生此病時，臨床表現(xiàn)為肢體站立不穩(wěn)，行走困難，采食量下降，產(chǎn)蛋量驟然減少，減蛋幅度很大，5天內(nèi)減蛋超過90%或者絕產(chǎn),部分病鴨在數(shù)日內(nèi)死亡,死亡率為5% 10%。剖檢病變?yōu)槁殉舶l(fā)生出血、萎縮、卵泡破裂或萎縮等。此前，國內(nèi)外未見類似疾病。2010年藤澤泱、曹貞貞、萬春和等、2011年蘇敬良等證明該病病原屬于黃病毒科黃病毒屬坦布蘇病毒(Flaviviridae, Flavivirus, Duck Tembusu virus, DTMUV)。2011年胡奇林等從廣東省發(fā)生鴨坦布蘇病毒病的蛋鴨中分離到I株鴨黃病毒JM株，對JM進行了鑒定，測定了 JM株部分理化和生物學(xué)特性，并進行了動物回歸試驗等。迄今為止，未見國內(nèi)外有關(guān)鴨坦布蘇病毒病免疫治療方面的研究報道。因此，研制一種安全有效的鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑及其制備方法對我國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展具有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑，該免疫治療制劑安全性好，治療鴨坦布蘇病毒病效果顯著，安全可靠。本發(fā)明的另一個目的在于提供上述鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑的制備方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是一種鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑的制備方法，包括如下步驟a.蛋鴨開產(chǎn)前高免對蛋鴨群開產(chǎn)前進行鴨坦布蘇病毒病高強度免疫，當血清抗體瓊擴效價達1:16為合格；b.采集高免鴨蛋采集經(jīng)高免的蛋鴨群開產(chǎn)一個月內(nèi)的初產(chǎn)蛋；c.清潔消毒將采集的高免鴨蛋清潔后，用質(zhì)量百分比濃度為0. 5%的新潔爾滅溶液浸泡消毒20min,晾干；d.分離卵黃在無菌條件下，打破蛋殼倒凈蛋清，把蛋黃倒入消毒好的大燒杯內(nèi)；e.蛋黃勻漿在無菌條件下，將蛋黃置于消毒好的搗碎機內(nèi)，加入一定比例的生理鹽水進行勻漿；f.防腐抑菌在無菌條件下，勻漿后的卵黃加入質(zhì)量百分比濃度為0. 01%的硫柳汞溶液或每毫升卵黃液加入青霉素、鏈霉素各一千單位進行防腐抑菌；g.封裝保存在無菌條件下，將所述步驟e中經(jīng)防腐抑菌的卵黃液搖勻后分裝于消毒好的瓶中，凍結(jié)保存待用，保存溫度為4-8°C或-20°C ；優(yōu)選地，所述a步驟的具體操作為第一步將鴨黃病毒毒株的生產(chǎn)用種毒進行大規(guī)模培養(yǎng)，收獲病毒液；第二步將收獲的病毒液滅活；滅活病毒液I倍膜濃縮。第三步將滅活濃縮后的病毒液加入佐劑中，乳化后即得免疫用抗原；第四步取免疫用抗原免疫蛋鴨，末次免疫后15 20天，隨機采血分離血清，用瓊脂擴散試驗(AGP)測定抗DTMUV抗體效價，直到抗體效價達1:16合格為止；進一步的，所述制得的鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑所含的瓊擴抗體效價達1:16以上；所述第三步的具體操作為將I體積份滅活后的病毒液加入2體積份的白油佐劑中， 在高速勻漿機中以8000 12000r/min乳化，即得免疫用抗原。優(yōu)選地，所述生理鹽水為與所述卵黃等體積質(zhì)量濃度為0. 85%的氯化鈉溶液。一種用所述制備方法制備得到的鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑，含有抗鴨坦布蘇病毒高免卵黃抗體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果I、本發(fā)明的鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑安全性好；2、治療效果好。對發(fā)病后2天的產(chǎn)蛋鴨用本發(fā)明的免疫治療制劑注射2ml/只后，第2天后精神轉(zhuǎn)好、食欲增加、運動逐漸轉(zhuǎn)為正常，產(chǎn)蛋率開始升高；對發(fā)病后第5天的產(chǎn)蛋鴨注射本發(fā)明之免疫治療制劑2ml/只，第2天后發(fā)病鴨精神好轉(zhuǎn)、食欲增加、運動逐漸轉(zhuǎn)為正常，第5天后產(chǎn)蛋率開始升高。證明該免疫治療制劑可以用于臨床上治療鴨坦布蘇病毒病，具有重大的經(jīng)濟和社會效益。3、成本較低、適合工業(yè)化生產(chǎn)；本發(fā)明治愈每只產(chǎn)蛋鴨只需2ml免疫治療制劑，成本約為0. 2元；需要的設(shè)備比較簡單，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實施例方式本發(fā)明所述的實例是對本發(fā)明的說明而不能限制本發(fā)明，在與本發(fā)明相當?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改變和調(diào)整，都應(yīng)認為是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明。具體實施例鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑的制備方法鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑的制備步驟如下本發(fā)明抗原用種毒株是黃病毒科黃病毒屬亞坦布蘇病毒廣東株(JM),于2011年10月14日送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCV201131。I、毒種繁殖用JM株第7代尿囊液毒(代號JMDE7，ELD50為10-6. 0/ml)經(jīng)尿囊接種11日齡麻鴨胚，0. 2ml/胚，37°C培養(yǎng)，每天照胚2次，棄去24h死亡胚胎，之后死亡鴨胚置4°C冰箱，于24h內(nèi)無菌收獲死胚尿囊液(以下稱含毒尿囊液)，記號為JMDE8，放-80°C冰箱保存?zhèn)溆?。取JMDE8尿囊液毒用麻鴨胚按殷震等[殷震，劉振華主編，動物病毒學(xué)，第二版，329-330，科學(xué)出版社，北京]的方法測定鴨胚半數(shù)致死量(ELD5tlX結(jié)果，JMDE8的ELD5tl為10_6 25/ml，作為基礎(chǔ)種子和生產(chǎn)用毒種備用。2、病毒繁殖
按上述“毒種繁殖”的方法用生產(chǎn)用毒種接種11日齡麻鴨胚，收獲尿囊液(代號為JMDE9)并測定毒價，毒價為106_ 5ELD5(l/ml，大于105 5ELD5(l/ml，判為合格，用于免疫用抗原。3、病毒滅活及檢驗將JMDE9尿囊液毒低速離心去沉淀后，加O. 3%甲醒，于37°C滅活24h，期間振搖數(shù)次。滅活完畢后置4°C冰箱保存?zhèn)溆?。將滅活好的含毒尿囊液接種5枚11日齡麻鴨胚，O. 2ml/胚，37°C培養(yǎng)，每天照胚2次，觀察7天，結(jié)果5枚胚全部成活，表明病毒滅活徹底。4、免疫用抗原制備將徹底滅活的尿囊液經(jīng)用膜處理作I倍濃縮。將I體積份滅活濃縮后的病毒液加·入2體積份的白油佐劑中，在高速勻漿機中以8000 12000r/min乳化。
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5、免疫健康蛋鴨用上述免疫用抗原免疫健康蛋鴨，免疫方案如下在蛋鴨開產(chǎn)前60天用上述免疫用抗原經(jīng)肌肉注射蛋鴨進行初次免疫，劑量為Iml/只；間隔14天，使用上述抗原經(jīng)肌肉注射進行第二次免疫，劑量為I. 5ml/只；間隔28天，使用上述抗原經(jīng)肌肉注射進行第三次免疫，劑量為2ml/只，第三次免疫后15 20天，隨機采5只鴨血分離血清，用瓊脂擴散試驗(AGP)測定抗DTMUV抗體效價。所述瓊脂擴散試驗(AGP)具體操作步驟為I)、打孔在制備的瓊脂板上按7孔一組的梅花形打孔，(中間I孔，周圍6孔)，孔徑約5mm，孔距2mm-5mm，將孔中的瓊脂用8號針頭斜面向上從右側(cè)邊緣插入，輕輕向左側(cè)方向?qū)傊舫觯饌吘壔蚴弓傊瑢用撾x皿底。2)、封底用酒精燈輕烤平皿底部至瓊脂剛剛要融化為止，封閉孔的底部，以方側(cè)漏。3)、加樣用微量移液器或帶有6-7號針頭的O. 25ml注射器,吸取抗原懸液滴入中間孔，標準陽性血清分別加入外周的兩孔中，被檢血清按編號順序分別加入另外4個外周孔。每孔以加滿不溢出為度，每加I個樣品應(yīng)換I個滴頭。4)、作用加樣完畢后，靜止5min-10min，然后將平皿輕輕倒置放入濕盒內(nèi)，37°C溫箱中作用，分別在24h、48h和72h觀察并記錄結(jié)果。AGP效價彡1:16為合格，當AGP效價彡1:16時，再加強免疫，劑量為2ml/只，直到抗體效價合格為止。6、收集免疫合格鴨群所產(chǎn)蛋，制備高免卵黃抗體。收集免疫合格鴨群所產(chǎn)蛋，按照下列步驟操作(I)高免蛋的消毒先用清潔水洗去蛋殼表面的糞污，再用O. 5%的新潔爾滅溶液浸泡消毒20min，然后晾干。無菌條件下打破蛋殼倒凈蛋清，把蛋黃倒入消毒好的大燒杯內(nèi)。(2)蛋黃勻漿將蛋黃置于消毒好的搗碎機內(nèi)，加入等體積質(zhì)量濃度為5%的氯化鈉溶液生理鹽水進行勻漿。(3)加防腐抑菌劑勻漿后的卵黃加入O. 01%硫柳汞或每毫升卵黃液加入青霉素、鏈霉素各一千單位進行防腐抑菌，搖勻后分裝于消毒好的瓶中，凍結(jié)保存，保存溫度為4-8。?；?20。。。(4)高免蛋黃液的檢測
安全性檢驗健康雛雞，每只皮下注射卵黃液1ml，觀察一周應(yīng)健康存活。無菌檢驗取高免卵黃液分別接種于分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂河厭氧肉湯培養(yǎng)基上于培養(yǎng)24小時,無細菌生長。7、鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑的安全性試驗共進行2次試驗，第一次取11只127日齡健康蛋鴨隨機分成2組，第I組5只，為空白對照組，經(jīng)腿部內(nèi)側(cè)肌肉接種生理鹽水，劑量為2. 5ml/只；第二組6只，為試驗組，經(jīng)腿部內(nèi)側(cè)肌肉接種實施例卵黃抗體，劑量為2. 5ml/只，隔離飼養(yǎng)，觀察15天。結(jié)果，對照組和試驗組鴨均未見不良反應(yīng)，表明該卵黃抗體安全性好。具體結(jié)果見表1，表I為鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑安全性試驗結(jié)果。
第二次試驗取130日齡鴨15只，第I組7只，為空白對照組，經(jīng)腿部內(nèi)側(cè)肌肉接種生理鹽水，劑量為2. 5ml/只；第2組8只，為試驗組，經(jīng)腿部內(nèi)側(cè)肌肉接種生理鹽水，劑量為
2.5ml/只，隔離飼養(yǎng)，觀察15天。結(jié)果，對照組和試驗組鴨均未見不良反應(yīng)，表明該卵黃抗體安全性好。具體結(jié)果見表2，表2為鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑治療試驗結(jié)果。表I
權(quán)利要求
1.一種鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 a.蛋鴨開產(chǎn)前高免對蛋鴨群開產(chǎn)前進行鴨坦布蘇病毒病高強度免疫，當血清抗體瓊擴效價達1:16為合格； b.采集高免鴨蛋采集經(jīng)高免的蛋鴨群開產(chǎn)一個月內(nèi)的初產(chǎn)蛋； c.清潔消毒將采集的高免鴨蛋清潔后，用質(zhì)量百分比濃度為0.5%的新潔爾滅溶液浸泡消毒20min,晾干； d.分離卵黃在無菌條件下，打破蛋殼倒凈蛋清，把蛋黃倒入消毒好的大燒杯內(nèi)； e.蛋黃勻漿在無菌條件下，將蛋黃置于消毒好的搗碎機內(nèi)，加入一定比例的生理鹽水進行勻漿； f.防腐抑菌在無菌條件下，勻漿后的卵黃加入質(zhì)量百分比濃度為0.01%的硫柳汞溶液或每毫升卵黃液加入青霉素、鏈霉素各一千單位進行防腐抑菌； g.封裝保存在無菌條件下，將所述步驟e中經(jīng)防腐抑菌的卵黃液搖勻后分裝于消毒好的瓶中，凍結(jié)保存待用，保存溫度為4-8°C或_20°C。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑的制備方法，其特征在于，所述a步驟的具體操作為 第一步將鴨坦布蘇病毒毒株的生產(chǎn)用種毒進行大規(guī)模培養(yǎng)，收獲病毒液； 第二步將收獲的病毒液滅活；滅活病毒液I倍膜濃縮。
第三步將滅活濃縮后的病毒液加入佐劑中，乳化后即得免疫用抗原； 第四步取免疫用抗原免疫蛋鴨，末次免疫后15 20天，隨機采血分離血清，用瓊脂擴散試驗(AGP)測定抗DTMUV抗體效價，直到抗體效價達1:16合格為止。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑的制備方法，其特征在于所述制得的鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑所含的瓊擴抗體效價達1:16以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑的制備方法，其特征在于所述第三步的具體操作為將I體積份滅活后的病毒液加入2體積份的白油佐劑中，在高速勻漿機中以8000 12000r/min乳化，即得免疫用抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑的制備方法，其特征在于所述生理鹽水為與所述卵黃等體積質(zhì)量濃度為0. 85%的氯化鈉溶液。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述制備方法得到的鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑，其特征在于含有抗鴨坦布蘇病毒高免卵黃抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑及其制備方法，屬于生物制藥領(lǐng)域。本發(fā)明的鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑，制備方法如下將鴨坦布蘇病毒毒株的生產(chǎn)用種毒進行大規(guī)模培養(yǎng)，收獲病毒液；隨后將收獲病毒液滅活并濃縮，將滅活并濃縮后的病毒液加入佐劑中，乳化后即得免疫用抗原；取免疫用抗原免疫蛋鴨，末次免疫后隨機采血分離血清，用瓊脂擴散試驗(AGP)測定抗DTMUV抗體效價，直到抗體效價合格為止；收集免疫合格鴨群所產(chǎn)蛋，按常規(guī)方法制成高免卵黃抗體；本發(fā)明鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑含有抗鴨坦布蘇病毒高免卵黃抗體。本發(fā)明制備的鴨坦布蘇病毒病免疫治療制劑有治療效果好、安全可靠和成本低的優(yōu)點，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A61K39/42GK102793923SQ201210313900
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月29日
發(fā)明者魏平華, 胡奇林, 程懷靈, 孫敏華, 魏蘇紅, 董嘉文, 邱志欣, 李林林, 黃志松, 袁建豐 申請人:廣州格雷特生物科技有限公司, 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所