專利名稱：一種口服蛋白類藥物的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及口服蛋白類藥物的制備方法，特別涉及改性殼聚糖作為藥物載體的口 服蛋白類藥物制備方法。
背景技術：
隨著DNA重組技術的發(fā)展，很多蛋白質、酶、多肽等生物活性分子成為商業(yè)藥品投 入臨床應用。雖然口服是蛋白質類藥物最方便、最易被病人接受的給藥方式，但是由于蛋白 質類藥物在消化道中極易酸變性及酶降解，另外蛋白質大分子藥物難以透過腸壁粘膜吸收 入血，所以目前蛋白質及多肽藥物仍主要通過注射方式給藥，即使這種給藥方式給病人帶 來痛苦且容易導致感染。近年來口服蛋白質類藥物載體成為藥劑學的研究熱點，PH敏感的 天然高分子水凝膠材料受到了極大的關注。
殼聚糖是商業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)的一種天然多糖，由于其高度的生物相容性、無毒、可 生物降解、腸粘膜粘附性及打開腸細胞緊密連接等性能，殼聚糖被廣泛用于制藥領域。殼聚 糖已被用來作為激素、蛋白質、酶和基因的載體。由于其表觀PKa = 5. 6，殼聚糖僅溶于酸性 環(huán)境中，這限制了它作為蛋白質類藥物口服載體的應用。
海藻酸鈉是海藻酸的一種可溶性鹽，可以在多價陽離子如鈣離子存在或在較低的 酸性環(huán)境下形成凝膠。由于海藻酸鈉凝膠易于制備，加它的多孔性、生物相容性及粘膜粘附 性等內(nèi)在屬性，海藻酸鈉衍生物被廣泛應用于醫(yī)藥領域。各種海藻酸鈉，殼聚糖復合物也已 被用來作為藥物靶向輸送和控釋的載體。
目前，國內(nèi)外只要是把殼聚糖和海藻酸鈉用乳化交聯(lián)等方法直接制備水凝膠，這 種方法所制備的水凝膠在酸性環(huán)境下容易崩解。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種在胃液環(huán)境下不溶脹而在小腸環(huán)境溶脹 的藥物制備方法。
本發(fā)明解決技術問題的技術方案為一種口服蛋白類藥物的制備方法，包括(a) Ν-α-戊二酸殼聚糖的合成步驟、(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備步驟；
所述的(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備步驟為
將重量濃度為0. 5-3 %的N- α -戊二酸殼聚糖溶液，用0. 5_2Μ的氫氧化鈉溶液 調節(jié)Ν-α -戊二酸殼聚糖溶液的ρΗ至0. 5-6. 5，再加入重量濃度為0. 5_3%的海藻酸鈉溶 液混勻，加入口服蛋白類藥物，滴入到重量濃度1.5-2%氯化鈣溶液中，滴加完畢后，攪拌 交聯(lián)0. 5-3h，過濾，洗滌，再浸入到重量濃度1. 5-2的％硫酸鈉溶液攪拌交聯(lián)0. 5-4h，過 濾、洗滌、室溫下干燥至恒重，海藻酸鈉、Ν-α-戊二酸殼聚糖、口服蛋白類藥物的質量比為 1 0. 3-0. 9 0. 5-1. 5。
所述的口服蛋白類藥物為胰島素、牛血清蛋白。
所述的(a) N-α-戊二酸殼聚糖的合成步驟
將殼聚糖溶于的1-2% (ν/ν)乙酸溶液中，再加入α-酮戊二酸，用0.5-2Μ氫氧 化鈉溶液調節(jié)上述溶液的PH值為3. 5-5. 5，室溫反應2-6小時，再加入硼氫化鈉，用0. I-IM 鹽酸溶液調節(jié)上述混合物的PH值為4. 5-7. 5，反應不小于M小時，加入90-95% (ν/ν)乙 醇終止反應，過濾，洗滌，干燥，即得到N- α -戊二酸殼聚糖，殼聚糖、α -酮戊二酸、硼氫化 鈉的質量比為1 1.5-3.5 0.3-1.5。
如圖1所示用α-酮戊二酸修飾殼聚糖，可以改善其水溶性，而殼聚糖具有高度 的生物相容性、無毒、可生物降解、腸粘膜粘附著性及打開腸細胞緊密連接等性能，海藻酸 鈉是海藻酸的一種可溶性鹽，可以在多價陽離子如鈣離子存在或在較低的酸性環(huán)境下形成 凝膠。當把兩者混勻之后，再雙重交聯(lián)可能夠得到酸性條件基本不溶脹，而在堿性條件下溶 脹性能。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，所制備的藥物載體，在酸性條件下不易崩解，并且藥物容 易被吸收。


圖1是N-α-戊二酸殼聚糖合成的化學原理圖。
圖2是海藻酸鈉/N- α -戊二酸殼聚糖凝膠珠、海藻酸鈉及Ν_ α -戊二酸殼聚糖的 紅外光譜。
圖3是模擬胃的ρΗ環(huán)境下凝膠珠(實施例1、2、3、4、5)的溶脹特性。
圖4是模擬小腸的ρΗ環(huán)境下凝膠珠(實施例1、2、3、4、5)的溶脹特性。
圖5是模擬結腸的ρΗ環(huán)境下凝膠珠(實施例1、2、3、4、5)的溶脹特性。
圖6是牛血清蛋白BSA的包載率。
圖7是凝膠珠中，BSA在模擬胃(pHl. 2)的緩沖液中累積釋放。
圖8是凝膠珠中，BSA在模擬小腸(pH6. 8)的緩沖液中累積釋放。
圖9是凝膠珠中，BSA在模擬結腸(pH7. 4)的緩沖液中累積釋放。
圖10是凝膠珠放入模擬胃(SGF)緩沖液中池，然后再放入模擬結腸(SCF)緩沖液 中4h，BSA累積釋放率。
具體實施方式
下面結合具體實施例對發(fā)明的技術方案作進一步說明。
實施例1
(a) N-α-戊二酸殼聚糖的合成
N-α-戊二酸殼聚糖的合成步驟將4. 5克的殼聚糖溶于IOOml的1 % (ν/ν)乙酸 溶液中，再加入7. 2克的α -酮戊二酸，用IM氫氧化鈉溶液調節(jié)溶液的ρΗ值為5，室溫攪拌 4小時，再加入2克硼氫化鈉，攪拌均勻后，用IM鹽酸溶液調節(jié)上述混合物的ρΗ值為6. 5， 攪拌反應M小時，加入體積比為95 %乙醇終止反應。過濾獲得N- α -戊二酸殼聚糖聚合 物，分別用乙醇和乙醚洗滌3至4次，于紅外線干燥器中干燥至恒重。
(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備
將重量濃度為2 %的N- α -戊二酸殼聚糖溶液30ml，用IM的氫氧化鈉溶液調節(jié) N- α -戊二酸殼聚糖溶液的ρΗ至5. 0，再加入重量濃度為2 %的海藻酸鈉溶液70ml混勻，滴4入到過量的重量濃度2%氯化鈣溶液中，滴加完畢后，攪拌交聯(lián)0. 5小時，過濾，用蒸餾水沖 洗3至4次除去凝膠珠表面未反應的氯化鈣，再浸入到過量的重量濃度2 %的硫酸鈉溶液攪 拌交聯(lián)lh，過濾，用蒸餾水反復沖洗3至4次，室溫下干燥至恒重。
海藻酸鈉/N-α -戊二酸殼聚糖凝膠珠、海藻酸鈉及N-α -戊二酸殼聚糖的紅外光 譜如圖2所示，比較三者的紅外光譜，實施例1所制的凝膠珠紅外光譜中波數(shù)1609cm—1處海 藻酸鈉羧基的不對稱震動吸收峰明顯減弱且向高波數(shù)移動(藍移)，另外波數(shù)1568CHT1處 殼聚糖氨基的特征性剪切震動吸收峰明顯減弱。
實施例2
除(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備中，
“將重量濃度為2%的N- α -戊二酸殼聚糖溶液10ml，用IM的氫氧化鈉溶液調節(jié) N- α -戊二酸殼聚糖溶液的ρΗ至4. 5，再加入重量濃度為2%的海藻酸鈉溶液90ml混勻，，，
夕卜，其余與實施例1相同。
實施例3
除(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備中，
“將重量濃度為2%的N- α -戊二酸殼聚糖溶液20ml，用IM的氫氧化鈉溶液調節(jié) N- α -戊二酸殼聚糖溶液的ρΗ至4. 8，再加入重量濃度為2%的海藻酸鈉溶液80ml混勻，”
夕卜，其余與實施例1相同。
實施例4
除(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備中，
“將重量濃度為2%的N- α -戊二酸殼聚糖溶液40ml，用IM的氫氧化鈉溶液調節(jié) N-α -戊二酸殼聚糖溶液的ρΗ至4. 5，再加入重量濃度為2%的海藻酸鈉溶液60ml混勻，，，
夕卜，其余與實施例1相同。
實施例5
除(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備中，
“將重量濃度為2%的N- α -戊二酸殼聚糖溶液50ml，用IM的氫氧化鈉溶液調節(jié) N- α -戊二酸殼聚糖溶液的ρΗ至4. 5，再加入重量濃度為2%的海藻酸鈉溶液50ml混勻，，，
夕卜，其余與實施例1相同。
實施例6
1.凝膠珠的溶脹測定
稱取一定量(Wtl)的干凝膠珠分別置于37°C緩慢振搖的緩沖溶液中，緩沖溶液分別 模擬胃、小腸及結腸的PH環(huán)境。在特定的時間間隔取出凝膠珠，用紙吸去凝膠珠表面多余 的水，在電子天平稱重(Wt)。實驗重復進行3次。凝膠珠的溶脹率用以下的公式計算
S(t) = (Wt-W0) /W0
Wt與Wtl分別為是凝膠珠濕重和干重。
2.凝膠珠的溶脹特性
模擬胃、小腸及結腸的ρΗ環(huán)境下實施例1、2、3、4、5的溶脹特性如圖3、4、5所示，凝膠珠子的溶脹率隨著Ν-α -戊二酸殼聚糖在海藻酸鈉/Ν-α -戊二酸殼聚糖中的比例的 增加而增加，而實施例5所制的凝膠珠在45min后就崩解了，這種現(xiàn)象是因為N- α -戊二酸 殼聚糖比海藻酸鈉有較多的負電荷，且殼聚糖側鏈基團α-戊二酸減弱了聚合物之間的作用力。實施例5所制的凝膠珠的高溶脹率和崩解速度導致在胃腸道的上部的低pH環(huán)境下 很難保護藥物，包載的藥物在胃腸道的下部會快速釋放。
結果表明實施例1、2、3、4在ρΗ6· 8及7. 4時的溶脹率分別是pHl. 2時的6倍和11 倍。這是因為在海藻酸鈉/Ν-α -戊二酸殼聚糖中，羧基是主要官能團，在pHl. 2的時候處于 非離子狀態(tài)，靜電斥力較弱，因此膨脹比例較小。隨著PH值增加到6. 8和7. 4，高于其pKa =4. 75，羧基(-C00H)完全變成離子形式(_C00_)。在C00_之間有強大的靜電斥力導致高 吸水性和高溶脹率。
實施例7
包載牛血清蛋白的雙重交聯(lián)凝膠珠的制備
(a) N-α-戊二酸殼聚糖的合成
N-α-戊二酸殼聚糖的合成步驟將4. 5克的殼聚糖溶于IOOml的1 % (ν/ν)乙酸 溶液中，再加入7. 2克的α -酮戊二酸，用IM氫氧化鈉溶液調節(jié)溶液的pH值為5，室溫攪拌 4小時，再加入2克硼氫化鈉，攪拌均勻后，用IM鹽酸溶液調節(jié)上述混合物的pH值為6. 5， 攪拌反應M小時，加入體積比為95 %乙醇終止反應。過濾獲得N- α -戊二酸殼聚糖聚合 物，分別用乙醇和乙醚洗滌3至4次，于紅外線干燥器中干燥至恒重。
(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備
將重量濃度為2%的N-α -戊二酸殼聚糖溶液30ml，用IM的氫氧化鈉溶液調節(jié) N- α -戊二酸殼聚糖溶液的pH至5. 0，再加入重量濃度為2 %的海藻酸鈉溶液70ml混勻，然 后將0. 4克的牛血清蛋白(BSA)添加到混合溶液中溶解，滴入到過量的重量濃度2%氯化鈣 溶液中，滴加完畢后，攪拌交聯(lián)0. 5小時，過濾，用蒸餾水沖洗3至4次除去凝膠珠表面未反 應的氯化鈣，再浸入到過量的重量濃度2%的硫酸鈉溶液攪拌交聯(lián)lh，過濾，用蒸餾水反復 沖洗3至4次，室溫下干燥至恒重。
實施例8
除(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備中，
“將重量濃度為2%的N- α -戊二酸殼聚糖溶液10ml，用IM的氫氧化鈉溶液調節(jié) N- α -戊二酸殼聚糖溶液的pH至4. 5，再加入重量濃度為2 %的海藻酸鈉溶液90ml混勻，然 后將0.4克的牛血清蛋白(BSA)添加到混合溶液中溶解，”
夕卜，其余與實施例7相同。
實施例9
除(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備中，
“將重量濃度為2%的N- α -戊二酸殼聚糖溶液20ml，用IM的氫氧化鈉溶液調節(jié) N- α -戊二酸殼聚糖溶液的pH至4. 5，再加入重量濃度為2 %的海藻酸鈉溶液80ml混勻，然 后將0.4克的牛血清蛋白(BSA)添加到混合溶液中溶解，”
夕卜，其余與實施例7相同。
實施例10
除(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備中，
“將重量濃度為2%的N- α -戊二酸殼聚糖溶液40ml，用IM的氫氧化鈉溶液調節(jié) N-α-戊二酸殼聚糖溶液的pH至4. 5，再加入重量濃度為2 %的海藻酸鈉溶液60ml混勻，然 后將0.4克的牛血清蛋白(BSA)添加到混合溶液中溶解，”
夕卜，其余與實施例7相同。
實施例11
BSA包載率(LE)的測定
將25mg實施例7、8、9、10所制的凝膠珠粉碎，倒入50ml、PH6. 8磷酸鹽緩沖溶液 中，室溫條件下攪拌Mh。將溶液離心后用紫外分光光度計在280nm處測定上清液中BSA 的釋放量，以實施例1所制的凝膠珠的上清液作對照。假設在24h的時間內(nèi)，珠子中包載的 BSA均已釋放。
包載率(LE)按下式計算
LE(% )=(珠子中包載的BSA的總量/實驗中使用的BSA的總量)X 100%
BSA 的包載率(LE)
BSA的包載率如圖6所示。從圖中我們可以看到，當BSA的重量占到凝膠珠質量 的20%時，包載率可達到92%以上。同時，隨著N-α-戊二酸殼聚糖在凝膠珠總量中的增 加，BSA的包載率也會不斷上升，因為BSA包載進凝膠珠時的酸性條件(ρΗ5. 0)高于BSA的 等電點7)，卻低于殼聚糖鏈上氨基的pKa值(6.3)。在這種情況下，帶負電荷的BSA就 會和殼聚糖鏈上帶正電荷的氨基通過靜電吸引完成包
實施例12
BSA體外釋放率的測定
在體外用下面的方法測定BSA的釋放率將IOOmg實施例7、8、9、10所制的凝膠珠 分別加入20ml模擬胃(pHl.2)、模擬小腸(pH6.8)、模擬結腸(ρΗ7· 4)的緩沖液中，37°C條 件下持續(xù)緩慢振搖。每隔15分鐘，取5ml上清液(同時向溶液中補入相同體積的新鮮緩沖 液)用紫外分光光度計在^Onm處，測定其中所含的BSA的量。BSA的累積釋放量通過標準曲線計算。實驗重復三次。
其結果如圖7、8、9所示，在pHl. 2緩沖液中，BSA的釋放率相對較低，75min內(nèi)只有 約14-18%的BSA從凝膠珠中釋放出來，隨后其累積釋放量達到平衡，這與凝膠珠在pHl. 2 的溶液中膨脹率較低有關，當PH達到6. 8和7. 4時，隨著凝膠珠不斷膨脹，BSA的釋放率迅 速提高，三個小時內(nèi)達到約100%。
實施例13
把實施例7、8、9、10所制的凝膠珠放入模擬胃(SGF)緩沖液(pHl. 2)中池，然后再 放入模擬結腸(SCF)緩沖液pH7. 4中4h，測量BSA累積釋放率。BSA在SCF中的累積釋放 率高于在SGF中的，如圖10。這是因為BSA釋放的與凝膠珠的溶脹有關，藥物是從溶脹的凝 膠珠的孔隙中擴散出來的。
權利要求
1.一種口服蛋白類藥物的制備方法，其特征在于包括(a)N-α-戊二酸殼聚糖的合成 步驟、(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備步驟；所述的(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備步驟為將重量濃度為0. 5-3 %的N- α -戊二酸殼聚糖溶液，用0. 5-2Μ的氫氧化鈉溶液調 節(jié)N- α -戊二酸殼聚糖溶液的ρΗ至0. 5-6. 5，再加入重量濃度為0. 5-3 %的海藻酸鈉溶 液混勻，加入口服蛋白類藥物，滴入到重量濃度1.5-2%氯化鈣溶液中，滴加完畢后，攪拌 交聯(lián)0. 5-3h，過濾，洗滌，再浸入到重量濃度1. 5-2的％硫酸鈉溶液攪拌交聯(lián)0. 5-4h，過 濾、洗滌、室溫下干燥至恒重，海藻酸鈉、Ν-α-戊二酸殼聚糖、口服蛋白類藥物的質量比為 1 0. 3-0. 9 0. 5-1. 5。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種口服蛋白類藥物的制備方法，其特征在于所述的口服 蛋白類藥物為胰島素、牛血清蛋白。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種口服蛋白類藥物的制備方法，其特征在于所述的(a) N- α -戊二酸殼聚糖的合成步驟將殼聚糖溶于的1-2% (ν/ν)乙酸溶液中，再加入α-酮戊二酸，用0. 5-2Μ氫氧化鈉溶 液調節(jié)上述溶液的PH值為3. 5-5. 5，室溫反應2-6小時，再加入硼氫化鈉，用0. I-IM鹽酸溶 液調節(jié)上述混合物的PH值為4. 5-7. 5，反應不小于M小時，加入90-95% (ν/ν)乙醇終止 反應，過濾，洗滌，干燥，即得到N- α -戊二酸殼聚糖，殼聚糖、α -酮戊二酸、硼氫化鈉的質 量比為 1 1. 5-3. 5 0. 3-1. 5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種口服蛋白類藥物的制備方法，包括(a)N-α-戊二酸殼聚糖的合成步驟、(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備步驟；所述的(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備步驟為將N-α-戊二酸殼聚糖溶液，用氫氧化鈉溶液調節(jié)N-α-戊二酸殼聚糖溶液的pH至0.5-6.5，再加入海藻酸鈉溶液混勻，加入口服蛋白類藥物，滴入到氯化鈣溶液中，滴加完畢后，攪拌交聯(lián)0.5-3h，過濾，洗滌，再浸入到硫酸鈉溶液攪拌交聯(lián)0.5-4h，過濾、洗滌、室溫下干燥至恒重。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，所制備的藥物載體，在酸性條件下不易崩解，并且藥物容易被吸收。
文檔編號A61K47/36GK102028936SQ20101058800
公開日2011年4月27日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權日2010年12月15日
發(fā)明者何所懼, 張銀葉, 李程程, 龔仁敏 申請人:安徽師范大學