專利名稱：用于預(yù)防或治療動脈硬化引起的疾病的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防或治療動脈硬化引起的疾病的組合物。
背景技術(shù)：
動脈硬化是心血管和腦血管疾病的主要原因，這兩種疾病在工業(yè)化國家中是死亡率的主要原因。動脈硬化是一個(gè)漸進(jìn)的過程，涉及多種因素，如幾種介質(zhì)和信息路徑，包括 ERK 1/2 信號(Millette E，Rauch BH，Defawe 0，Kenagy RD，Daum G，ClowesAW. Platelet-derived growth factor-bb—induced human smooth muscle cell proIiferation depends on basic fgf release and fgfr-1 activation. Circ Res 2005 ；96 :172-179 ；Abraham ST, Benscoter HA, Schworer CM，Singer HA. A role for ca2+/calmodulin—dependent protein kinase ii in the mitogen-activated proteinkinase signaling cascade of cultured rat aortic vascular smooth muscle cells.Circ Res 1997 ；81 :575-584 ；Libby P，Aikawa Μ. Stabilization of atheroscleroticplaques :New mechanisms and clinical targets. Nat Med 2002 ；8 1257-1262)、發(fā)炎反應(yīng)、生長因子、細(xì)胞激素、趨化激素及黏附分子(Libby P，Ridker PM, MaseriA. Inflammation and atherosclerosis. Circulation2002 ；105 :1135-1143 ；Pussinen PJ,Tuomisto K，Jousilahti P，Havulinna AS，Sundvall J，Salomaa V.Endotoxemia, immuneresponse to periodontal pathogens， and systemic inflammation associate withincident cardiovascular disease events. Arterioscler Thromb Vasc Biol2007 ；27 1433-1439)。除了脂質(zhì)外，促發(fā)炎因子(pro-inflammatory factor)也在促成動脈硬化疾病的病理過程中扮演重要的角色(Wang JM，Sica A，Peri G，Walter S，Padura IM，LibbyP，Ceska M，Lindley I，Colotta F，Mantovani A. Expression of monocyte chemotacticprotein and interleukin—8 bycytokine-activated human vascular smooth musclecells.Arterioscler Thromb 1991 ；11 :1166-1174 ；Loppnow H，Libby P.Proliferatingor interleukin 1-activated human vascular smooth muscle cells secrete copiousinterleukin 6.J Clin Invest 1990 ；85 :731-738 ；Dinarello CA. Biologic basis forinterleukin-1 in disease. Blood 1996;87:2095-2147)。在脂質(zhì)及促發(fā)炎因子的剌激下動脈平滑肌細(xì)胞將會迀移和增殖，導(dǎo)致動脈硬化的發(fā)展(Schwartz SM. Smooth musclemigration in atherosclerosis and restenosis. J Clin Investl997 ；100 :S87-89 ；RossR. Atherosclerosis-an inflammatory disease. N Engl J Med 1999;340:115-126)。動脈血管主要組成是由外膜與掌控血管舒張、收縮之平滑肌層中膜，以及內(nèi)皮細(xì)胞層內(nèi)膜所構(gòu)成。動脈硬化是一種脂質(zhì)與發(fā)炎細(xì)胞聚積，并伴隨著血管平滑肌細(xì)胞增生與細(xì)胞外間質(zhì)液分泌所引起的血管內(nèi)膜纖維化變性，導(dǎo)致動脈管壁增厚且失去彈性，造成脈管腔狹小，最后導(dǎo)致中風(fēng)、心肌梗塞或外圍血管阻塞等疾病。臺灣衛(wèi)生署所發(fā)布國人的十大死因之中，由心血管病變所造成的疾病，如心臟疾病、腦血管疾病、高血壓性心臟病，分別位列第二、三、十名，所以如何預(yù)防治療心血管疾病，已成為當(dāng)務(wù)之急。
動脈硬化發(fā)生的期間，血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)會從正常生理狀態(tài)轉(zhuǎn)換成一種合j^iim (synthetic dedifferentiated phenotype), MiSj^^f ^il^^gE^ (plaque)形成。值得注意的是血管平滑肌細(xì)胞會從中層遷移到內(nèi)膜層，隨后增殖，導(dǎo)致動脈硬化斑塊的形成。許多研究已證實(shí)各種生長因子和細(xì)胞激素(cytokine)在動脈硬化的起始和進(jìn)展上扮演著重要的角色。此外，愈來愈多的證據(jù)證實(shí)細(xì)胞激素IL-I β及TNF-α?xí){(diào)節(jié)動脈硬化的病理過程，并在血管平滑肌細(xì)胞中刺激IL-6及IL-8的產(chǎn)生。此外，目前在表觀遺傳學(xué)(Epigenetic)的研究中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞DNA的甲基化修飾會參與調(diào)控基因的表達(dá)，當(dāng)基因的啟動子(promoter)位置上的CpG島(CpG island)呈現(xiàn)高度甲基化時(shí)，則基因的表達(dá)受到抑制。在癌癥細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)基因體DNA有全面去甲基化的現(xiàn)象(Park IY,Sohn BH,Choo J,Joe CO,Seong JK,Lee YI,Chung JH. Deregulation of DNAmethyltransferases and loss of parental methylation at the insulin-like growthfactor II(Igf2)/H19 loci in p53 knockout mice prior to tumor development.J. Cell. Biochem. 2005 ；94 :585-596)，同時(shí)此去甲基化現(xiàn)象也跟細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與腫瘤發(fā)生有相關(guān)。在動脈硬化斑塊、載脂蛋白-E基因敲除鼠動脈硬化中發(fā)現(xiàn)，平滑肌細(xì)胞的基因體DNA甲基化表達(dá)量呈現(xiàn)下降的趨勢，并導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞增生，促進(jìn)動脈硬化病變的進(jìn)展(DNAMethylation, Smooth Muscle Cells, and Atherogenesis. Hiltunen M0, Yla -HerttualaS. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003;23 :1750-1753)。在治療動脈硬化所造成的相關(guān)病癥應(yīng)用藥物上，HMG-CoA還原酶抑制劑(簡稱statin)是目前臨床最常使用且最有效的降血脂藥物，通過抑制肝臟的膽固醇合成及增加肝臟細(xì)胞低密度脂蛋白(Low Density Lipoproteins，LDL)接受器數(shù)量與活性，有效的降低總膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇。目前常見的市售Matin的商品名有LipitoH立普妥)、Mevacor (美乏脂)、Mevalotin (美百樂鎮(zhèn))、Lescol (益脂可)、Zocor (素果)、Crestor (冠脂妥)。三黃瀉心湯是一種傳統(tǒng)中藥配方，含有三種成份黃連的根莖(rhizomes ofCoptis chinesisFranch ;CR)、黃苳的根(roots of Scutellaria baicalensis Georgi ；SR)、及大黃的根莖(rhizomes of Rheum officinale BAILL ;RR)。傳統(tǒng)上，三黃瀉心湯可用于治療胃腸道發(fā)炎性疾病(Lin WC,Tan Tff. The role of gastric muscle relaxation incytoprotection induced bysan-huang-xie-xin-tang in rats. J Ethnopharmaco1 1994 ；44 :171-179 ；Saegusa Y,Sugiyama A,Takahara A,Nagasawa Y,Hashimoto K. Relationshipbetween phosphodiesterase inhibition induced by several kampo medicines andsmooth muscle relaxation of gastrointestinal tract tissues of rats. J PharmacolSci 2003;93:62-68)。最近在體外和體內(nèi)的研究報(bào)導(dǎo)三黃瀉心湯的的生物活性包括抗氧化作用(Iijima OT, Takeda H，Matsumiya T. Effects of san ‘ o-shashin-to on theantioxidative mechanism in spontaneous familial hypercholesterolaemic rabbits.Pharmacol Res2000 ；41 :137-141)、抗發(fā)炎作用(Lo YC，Lin YL, Yu KL, Lai YH，Wu YC，Ann LM, Chen IJ. San-huang-xie-xin-tang attenuates inflammatory responses inlipopolysaccharide-exposed rat lungs. J Ethnopharmaco12005 ；101 :68-74 ；Lo YC,Tsai PL，Huang YB, Shen KP, Tsai YH, Wu YC, Lai YH, Chen IJ.San-huang-xie-xin-tangreduces lipopoIysaccharides—induced hypotension and inflammatory mediators.J Ethnopharmacol 2005 ；96 :99-106 ；Shih YT，Wu DC, Liu CM，Yang YC，Chen IJ，LoYC. San-huang-xie-xin-tang inhibits helicobacter pylori-induced inflammation inhuman gastric epithelial ags cells. J Ethnopharmacol 2007 ;112 :537-544)、抗高血壓作用(Tsai HH, Chen IJ，Lo YC. Effects of san-huang-xie-xin-tang on u46619_inducedincrease in pulmonary arterial blood pressure. J Ethnopharmacol 2008 ； 117 457-462 ;Chen HC，Hsieh MT，Tsai HY，Chang HH，Wang TF，Shibuya T. Studies on the“San-huang-hsieh-hsin_tang〃 In the treatment of essential hypertension. TaiwanYi Xue Hui Za Zhi 1984 ；83 :340-346 ；Chen HC, Hsieh MT. Two-year experience with〃 San-huang-hsieh~hsin-tang“ In essential hypertension. Am J Chin Med 1986 ；14 :51-58)和神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)(Shih YT, Chen IJ，Wu YC, Lo YC. San-huang-xie-xin-tangprotects against activated microglia-and 6-ohda-induced toxicity in neuronalsh-sy5y cells.Evid Based Complement Alternat Med 2009 ；doi 10. 1093/ecam/nep1025)。通過這些保護(hù)作用可推測三黃瀉心湯是通過抑制細(xì)胞激素/趨化激素來降低發(fā)炎反應(yīng)。雖然有上述對三黃瀉心湯抗發(fā)炎效果的發(fā)現(xiàn)，但目前仍未有人去探討三黃瀉心湯的抗動脈硬化效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明研究三黃瀉心湯對于血管平滑肌細(xì)胞的抗動脈硬化影響。使用內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，簡稱LPQ誘導(dǎo)動脈硬化的改變，內(nèi)毒素為一種脂多糖，是來自革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的毒性化學(xué)物質(zhì)。其為一種強(qiáng)大的細(xì)菌毒力因子，可誘導(dǎo)發(fā)炎反應(yīng)。已知該發(fā)炎是動脈硬化的一個(gè)主要危險(xiǎn)因素。先前研究指出LPS可引發(fā)幾種主要的促發(fā)炎因子，造成血管發(fā)炎和動脈硬化(Dinarello CA. Biologic basis for interleukin-lindisease. Blood 1996 ；87 :2095-2147)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)三黃瀉心湯可抑制人類主動脈平滑肌細(xì)胞(HASMC)的增殖和遷移。本發(fā)明也證實(shí)三黃瀉心湯的抗動脈硬化效果也可通過減少血管平滑肌細(xì)胞中活性氧(ROS)、減少促發(fā)炎細(xì)胞激素/趨化激素(包括IL-I β、IL-6、IL-8及MCP-1)及調(diào)降C0X-2。除此之外，三黃瀉心湯降低LPS處理后HASMC中磷酸化ERK 1/2的量，其也有助于減少動脈硬化的進(jìn)行。本發(fā)明也證實(shí)三黃瀉心湯可抑制平滑肌細(xì)胞基因體DNA去甲基化現(xiàn)象的發(fā)生。因此本發(fā)明發(fā)現(xiàn)三黃瀉心湯可應(yīng)用于治療動脈硬化及心血管疾病上。細(xì)胞激素IL-I β可介導(dǎo)動脈硬化的病理進(jìn)程，并在人類血管平滑肌細(xì)胞中促成內(nèi)生性 IL-6 及 IL-8 的產(chǎn)生(Wang JM, Sica A, Peri G, Walter S, Padura IM, Libby P,Ceska Μ, Lindley I, Colotta F, Mantovani A. Expression of monocyte chemotacticprotein and interleukin-8 bycytokine-activated human vascular smooth musclecells. Arterioscler Thromb 1991 ；11:1166-1174 ；Loppnow H, Libby P.Proliferatingor interleukin 1-activated human vascular smooth17muscIe cells secrete copiousinterleukin 6. J Clin Invest 1990 ；85 :731-738.)。IL-6 及 IL-8 可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞中 DNA 的合成然后造成細(xì)胞增殖(Ikeda U, Ikeda M, Oohara T, Oguchi A, Kamitani T,Tsuruya Y,Kano S. Interleukin 6stimulates growth of vascular smooth muscle cellsin a pdgf-dependent manner. Am J Physiol 191991 ；260 :H1713-1717 ；Selzman CH,Shames BD,Reznikov LL,Miller SA,Meng X,Barton HA,Werman A,Harken AH,DinarelloCA, Banerjee A. Liposomal delivery of purified inhibitory- Kba inhibits tumornecrosis factor-a -induced human vascular smooth muscle proliferation. CircResl999 ;84 :867-875 ；Yue TL,Wang X，Sung CP,Olson B,McKenna PJ,Gu JL,FeuersteinGZ. Interleukin-8. A mitogen and chemoattractant for vascular smooth musclecells. Circ Res 1994;75:1-7)。MCP-I可召集單核球進(jìn)入動脈硬化病變的血管。血液中的MCP-I也可作為評估動脈硬化狀態(tài)和冠狀動脈疾病的生物標(biāo)記(Ikeda U，Matsui K，Murakami Y，ShimadaK. Monocyte chemoattractant protein—l andcoronary artery disease. Clin Cardiol2002；25 :143-147)。C0X-2為一發(fā)炎標(biāo)記，且已被認(rèn)為是一個(gè)動脈硬化的危險(xiǎn)因素(HanssonGK. Inflammation,atherosclerosis, and coronary artery disease. N Engl J Med2005 ；352 :1685-1695)。ROS是有氧代謝所產(chǎn)生的有毒副產(chǎn)物，但也可在血管細(xì)胞內(nèi)作為細(xì)胞內(nèi)訊息傳遞分子(Irani K. Oxidant signaling in vascular cell growth, death, and survival :Areview of theroles of reactive oxygen species in smooth muscle and endothelialcell mitogenic andapoptotic signaling. Circ Res 2000;87:179-183)。在血管平滑肌細(xì)胞中，ROS可影響不同的信息路徑，包括ERK1/2、NF-κ B、Akt等等，這些均與各種細(xì)胞表型，像是細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋零有所關(guān)聯(lián)(Irani K. Oxidant signaling in vascularcell growth,death,and survival :A review of theroles of reactive oxygen speciesin smooth muscle and endothelial cell mitogenic andapoptotic signaling. CircRes 2000 ；87 :179-183 ；Gupta K, Kshirsagar S, Li W, Gui L, Ramakrishnan S, Gupta P,Law PY, Hebbel RP. Vegf prevents apoptosis of human microvascular endothelialcells via opposing effects onmapk/erk and sapk/jnk signaling. Exp Cell Res1999 ；247 :495-504 ；Sundaresan Μ, Yu ZX, Ferrans VJ, Irani K, Finkel Τ. Requirementfor generation of h2o2for platelet-derived growth factor signal transduction.Science 1995 ；270 :296-299)。本發(fā)明所使用的詞語“一”或“一種”，其可意指“一個(gè)”，但其亦與“一或多個(gè)”、“至少一個(gè)”及“一個(gè)或一個(gè)以上”的含義一致。本發(fā)明所使用的詞語“或”用以意指“及/或”。因此，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防或治療動脈硬化引起的疾病的組合物，以及該組合物在制備用于預(yù)防或治療動脈硬化引起的疾病的藥物的用途，其中該組合物包含大黃、黃芩及黃連，其中大黃黃芩黃連的比例以干藥材的重量計(jì)約為1-3 0.5-1.5 0.5-1.5。在本發(fā)明實(shí)施例中，大黃黃芩黃連的比例以干藥材的重量計(jì)約為2 1 1。較佳的大黃為掌葉大黃(Mieum palmatum L)、唐古特大黃O^heumtanguticum Maxim.)或藥用大黃(Rheum officinale Baill.)的干燥根莖。較佳的黃芩為黃苳(Scutellaria baicalensis Georgi)、粘毛黃苳(Scutellaria viscidula Bge.)或西南黃芩(Scutellaria amoena C. H. Wright)的干燥根。較佳的黃連為味連(Coptischinensis Franch.)、雅連(Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao)、云連(Coptis teetaWall.)或臺灣黃連(Coptis quinquefolia Miq.)的干燥根莖。在較佳實(shí)施例中，大黃、黃芩及黃連為萃取物形式，更佳為水萃取物形式。在較佳實(shí)施例中，動脈硬化引起的疾病包括但不限于動脈硬化、心肌梗塞、中風(fēng)、或外圍血管阻塞。在較佳實(shí)施例中，本發(fā)明提供的組合物可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移。在另一較佳實(shí)施例中，本發(fā)明提供的組合物可抑制血管平滑肌細(xì)胞中活性氧(ROS)及細(xì)胞激素IL-I β、IL-6、IL-8與MCP-I的生成。在另一較佳實(shí)施例中，本發(fā)明提供的組合物可抑制血管平滑肌細(xì)胞中ERK 1/2的活化。在另一較佳實(shí)施例中，本發(fā)明提供的組合物可抑制血管平滑肌細(xì)胞基因體DNA去甲基化。


圖1顯示由MTT試驗(yàn)方法檢測三黃瀉心湯對于LPS誘導(dǎo)的HASMC增殖的抑制效果。細(xì)胞暴露于LPS(IOOngAil)并以三黃瀉心湯(0. 2-0. 6mg/ml)處理(或無三黃瀉心湯的處理)并培養(yǎng)24小時(shí)。#p < 0. 01相對于控制組/p <0.01相對于LPS組，使用曼-惠特尼U檢定計(jì)算ρ值。平均值和SD來自三重復(fù)實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)三次。圖2顯示刮傷傷口修復(fù)分析試驗(yàn)中三黃瀉心湯對于LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移的抑制效果。代表性的圖片顯示三黃瀉心湯(0.2mg/ml)和辛維司汀(InM)在LPS(lOOng/ml)處理后的第0小時(shí)(上圖)或第M小時(shí)(下圖)對HASMC遷移的效果。LPS處理后細(xì)胞遷移增加，但LPS的效果會被辛維司汀和三黃瀉心湯減弱。白線表示遷移細(xì)胞的前緣。圖3顯示LPS在HASMC中刺激活性氧(ROS)的產(chǎn)生。通過DCF熒光強(qiáng)度測定細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生。HASMC暴露于LPS (lOOng/ml) M小時(shí)后，ROS的生產(chǎn)顯著增加。三黃瀉心湯(0. 2-0. 6mg/ml)顯著地減少LPS誘導(dǎo)的ROS形成量并具有劑量依賴性(趨勢檢定ρ =0. 0036)。#ρ < 0. 01相對于控制組/p < 0.01相對于LPS組，使用曼-惠特尼U檢定計(jì)算P值。平均值和SD來自三重復(fù)實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)三次。圖4A-4B顯示LPS誘導(dǎo)的HASMC中經(jīng)三黃瀉心湯及辛維司汀處理后C0X_2mRNA和蛋白的數(shù)量。圖4A表示將C0X-2mRNA標(biāo)準(zhǔn)化至管家基因GAPDH。圖4B表示C0X-2蛋白表達(dá)分析，以針對C0X-2的特異性抗體在4°C下反應(yīng)整夜，使條帶可見。#p < 0. 05相對于控制組/P < 0. 05相對于LPS組，使用曼-惠特尼U檢定計(jì)算ρ值。平均值和SD來自三重復(fù)實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)三次。圖5顯示HASMC中三黃瀉心湯抑制LPS誘導(dǎo)的ERK 活化。以三黃瀉心湯(0. 2mg/ml)及辛維司汀處理HASMC。使用蛋白質(zhì)印跡法，以特異性抗體分析所有細(xì)胞裂解液中磷酸化的ERK 1/2及全部ERK 1/2。以密度測定法(densitometry)量化每個(gè)蛋白條帶。#p < 0. 01相對于控制組Zp < 0. 05、**p < 0. 001相對于LPS組，使用曼-惠特尼U檢定計(jì)算P值。平均值和SD來自三重復(fù)實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)三次。圖6A-6B顯示經(jīng)三黃瀉心湯處理后，HASMC中LPS誘導(dǎo)的DNA去甲基化有減少的趨勢，且三黃瀉心湯抑制DNA去甲基化的效果，無論在M小時(shí)(圖6A)或48小時(shí)(圖6B)對基因體DNA去甲基化的表達(dá)會隨著三黃瀉心湯的劑量增加。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明可能以不同的形式來實(shí)施，并不僅限于下列文中所提及的實(shí)施例。下列實(shí)施例僅作為本發(fā)明不同面向及特點(diǎn)中的代表。實(shí)施例1材料及方法1.三黃瀉心湯的制備以下實(shí)驗(yàn)所使用的三黃瀉心湯是由臺灣莊松榮制藥廠所制造。將大黃的根莖、黃芩的根及黃連的根莖的生藥粉末秤重2 1 1的比率(360. Og 180. Og 180. Og)。每種藥材都加入10倍體積的水并煮沸。萃取完成后，將其過濾以產(chǎn)出三種萃取溶液。將三種熱溶液結(jié)合并接著濃縮到只剩下當(dāng)初加入三種藥材的全部水體積的1/20。將新形成的濃縮溶液噴霧干燥，得出200. 2g的萃取物干粉末。原料和授權(quán)產(chǎn)品的生產(chǎn)及質(zhì)量控制均依照中華藥典及指導(dǎo)守則進(jìn)行檢驗(yàn)。2.人類主動脈平滑肌細(xì)胞(HAMSC)的培養(yǎng)及處理人類主動脈平滑肌細(xì)胞購自Cascade Biologies (OR, USA)，為凍存的第三代培養(yǎng)細(xì)胞。將其培養(yǎng)于含有平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基(Medium 231，Cascade Biologies, Inc.，OR,USA)的培養(yǎng)瓶中使其生長。平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基由胎牛血清(FBS，5%)、人類表皮生長因子(lOng/ml)、人類堿性纖維母細(xì)胞生長因(3ng/ml)、胰島素(10mg/ml)、青霉素(100單位/ml)、鏈霉素(100pg/ml)及抗真菌劑(Fungizone (1. 25mg/ml))所組成。細(xì)胞培養(yǎng)在37°C、潮濕的5%0)2大氣中。當(dāng)細(xì)胞聚集約70-80%時(shí)進(jìn)行HAMSC的繼代培養(yǎng)。使用繼代培養(yǎng)第4-9代的HAMSC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用內(nèi)毒素(LPQ在HAMSC中引發(fā)動脈硬化的改變。在經(jīng)LPS處理之前，先將細(xì)胞培養(yǎng)在不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中M小時(shí)。接著在LPS(100ng/ml)的存在下將細(xì)胞在37°C培養(yǎng)M小時(shí)。此外，使用一種被廣泛用來降低膽固醇的Matin “辛維司汀(Simvastatin) ”(InM)作為正控制藥物，以比較在HAMSC中三黃瀉心湯的抗動脈硬化效果。3.動脈硬化評估之一 =HAMSC的增殖分析試驗(yàn)為了測量LPS處理過后的細(xì)胞增殖，在HAMSC微孔盤的每個(gè)格子中加入0. 5mg/ml的MTT(Sigma-Aldrich)，并在37°C下培養(yǎng)2. 5小時(shí)，之后再將微孔盤于37°C、5% CO2下培養(yǎng)M小時(shí)。接著用分光光度計(jì)讀取微孔盤以測量染料對波長540nm及參考波長630nm的吸光度(Benchmark PLUS Microplate Spectrophotometer, Bio-Rad) 所有的實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行三次重復(fù)。吸光度表示線粒體的酶活性，即意味著細(xì)胞增殖。4.動脈硬化評估之二 =HAMSC的遷移分析試驗(yàn)遷移分析試驗(yàn)依據(jù)刮傷傷口修復(fù)分析試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。融合HAMSC的機(jī)械性損傷及損傷修復(fù)分析試驗(yàn)的進(jìn)行如其它文獻(xiàn)中所述(Ashton AW, Yokota R，John G，Zhao S,Suadicani SO, Spray DC, Ware JA. Inhibition ofendothelial cell migration,intercellular communication,and vascular tube formation bythromboxane a2. J BiolChem 1999 ；274 :35562-35570)。將HAMSC以每格1 X IO6細(xì)胞培養(yǎng)在6孔盤中形成融合單層。以200-μ g標(biāo)準(zhǔn)微量吸管管尖在單層細(xì)胞上劃出一道橫越格子的傷口。以磷酸鹽緩沖生理食鹽水(PBQ將受傷的單層細(xì)胞清洗兩次，并以補(bǔ)充有LPS的含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。在24小時(shí)的時(shí)間內(nèi)測量傷口閉合的速率并拍照。5.動脈硬化評估之三=HAMSC的活性氧(R0Q分析試驗(yàn)使用熒光分析試驗(yàn)，以2' ,7'-熒光素二醋酸酯O' ,7' -dichlorofluorescindiacetate (DCF-DA ；Sigma-Aldrich))測量內(nèi)生性的 ROS 數(shù)量。以 10 μ m 的 DCF-DA 在 37°C下培養(yǎng)細(xì)胞30分鐘以評估ROS介導(dǎo)的氧化(DCF-DA氧化成熒光化合物DCF)。通過分光光度計(jì)(Bio-Rad)，在激發(fā)波長485nm及發(fā)射波長525nm測量氧化的DCF所發(fā)出的熒光。6.對C0X-2作定量實(shí)時(shí)PCR使用定量實(shí)時(shí)PCR評估基因表達(dá)。使用Trizol試劑(Invitrogen)，根據(jù)制造商提供的操作流程從培養(yǎng)的細(xì)胞萃取其RNA。使用Nanc^hotometer 分光光度計(jì)(IMPLENGmbH, Munich, Germany)表達(dá)全部 RNA 的濃度和完整性。使用 High-Capacity cDNA ArchiveKit (Applied Biosystems)(大容量cDNA庫試劑盒)，根據(jù)制造商提供的操作流程從全部RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的TaqMan實(shí)時(shí)分析試驗(yàn)以檢測目標(biāo)基因的表達(dá)量。用于C0X-2的基因特異性PCR引物及TaqMan探針來自TaqMan ABI應(yīng)用基因分析試驗(yàn)(產(chǎn)品編號Hs00153133_ml ；Applied Biosystems)。PCR 使用 Applied Biosystems 7500 實(shí)時(shí) PCR 儀器。將基因表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化至管家基因(houseke印ing gene)磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)。7.對C0X-2及ERK 1/2進(jìn)行蛋白印記分析在100 μ 1的蛋白萃取試劑(Thermo)及蛋白酶抑制劑(Panomics)中將HAMSC均質(zhì)化。以Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo)測定蛋白濃度。將20yg的蛋白質(zhì)加入膠片孔中，以Novex Xcell-II裝置里的NuPAGE Novex Bis-Tris 4-12%迷你膠體電泳(Invitrogen)在IOOV下分離120分鐘，并以免疫印跡方式轉(zhuǎn)印至Immbilon-PVDF轉(zhuǎn)印膜上。在室溫下以5%脫脂牛奶阻塞非特異性的結(jié)合1小時(shí)。用針對C0X-2、全部ERK及p-ERK的特異性抗體在4°C下反應(yīng)整夜以使條帶可見。接著，將羊抗兔(用于p-ERK)或抗小鼠(用于C0X-2及全部ERK) 二級抗體結(jié)合至辣根過氧酶(horseradish peroxidase)，并曝光到醫(yī)用X射線膠片(Fuiifilm)以測定增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(Immobilon Western, Millipore) 8.對細(xì)胞激素/趨化激素作酵素免疫測定法實(shí)驗(yàn)前，使HASMC在6孔盤中生長至融合，并接著在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)M小時(shí)。將HASMC培養(yǎng)M小時(shí)并收集條件培養(yǎng)基的上清液，使用ELISA套組(BD Pharmingen )，根據(jù)制造商提供的操作流程測量IL-I β、IL-6、IL-8及MCP-I。9. HASMC DNA 甲基化測定利用4%三聚甲醛固定平滑肌細(xì)胞15分鐘后，以0. 05% PBST清洗并加入0. 2%Triton X-100反應(yīng)30分鐘。之后再以4N鹽酸溶液反應(yīng)10分鐘，0. 05% PBST清洗后加入2%牛血清白蛋白減少非專一性結(jié)合，再利用5-甲基胞嘧啶一級抗體及FITC二級抗體進(jìn)行免疫熒光染色，之后利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，即5-甲基胞嘧啶的表達(dá)量，以此分別計(jì)算細(xì)胞在M與48小時(shí)后基因體DNA甲基化變化程度。10.統(tǒng)計(jì)所有文中和圖中的值都以平均值士SD表示。以曼-惠特尼U檢定評估統(tǒng)計(jì)差異，在所有實(shí)驗(yàn)中，P值0. 05視為顯著。以SigmaPlot軟件完成數(shù)據(jù)分析及繪圖。結(jié)果1. LPS對HASMC增殖的影響(有/無三黃瀉心湯處理)
LPS (100ng/ml)刺激后M小時(shí)，會造成HASMC的增殖效應(yīng)為控制組的1. 5倍(圖1)。三黃瀉心湯可在LPS誘導(dǎo)的HASMC中顯著地減少細(xì)胞增殖的速度(ρ < 0. 01)。同時(shí)，正控制組辛維司汀(simvastatin)也在LPS誘導(dǎo)的HASMC中顯著地減少細(xì)胞增殖的速度(ρ< 0. 01)。2. HASMC遷移的抑制使用刮傷傷口修復(fù)分析試驗(yàn)，檢驗(yàn)是否三黃瀉心湯會減弱經(jīng)LPS處理的HASMC的運(yùn)動性。細(xì)胞遷移在LPS處理后的M小時(shí)顯著增加。而辛維司汀(InM)與三黃瀉心湯(0. 2mg/ml)會大幅度減少細(xì)胞遷移(圖2)。3.抑制LPS誘導(dǎo)的ROS的分析試驗(yàn)當(dāng)暴露至LPS，HASMC中的ROS會顯著地增加(圖3 ;p < 0. 01)。在以三黃瀉心湯(0. 2-0. 6mg/ml)處理后，可觀察到HASMC中LPS誘導(dǎo)的ROS顯著減少(ρ < 0. 01)，且三黃瀉心湯的效果對ROS的影響會隨著三黃瀉心湯的劑量增加而呈現(xiàn)對ROS的抑制增加(趨勢檢定 ρ = 0. 0036)。4.三黃瀉心湯處理后的C0X-2表達(dá)LPS (100ng/ml)刺激M小時(shí)后造成HASMC中的C0X_2mRNA數(shù)量增加6. 9倍。通過辛維司汀(InM)與三黃瀉心湯(0. 2mg/ml)處理，可顯著降低C0X_2mRNA的數(shù)量(圖4A ；P < 0. 01)。蛋白印跡法證實(shí)LPS可誘導(dǎo)C0X-2蛋白制造，但三黃瀉心湯(0. 2mg/ml)與辛維司汀(InM)會分別減低20% C0X-2蛋白質(zhì)制造量(ρ < 0. 05)(圖4Β)。5.三黃瀉心湯抑制HASMC中LPS誘導(dǎo)的ERK 1/2活化LPS刺激后M小時(shí)，p-ERK 1/2活化增加3倍(圖5 ;p < 0. 01)。三黃瀉心湯(0. 2mg/ml)顯著減少LPS誘導(dǎo)的p-ERK 1/2至原有的30% (ρ < 0. 01)。與三黃瀉心湯相比，辛維司汀反而(InM)刺激p-ERK 1/2活化使增加31% (ρ < 0. 05)。6.三黃瀉心湯抑制HASMC中LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞激素/趨化激素表達(dá)LPS刺激M小時(shí)后顯著增加IL-I β、IL-6、IL-8及MCP-1的表達(dá)(表1 ;ρ <0. 01)。三黃瀉心湯顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IL-I β、IL-6、IL-8及MCP-I表達(dá)(ρ < 0. 01)。辛維司汀也減少LPS處理后IL-I β、IL-6及MCP-I的表達(dá)程度，但會輕微增加IL-8的表達(dá)。表1 :LPS誘導(dǎo)的HASMC中，經(jīng)三黃瀉心湯處理后的IL-1 β、IL_6、IL-8及MCP-1的
表達(dá)程度
權(quán)利要求
1.一種組合物在制備用于預(yù)防或治療動脈硬化引起的疾病的藥物的用途，其中該組合物的成份包含大黃、黃芩及黃連，其中大黃黃芩黃連的比例以干藥材的重量計(jì)約為 1-3 0. 5-1. 5 0. 5-1. 5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，大黃黃芩黃連的比例以干藥材的重量計(jì)約為2 1 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，黃芩為黃芩(Scutellariabaicalensis Georgi)、粘毛黃苳(Scutellaria viscidula Bge.)或西南黃苳(Scutellaria amoena C. H. Wright)的干燥根。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，黃連為味連(Coptischinensis Franch.)、雅連(Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao)、云連(Coptis teeta Wall.)或臺灣黃連(Coptis quinquefolia Miq.)的干燥根莖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，大黃為掌葉大黃(Mieumpalmatum L.)、 唐古特大黃(Rheum tanguticum Maxim.)或藥用大黃(Rheum officinale Baill.)的干燥根莖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，該疾病為動脈硬化、心肌梗塞、中風(fēng)、或外圍血管阻塞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，該組合物抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，該組合物抑制血管平滑肌細(xì)胞中活性氧及細(xì)胞激素IL-I β、IL-6、IL-8與MCP-I的生成。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，該組合物抑制血管平滑肌細(xì)胞中ERK1/2 的活化。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，該組合物抑制血管平滑肌細(xì)胞基因體 DNA去甲基化。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于預(yù)防或治療動脈硬化引起的疾病的組合物，包含大黃、黃芩及黃連，其中大黃∶黃芩∶黃連的比例以干藥材的重量計(jì)約為1-3∶0.5-1.5∶0.5-1.5。
文檔編號A61K36/718GK102379935SQ20101027508
公開日2012年3月21日 申請日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者卓夙航, 王永松, 鄭欣蕓 申請人:高雄醫(yī)學(xué)大學(xué)