專利名稱：一種利用發(fā)酵牛膽汁制備復(fù)合膽紅素鈣的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種中藥原料藥的中間體的制造方法，尤其涉及一種利用發(fā)酵牛膽汁制備復(fù)合膽紅素鈣的方法。
背景技術(shù)：
牛黃即牛膽結(jié)石，天然牛膽結(jié)石的形成是多種因素共同作用的結(jié)果，首先要有形成牛黃的適宜條件，其次要有形成牛黃的物質(zhì)基礎(chǔ)。當(dāng)膽汁受到細(xì)菌感染時(shí)一方面使膽汁 PH下降，酸性環(huán)境引起膽汁中蛋白質(zhì)的沉降，另一方面它利用膽汁中的蛋白質(zhì)、碳水化合物等大分子物質(zhì)，結(jié)果導(dǎo)致膽汁的粘度下降。若膽汁粘度高，新形成的牛黃小顆粒在膽汁中懸浮，不易沉降和粘附。低粘度的膽汁，牛黃小顆粒易發(fā)生沉淀、附著和聚集，并形成大的牛黃塊，大的牛黃塊不易因膽汁的流動(dòng)而丟失。細(xì)菌還能降解膽酸，膽酸對(duì)游離膽紅素有助溶作用，其本身還能與鈣等金屬離子結(jié)合，抑制膽紅素鈣鹽的形成。細(xì)菌產(chǎn)生的粘液也參與了牛黃的形成。其次細(xì)菌產(chǎn)生的β —葡萄糖醛酸苷酶能將膽汁中的結(jié)合膽紅素轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x膽紅素，后者能與鈣等金屬離子形成膽紅素鈣鹽，其進(jìn)一步與蛋白一多糖復(fù)合物形成牛黃小顆粒。牛黃小顆粒在蛋白質(zhì)沉降形成的核心上沉集，并逐層增大。通過(guò)對(duì)具有藥用價(jià)值的牛結(jié)石上的沉集層進(jìn)行分析，通過(guò)生物、化學(xué)的方法可以得到與天然結(jié)石沉集層上成份一致的物質(zhì)即復(fù)合膽紅素鈣鹽(牛黃小顆粒)，
復(fù)合膽紅素鈣為體外培育牛黃的主要組成成份，復(fù)合膽紅素鈣的收率和生產(chǎn)效率直接影響體外培育牛黃的生產(chǎn)成本。武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院肝膽外科蔡紅嬌醫(yī)師1989年申報(bào)了“一種人工體外制作牛膽結(jié)石的方法”的發(fā)明專利(ZL89100505. 6)，2000年，由武漢大鵬藥業(yè)有限公司組織科研人員在ZL89100505. 6發(fā)明專利的基礎(chǔ)上，根據(jù)1990年版《中國(guó)藥典》要求，研制了一種新的在牛體外制備牛膽結(jié)石(即體外培育牛黃)的方法(ZL01133550.5)。該方法既適應(yīng)規(guī)模化生產(chǎn)要求，生產(chǎn)出的產(chǎn)品又能滿足新的《中國(guó)藥典》要求。該專利中復(fù)合膽紅素鈣的生產(chǎn)方法是取出定量的發(fā)酵膽汁，加入廣4倍量澄清飽和鈣溶液，對(duì)其進(jìn)行攪拌、加熱至沸騰，濾取棕紅色沉淀物；在棕紅色沉淀物中，加入適量的水進(jìn)行攪拌、洗滌，靜置后濾去上清液，再依據(jù)藥用要求加入適量的膽紅素、膽酸、去氧膽酸和無(wú)機(jī)鹽后，攪拌混勻，干燥在生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，按上述技術(shù)，加熱至沸騰的過(guò)程部分游離的膽紅素被氧化，導(dǎo)致與鈣及蛋白質(zhì)等生物活物質(zhì)結(jié)合的膽紅素減少，影響復(fù)合膽紅素鈣的收率。并且干燥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，干燥時(shí)易結(jié)塊，導(dǎo)致受熱不均勻，對(duì)后續(xù)粉碎帶來(lái)不利影響。隨著生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，提高復(fù)合膽紅素鈣鹽的收率及干燥效率將會(huì)為企業(yè)帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是在ZL01133550. 5發(fā)明專利的基礎(chǔ)上，而研發(fā)的一種新的利用發(fā)酵牛膽汁制備復(fù)合膽紅素鈣的方法。使用該方法，可以提高復(fù)合膽紅素鈣鹽的收率及干燥效率，從而降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。本發(fā)明所提供的利用發(fā)酵牛膽汁制備復(fù)合膽紅素鈣的方法，具體方案是
(1)取100(T4000ml純化水加入2(T40g氧化鈣，攪拌，即得飽和氧化鈣溶液；
(2)取出定量的發(fā)酵牛膽汁，每IOOOml加入100(T4000ml飽和氧化鈣溶液以及5 15g 焦亞硫酸鈉，對(duì)其進(jìn)行攪拌、加熱至沸騰，濾取棕紅色沉淀物；
(3)在棕紅色沉淀物中，加入適量的水進(jìn)行攪拌、洗滌，靜置后濾去上清液，以除去水溶性雜質(zhì)，再向沉淀中加入總重量35飛5%的膽紅素、5 15%的膽酸、2. 5 7. 5%的去氧膽酸、 0. 3 0. 6%的硫酸鋅、0. 3 0. 6%的硫酸鎂后，攪拌混勻；
(4)冷凍后低溫真空干燥除水。發(fā)酵牛膽汁按照本領(lǐng)域通常方法制備，一般包括如下步驟
(1)調(diào)節(jié)天然牛膽汁中的?；撬岷?，使其達(dá)到藥用要求39Γ7%，
(2)將大腸桿菌、變形桿菌或腸球菌的單一菌液或其組合菌液接種到牛膽汁中，進(jìn)行發(fā)酵處理。在向發(fā)酵牛膽汁中，加入澄清飽和氧化鈣溶液的同時(shí)加入焦亞硫酸鈉，當(dāng)升溫到沸騰的過(guò)程中抗氧劑首先被氧化，對(duì)膽紅素起到了有效的保護(hù)作用，防止了其被氧化。在低溫條件下，水以晶體形式存在于復(fù)合膽紅素鈣中，當(dāng)在低溫、低真空度的條件下干燥時(shí)，水在短時(shí)間內(nèi)由晶體狀態(tài)直接變?yōu)闅鈶B(tài)而揮發(fā)，在復(fù)合膽紅素鈣中留下空隙，使其變的疏松而易于處理。其次在低溫條件下，有效的保護(hù)了蛋白一多糖復(fù)合物等生物活性物質(zhì)的藥理活性。


圖1利用發(fā)酵牛膽汁制備復(fù)合膽紅素鈣的操作流程圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
(1)取出新鮮牛膽汁，按優(yōu)質(zhì)牛黃的要求，調(diào)節(jié)?；撬岷渴蛊溥_(dá)到7%(g/ml)，置于消毒罐內(nèi)，低溫保存?zhèn)溆谩?2)將牛膽汁置于發(fā)酵罐，按每10000ml牛膽汁接種IOOml菌體溶液的比例，將大腸桿菌和變形桿菌的組合菌液接種至牛膽汁中，發(fā)酵80小時(shí)，即得發(fā)酵牛膽汁。(3)取發(fā)酵牛膽汁10000ml加入11000ml澄清飽和氧化鈣溶液及5g焦亞硫酸鈉， 攪拌、煮沸，冷卻后取出棕紅色沉淀物。(4)棕紅色沉淀物加純化水10000 ml，充分?jǐn)嚢?，靜置后傾去上清液，每569g沉淀 (干重)加入膽紅素350g，再加入膽酸50g、去氧膽酸25g、硫酸鋅3g、硫酸鎂3g，攪拌、混勻。(5)放入低溫冷凍箱中，-10°C冷凍16小時(shí)，之后轉(zhuǎn)入真空干燥箱中，抽真空到 0. 085Mpa，40°C干燥48小時(shí)，即得復(fù)合膽紅素鈣。實(shí)施例2
(1)殺牛時(shí)，在無(wú)菌操作重要條件下，摘取膽囊，先用無(wú)雜質(zhì)、未受污染、金黃色者，傾出膽汁于消毒罐內(nèi)，按優(yōu)質(zhì)牛黃的要求，調(diào)節(jié)牛磺酸含量使其達(dá)到6%(g/ml)，低溫保存?zhèn)溆谩?2)將牛膽汁置于發(fā)酵罐，按每10000ml牛膽汁接種200ml菌體溶液的比例，將大腸桿菌接種至牛膽汁中，發(fā)酵96小時(shí)，即得發(fā)酵牛膽汁。(3)取發(fā)酵牛膽汁10000ml加入30000ml澄清飽和氧化鈣溶液及IOg焦亞硫酸鈉，
攪拌、煮沸，冷卻后取出棕紅色沉淀物。(4)棕紅色沉淀物加純化水10000 ml，充分?jǐn)嚢?，靜置后傾去上清液，每390g 沉淀(干重)加入膽紅素450g，再加入膽酸100g、去氧膽酸50g、硫酸鋅5g、硫酸鎂5g，攪拌、 混勻，備用。(5)放入低溫冷凍箱中，-8°C冷凍20小時(shí)，之后轉(zhuǎn)入真空干燥箱中，抽真空到 0. 085Mpa，50°C干燥36小時(shí)，即得復(fù)合膽紅素鈣。實(shí)施例3
(1)取出新鮮牛膽汁，置于消毒罐內(nèi)，低溫保存?zhèn)溆谩?2)將牛膽汁置于發(fā)酵罐，按每10000ml牛膽汁接種300ml菌體溶液的比例，將腸球菌接種至牛膽汁中，發(fā)酵92小時(shí)，即得發(fā)酵牛膽汁。(3)取發(fā)酵牛膽汁10000ml加入40000ml澄清飽和氧化鈣溶液及15g焦亞硫酸鈉， 攪拌、煮沸，冷卻后取出棕紅色沉淀物。(4)棕紅色沉淀物加純化水10000 ml，充分?jǐn)嚢瑁o置后傾去上清液，每213g 沉淀(干重)加入膽紅素550g，再加入膽酸150g、去氧膽酸75g、硫酸鋅6g、硫酸鎂6g，攪拌、 混勻，備用。(5)放入低溫冷凍箱中，-5°C冷凍M小時(shí)，之后轉(zhuǎn)入真空干燥箱中，抽真空到 0. 085Mpa，60°C干燥M小時(shí)，即得復(fù)合膽紅素鈣。
權(quán)利要求
1.一種利用發(fā)酵牛膽汁制備復(fù)合膽紅素鈣的方法，其特征是(1)取100(T4000ml純化水加入2(T40g氧化鈣，攪拌，即得飽和氧化鈣溶液；(2)取出定量的發(fā)酵牛膽汁，每IOOOml加入100(T4000ml飽和氧化鈣溶液以及5 15g 焦亞硫酸鈉，對(duì)其進(jìn)行攪拌、加熱至沸騰，濾取棕紅色沉淀物；(3)在棕紅色沉淀物中，加入適量的水進(jìn)行攪拌、洗滌，靜置后濾去上清液，以除去水溶性雜質(zhì)，再向沉淀中加入總重量35飛5%的膽紅素、5 15%的膽酸、2. 5 7. 5%的去氧膽酸、 0. 3 0. 6%的硫酸鋅、0. 3 0. 6%的硫酸鎂后，攪拌混勻；(4)冷凍后低溫真空干燥除水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述冰凍后低溫干燥過(guò)程為將配好的復(fù)合膽紅素鈣放入低溫冷凍箱中，一 5°C至一 10°C冷凍20分鐘，之后轉(zhuǎn)入真空干燥箱中，抽真空到0. 085Mpa，干燥M小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是，所述發(fā)酵牛膽汁的制備包括如下步驟(1)調(diào)節(jié)天然牛膽汁中的牛磺酸含量，使其達(dá)到藥用要求，(2)將大腸桿菌、變形桿菌或腸球菌的單一菌液或其組合菌液接種到牛膽汁中，進(jìn)行發(fā)酵處理。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用發(fā)酵牛膽汁制備復(fù)合膽紅素鈣的方法。取定量的發(fā)酵牛膽汁，每1000ml加入1000~4000ml飽和氧化鈣溶液以及5~15g焦亞硫酸鈉，對(duì)其進(jìn)行攪拌、加熱至沸騰，濾取棕紅色沉淀物；在棕紅色沉淀物中，加入適量的水進(jìn)行攪拌、洗滌，靜置后濾去上清液，以除去水溶性雜質(zhì)，再向沉淀中加入總重量35~55%的膽紅素、5~15%的膽酸、2.5~7.5%的去氧膽酸、0.3~0.6%的硫酸鋅、0.3~0.6%的硫酸鎂后，攪拌混勻；冷凍后低溫真空干燥除水。使用該方法，可以提高復(fù)合膽紅素鈣鹽的收率及干燥效率，從而降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。
文檔編號(hào)A61K35/413GK102429926SQ20111043083
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者李幼鶴, 羅張龍, 蔡紅嬌 申請(qǐng)人:武漢健民大鵬藥業(yè)有限公司