專利名稱：一種適合靜脈注射的蛋白質(zhì)粒子組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及可減少在手術和內(nèi)科治療中的大量出血，并能夠加速內(nèi)科治療和手術痊愈速度的蛋白質(zhì)粒子組合物，尤指一種適合靜脈注射的蛋白質(zhì)粒子組合物。
眾所周知，人體血液充足是健康之本，許多手術及內(nèi)科治療、例如癌癥手術，均會引起失血。然而輸血又是一個很復雜的過程，可能會引起艾滋病和引入肝炎病毒；另外，尤其對于血小板缺乏的病人，失血過多則更是危險甚大。因而，在臨床上急需一種對凝血有幫助的物質(zhì)來解決上述這些問題。
由于此類物質(zhì)其功效如同血小板，可減少開刀和手術病人及血小板缺乏的病人的失血量，因而在將其注射入人體后，對其性質(zhì)要一定的要求。其一人體微血管的直徑為7微米，那么此類物質(zhì)微粒直徑必須小于7微米；其二此物質(zhì)微粒本身不應在血流中凝聚，但能在傷口處凝聚，此物質(zhì)微粒不會引起血細胞在血管中凝聚，但會參與或促進血細胞在傷口處凝聚。
此類物質(zhì)微粒有助于血液凝聚，那么這些微粒必須具有能夠允許它們參與血液凝固的表面分子，例如纖維蛋白原。
現(xiàn)在技術中，如K.J.Widder等人在《藥理及化學治療法的發(fā)展》，Vol.16，213-271中的“抗癌試劑生物物理示蹤中的磁活性微球體及其他載體”一文所涉及的，用蛋白質(zhì)水溶液和油通過加熱或聚合得到的乳化液合成蛋白質(zhì)微球體。然而由于蛋白質(zhì)在此過程中極易變質(zhì)而使此微粒其半衰期很短。因而在實際治療中需要其能夠在血管中保存至少一天以上不會變質(zhì)的粒子。
Oppenhein等人在美國專利US4,107,288，“注射組合物中有效的極微粒子及其生產(chǎn)方法”中提出另一種方法，其中通過使用一種相反的增溶劑來調(diào)節(jié)去溶劑試劑的濃度而使蛋白質(zhì)溶液達到一個去溶劑極限。這種方法存在的問題是在反應開始時條件極不穩(wěn)定，在反應過程中間伴隨著導致球體生成的大量的聚合，并伴隨超過血凝程度的聚合現(xiàn)象出現(xiàn)。血凝球體直徑大于7微米，超過了血管直徑，這就會造成血管阻塞并引起危險。因而在實際治療中需要其不會凝聚且其直徑比7微米小得多的微粒。
本發(fā)明的目的在于提供一種在懸浮液中其蛋白質(zhì)球體不凝聚、直徑比1微米小且在其表面包含有纖維蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組合物及其生產(chǎn)方法和用途。
本發(fā)明中，在交聯(lián)劑存在下所形成的球體其平均直徑小于1微米且其變異系數(shù)很小。
本發(fā)明中，纖維蛋白原可作為示蹤分子，其可攜帶蛋白質(zhì)球體到達創(chuàng)傷處以減少出血量。
本發(fā)明中，由于此組合物的作用是凝血，其功效與血小板相同，故又將其稱之為“凝血板”或“血小板替代品”(Fibrinoplate，plateletAggregationSubstitude)。
本發(fā)明中，此蛋白質(zhì)組合物其組成為(重量份數(shù)表示)人體白蛋白90-100份纖維蛋白原0.05-6份本發(fā)明的組合物其生產(chǎn)方法為1、首先制造蛋白質(zhì)粒子懸浮液，其中a、在滲透壓適當?shù)木彌_液中，溶解蛋白質(zhì)粉末；b、向a中所述的蛋白質(zhì)溶液中加入表面活性劑；c、向b中所述的蛋白質(zhì)和表面活性劑混合液中加入交聯(lián)劑；d、向c中所述的蛋白質(zhì)、表面活性劑和交聯(lián)劑中加入醇溶液。
即刻，出現(xiàn)一混濁的蛋白質(zhì)球體懸浮液，此懸浮液適于靜脈注射并且不會阻塞血管。
本發(fā)明中，所述的蛋白質(zhì)溶液是人體白蛋白溶液。
本發(fā)明中，所述的表面活性劑是洗滌劑。
本發(fā)明中，所述的表面活性劑可以選自四癸基硫酸鈉(Sodiumtetradecylsulfate)、Tween-80 TritonX-151中的一種本發(fā)明中，所述的交聯(lián)劑分子是包括戊二醛(glutaraldahyde)的共價小分子。
本發(fā)明中，所述緩沖溶液PH值范圍為4-8。
本發(fā)明中，所述的滲透壓范圍為14-680mOsm。
2、在上述的懸浮液混濁出現(xiàn)后，將表面蛋白質(zhì)加到懸浮液中的球體中，這樣，球體上末反應的交聯(lián)部分將通過共價健將表面蛋白質(zhì)連到人體白蛋白球體表面上。
其中，本發(fā)明中的表面蛋白質(zhì)可以是纖維蛋白原。
3、對上述的加入了的表面蛋白質(zhì)的人體白蛋白的球體懸浮液再處理成粉末其過程。包括進行稀釋、過濾、滲析、再過濾、離心分離、電泳分離和色譜柱分離，再通過真空冷凍干燥及冷凍后的粉末重構(gòu)化。其中在此過程中需加入緩沖液或改變緩沖液及加入防腐劑等生物相溶體，這些試劑的種類和用量是本領域技術人員所熟知的。
因此，本發(fā)明中涉及的一種適合靜脈注射的蛋白質(zhì)粒子懸浮液組合物，其中該蛋白質(zhì)粒子懸浮液組合物不會造成血管阻塞(除在傷口部位外)，該蛋白質(zhì)粒子是通過人體白蛋白交聯(lián)纖維蛋白原形成，其平均直徑小于7毫米。
其次，本發(fā)明涉及的也是一種經(jīng)生物相溶液體重構(gòu)后適于靜脈注射的冷凍的蛋白質(zhì)粒子組合物，其中該組合物不會造成血管阻塞(除在傷口部位外)，該蛋白質(zhì)粒子是通過人體白蛋白交聯(lián)纖維蛋白原形成，其平均直徑小于7毫米。
另外，本發(fā)明涉及的也是一種適合靜脈注射的蛋白質(zhì)粒子懸浮液組合物，其中該組合物不會造成血管阻塞(除在傷口部位外)，該組合物是人體白蛋白與纖維蛋白原以共價健形成于粒子表面，而且粒子表面是纖維蛋白原分子，內(nèi)部是人體白蛋白分子，其平均直徑小于7毫米。
再次，本發(fā)明涉及的也是一種經(jīng)生物相溶液化重構(gòu)后適于靜脈注射的冷凍的蛋白質(zhì)粒子組合物，其中該組合物不會造成血管阻塞(除在傷口部位外)，該組合物是人體白蛋白與纖維蛋白原以共價鍵形成粒子表面，而且該粒子其表面是纖維蛋白原，內(nèi)部是人體白蛋白，其平均直徑小于7毫米。
本發(fā)明另一方面又提供了該蛋白質(zhì)粒子在通過靜脈注射到人體中以后的一個新用途，即該粒子能夠遷移到新的傷口處，幫助血凝以減少患者失血量。
另外，可將此粒子用在外傷、手術或者大量內(nèi)、外出血的病人上，這對減少失血量換救病人的生命極為有益。
下面通過實施例對本發(fā)明進一步說明。盡管以下實施例是使用人體白蛋白，但是人體其它蛋白質(zhì)、如免疫蛋白、肌紅蛋白、膠原和明膠同樣也可使用并能夠形成球體。
實施例1沒有纖維蛋白原形成微粒的方法將人體白蛋白粉末放入0.9％的氯化鈉溶液中，并加入濃度在0.05mg/ml-15mg/ml的表面活性劑，如四癸基硫酸鈉、tween-80或TritonX-151，形成濃度在5-20％。(重量體積比)的蛋白質(zhì)溶液。然后向含有不同濃度的表面活性劑的含2ml上述蛋白質(zhì)溶液的系列試管中加入2ml以氯化鈉溶液稀釋過的，其濃度范圍為0.01-3.0％的戊二醛。10分鐘以后，再加入10ml的乙醇(用水稀釋到80％(體積比))，這時溶液立刻出現(xiàn)混濁。再過10分鐘，以5倍體積的氯化鈉溶液稀釋來觀察此懸浮液是否澄清，結(jié)果為否定的。此后以1000倍的的顯微鏡觀察此懸浮液，發(fā)現(xiàn)此懸浮液中粒子的直徑小于1微米。
同時也發(fā)現(xiàn)，用濃度為1-2.5mg/ml的TritonX-151和濃度為100-200mg/ml的白蛋白制面的合劑效果最好。另外也發(fā)現(xiàn)用濃度為1--12mg/ml的四癸基硫酸鈉制成的合劑其微粒直徑的變異系數(shù)最小。
實施例2將纖維蛋白原連到蛋白粒子上作為示蹤粒子的方法采用與實施例1相同的條件，使用用I-125的標記的人體白蛋白。通過以離心法沉淀球體，測量沉淀中和清液中各自含有的放射性蛋白質(zhì)微粒數(shù)目，發(fā)現(xiàn)有95％的白蛋白粒子形成球體。如果將溶液的溶質(zhì)度由0.9％的氯化鈉溶液濃度提高2倍，即變成1.8％的氯化鈉或?qū)?.9％的氯化鈉溶液降到0.09％的氯化鈉溶液，發(fā)現(xiàn)對球體的產(chǎn)量沒有很大影響。如果將緩沖溶液的PH降到4以下，則發(fā)現(xiàn)在形成球體時所需的醇的量比PH為8時所需醇的量要多，且PH在4以下時使球體的產(chǎn)率會稍微有所下降。
實施例3
在最優(yōu)先的條件下重復實施例2，所不同的是用熒光異硫氰酸酯包覆人體白蛋白。采用實施例1的最佳條件，在出現(xiàn)混濁后在不同的時間間隔內(nèi)將纖維蛋白源加到球體懸浮液中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在球體形成后十五分鐘內(nèi)加入纖維蛋白源能夠使球體穩(wěn)定且獲得最好的合劑。
另外，必須對球體懸浮液進行進一步處理，其中包括進行稀釋、過濾、滲析、再過濾、離心分離、電泳分離和色譜柱分離，再通過真空冷凍干燥及冷凍粉末的重構(gòu)化后完成，其中在此過程中需加入或改變緩沖液或防腐劑。
根據(jù)McGill等人的在J.Lab Clin Med 1987，109127-133上的“血小板模腔可降低血小板缺乏的兔子的流血時間”一文，使用血小板缺乏的兔子進行藥理試驗，以70mg/kg的Busulfan法處理過的十只兔子的流血時間為697秒，經(jīng)過注射1ml/kg的纖維蛋白原包覆的球體(用0.9％的氯化鈉溶液溶解冷凍過的粉末)，流血時間降為115秒(標準偏差為43秒)。將兔子耳朵傷處切片并移至熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)凝血內(nèi)有熒光粒子。如果對血小板缺乏的兔子注射不含纖維蛋白原的熒光球體，或是0.9％的氰化鈉溶液，或是單純的纖維蛋白原溶液(1mg/ml)，發(fā)現(xiàn)流血時產(chǎn)并未縮短，在耳朵凝血處也沒有發(fā)現(xiàn)熒光粒子，這說明纖維蛋白原只是作為引導分子將粒子導至凝血活躍區(qū)躍，并導致縮短流血時間及減少失血量。
對于那些有外傷或可能并未患有血小板缺乏癥的手術患者來說，本發(fā)明的粒子同樣具有療效，并能感受較快的凝血時間和較少的失血量之利。
權(quán)利要求
1.一種制備適合靜脈注射的蛋白質(zhì)粒子組合物的方法，其中，該方法包括a、在滲透壓適當?shù)木彌_液中，溶解蛋白質(zhì)粉末；b、向a中所述的蛋白質(zhì)溶液中，加入表面活性劑；c、向b中所述的蛋白質(zhì)和表面活性劑混合液中，加入交聯(lián)劑；d、向c中所述的蛋白質(zhì)、表面活性劑和交聯(lián)劑中加入醇溶液。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的蛋白質(zhì)溶液是人體白蛋白溶液。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的表面活性劑是洗滌劑。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述的表面活性劑是選自四癸基硫酸鈉Triton X-151、Tween 80中的一種。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的交聯(lián)劑分子是包括戊二醛的共價小分子。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的緩沖溶液范圍為PH＝4～8。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的滲透范圍為14-680mOsm。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的醇溶液為乙醇溶液。
9.權(quán)利要求1-8中任意一項所述的方法，其中還包括e把表面蛋白質(zhì)加入到球體懸浮液中。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的表面蛋白質(zhì)是人體血纖維蛋白原。
11.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的蛋白質(zhì)溶液為人類白蛋白溶液。
12.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的表面活性劑是洗滌劑。
13.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述選自包括四癸基硫酸鈉、Triton X-151、Tween 80中的一種。
14.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的交聯(lián)劑分子是一種包括包括戊二醛的共價反應性分子。
15.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述醇溶液為乙醇溶液。
16.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的緩沖溶液范圍為PH＝4-8小時。
17.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的滲透壓范圍為14-680mOsm。
18.權(quán)利要求9所述的方法，其中還包括將球體懸浮液再處理成粉末。
19.權(quán)利要求9所述的生產(chǎn)方法生產(chǎn)的一種適合靜脈注射的蛋白質(zhì)粒子懸浮液組合物，其中該蛋白質(zhì)粒子懸浮液組合物不會造成血管阻塞(除在傷口部位外)，該蛋白質(zhì)粒子是通過人體白蛋白交聯(lián)纖維蛋白原形成，其平均直徑小于7毫米。
20.權(quán)利要求18所述的一種經(jīng)生物相溶液體重構(gòu)后適于靜脈注射的冷凍的蛋白質(zhì)粒子組合物，其中該組合物不會造成血管阻塞(除在傷口部位外)，該蛋白質(zhì)粒子是通過人體白蛋白交聯(lián)纖維蛋白原形成，其平均直徑小于7毫米。
21.權(quán)利要求9所述的一種適合靜脈注射的蛋白質(zhì)粒子懸浮液組合物，其中該組合物不會造成血管阻塞(除在傷口部位外)，該組合物是人體白蛋白與纖維蛋白原以共價健形成于粒子表面，而且粒子表面是纖維蛋白原分子，內(nèi)部是人體白蛋白分子，其平均直徑小于7毫米。
22.權(quán)利要求18所述的一種經(jīng)生物相溶液體重構(gòu)后適于靜脈注射的泠凍的蛋白質(zhì)粒子組合物，其中該組合物不會造成血管阻塞(除在傷口部位外)，該組合物是人體白蛋白與纖維蛋白原以共價鍵形成于粒子表面，而且該粒子其表面是纖維蛋白原，內(nèi)部是人體白蛋白，其平均直徑小于7毫米。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適合靜脈注射的蛋白質(zhì)粒子組合物及其生產(chǎn)方法及用途。該組合物包括人體白蛋白和纖維蛋白原兩種組分。將人體白蛋白按一定方法制成人體白蛋白懸浮液球體，然后交聯(lián)纖維蛋白原。此組合物球體在懸浮液中不凝聚，直徑小于1微米。將該蛋白質(zhì)微粒組合物通過靜脈注射后不會導致血管阻塞，但會促進傷口血凝并能有效地減少患者失血量。
文檔編號A61P7/08GK1150048SQ9511794
公開日1997年5月21日 申請日期1995年11月6日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月6日
發(fā)明者徐家祥 申請人:徐家祥