專利名稱：一種去除調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的特異性腫瘤疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種去除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性腫瘤疫苗的制備方法。背景技術(shù)：
腫瘤是各種致癌因素誘發(fā)細(xì)胞惡變和多種免疫細(xì)胞抗腫瘤監(jiān)測殺傷功能兩種“陰陽” 機(jī)制互動失衡導(dǎo)致的惡性疾病。傳統(tǒng)的腫瘤治療主要是通過手術(shù)、化療與放療來達(dá)到早期根除腫瘤和減輕瘤負(fù)荷的目的，存在著腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的危險性，具有損傷正常組織與免疫功能低下等嚴(yán)重副作用，導(dǎo)致目前臨床上腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和死亡的幾率極高。腫瘤的免疫細(xì)胞治療是通過恢復(fù)與增強(qiáng)腫瘤患者自身的免疫監(jiān)測和殺瘤功能，可以有效地殺滅患者術(shù)后和放化療后體內(nèi)殘存的腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療腫瘤、預(yù)防復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移和最終根治腫瘤的目的，具有特異性強(qiáng)、副作用輕等優(yōu)點，正在逐步成為腫瘤綜合治療中的一個重要環(huán)節(jié)，也是當(dāng)前腫瘤治療基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的熱點與發(fā)展方向。根據(jù)誘導(dǎo)方法和來源的不同用于腫瘤生物治療效應(yīng)細(xì)胞主要有腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(TIL)、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)、細(xì)胞毒性T 細(xì)胞(T淋巴)等，由于一些細(xì)胞免疫治療因其效應(yīng)細(xì)胞來源困難(如TIL)或治療副反應(yīng)較大(如LAK)等原因，目前研究和報道越來越少；CIK雖然細(xì)胞增殖速度殺瘤活性高，殺瘤譜更廣，但是沒有特異性。目前普遍認(rèn)為腫瘤抗原特異性T淋巴是腫瘤靶向治療最為理想的免疫效應(yīng)細(xì)胞。目前腫瘤抗原特異性T淋巴的培養(yǎng)過程中，擴(kuò)增的細(xì)胞是含⑶8+和⑶4+⑶25+ 異質(zhì)性T細(xì)胞群，CD8+T淋巴細(xì)胞為機(jī)體最主要的抗腫瘤淋巴細(xì)胞群體，其中含有識別腫瘤抗原的特異性殺傷性T細(xì)胞，對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性的殺傷；而CD4+CD25+T細(xì)胞亞群是一種免疫抑制細(xì)胞，又稱為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞或Tregs (T-regulatory cells )，它表達(dá)CD3、 ⑶25和R)xP3，可抑制性調(diào)節(jié)⑶4+或⑶8+T細(xì)胞的活化與增殖，并能同時抑制初始T細(xì)胞與記憶性T細(xì)胞的增殖反應(yīng)，從而達(dá)到負(fù)向調(diào)控免疫應(yīng)答的作用，對在胸腺內(nèi)不能形成自身耐受的自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆有抑制作用；同時能抑制非己抗原誘發(fā)的免疫應(yīng)答， Treg的顯著增加，導(dǎo)致腫瘤病人免疫監(jiān)測與殺傷腫瘤功能的低下，最終抑制自身免疫反應(yīng)和協(xié)助腫瘤的免疫逃避中發(fā)揮著重要作用，并導(dǎo)致疫苗誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答的效用受到⑶4+⑶25+T細(xì)胞的限制。因選擇性地剔除患者體內(nèi)Tregs細(xì)胞可能增強(qiáng)抗腫瘤免疫的功能，達(dá)到免疫殺瘤的療效。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種特異性好、殺傷力強(qiáng)的去除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性腫瘤疫苗的制備方法。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種去除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性腫瘤疫苗的制備方法，主要包括如下步驟 (1)采集患者6(Tl20ml的自體外周血，分離其中的單核細(xì)胞和單個核細(xì)胞，置于全營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別誘導(dǎo)獲得CD8+及CD4+CD25+組成的異質(zhì)性T淋巴細(xì)胞群和具有強(qiáng)大抗原提呈作用的DC細(xì)胞；
所述全營養(yǎng)培養(yǎng)基為添加青/鏈霉素和10%FBS的1640培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基置于C02 細(xì)胞孵育箱內(nèi)放置2小時后收集懸浮液，離心獲得T淋巴細(xì)胞群，貼壁的DC細(xì)胞加DC培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，然后收集上清液，離心獲得DC細(xì)胞。(2) DC細(xì)胞用相應(yīng)的腫瘤抗原刺激，使DC細(xì)胞在體外致敏，得到致敏的DC細(xì)胞； DC細(xì)胞置于無血清培養(yǎng)基中，加入相應(yīng)的腫瘤特異性抗原蛋白，37°C下于C02孵育箱
內(nèi)感染2小時，加入全營養(yǎng)培養(yǎng)基(含有20ng/mL的GM-CSF和IL-4)至^il，繼續(xù)培養(yǎng)M、8 小時，即得到誘導(dǎo)成熟的DC細(xì)胞。(3) T淋巴細(xì)胞群通過磁性分選，去除⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)，獲取 CD8+T淋巴細(xì)胞，去除了 Tregs細(xì)胞的抑制作用，增強(qiáng)了 T淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤的作用；
(4)將致敏的DC細(xì)胞和分選出的CD8+T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，攜帶腫瘤抗原的DC細(xì)胞將抗原信息提呈給⑶8+T淋巴細(xì)胞并使之活化，得到特異性腫瘤疫苗DC-⑶8+ CTL0⑶8+T淋巴細(xì)胞和DC細(xì)胞按10:1的體積比混合，培養(yǎng)三天后加入IL_2 10U/mL, 及時分盤，每三天補(bǔ)充IL-2，14天后得到活化特異性腫瘤疫苗。本發(fā)明通過去除淋巴細(xì)胞中⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，獲得了⑶8+T淋巴細(xì)胞，能夠大大增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤的作用，此細(xì)胞簡稱去除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性腫瘤疫苗 (Tregs-Deletion-Cancer- Vaccine, TDCV)。這種方法所擴(kuò)增的細(xì)胞主要為殺傷性的⑶8+T淋巴細(xì)胞巴細(xì)胞，⑶8+ T淋巴細(xì)胞為機(jī)體最主要的抗腫瘤淋巴細(xì)胞群體，其中含有識別腫瘤抗原的特異性殺傷性T細(xì)胞，對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性的殺傷。這種腫瘤疫苗回輸至患者體內(nèi)后，DC激活的⑶8+T淋巴細(xì)胞能快速殺傷體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，同時攜帶腫瘤抗原的DC細(xì)胞會繼續(xù)將抗原信息提呈給體內(nèi)的CD8+T細(xì)胞并使之活化，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量具有特異性細(xì)胞毒性功能的T淋巴細(xì)胞，對腫瘤細(xì)胞具有特異性殺傷作用。本發(fā)明步驟簡捷，操作簡便，培養(yǎng)的細(xì)胞活化性好，對腫瘤細(xì)胞具有特異性殺傷作用，有效治愈腫瘤疾病，適于廣泛推廣應(yīng)用。
具體實施方式
實施例
所用試劑如下
肝素或枸櫞酸鈉抗凝管、Ficoll-Paque Plus、胎牛血清(FBS)、DPBS, IL_4、GM-CSF, IL-2、IL-6 ；
全營養(yǎng)培養(yǎng)基(CM) =RPMI 1640 (Invitrogen), 100U 的青霉素、100U 的鏈霉素，10%FBS。1. PBMCs的分離和培養(yǎng)
(1)抽取新鮮外周全血60-120mL，分成每份30mL于50mL離心管，加入6mLDPBS，緩慢加入 IOmL 的 Ficoll-Paque Plus ；
(2)離心(水平轉(zhuǎn)子)400g室溫20min；
(3)小心吸出位于紅細(xì)胞上的白色條帶，S卩外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)；
(4)用DPBS30 mL稀釋PBMCs，室溫300g離心10 min,重復(fù)兩次，去除上清；
(5)將PBMCs合并，重新混懸于10-20mL CM中，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)；(6)力口5-10mL1640培養(yǎng)基(含10%FBS)，加到25 CM培養(yǎng)瓶內(nèi)，在CO2細(xì)胞孵育箱內(nèi)放置2小時，讓細(xì)胞充分貼壁；
(7)輕搖培養(yǎng)瓶2-3min，以便未貼壁細(xì)胞充分懸浮，將培養(yǎng)瓶用1640培養(yǎng)基沖洗兩遍， 收集懸浮溶液，貼壁的細(xì)胞加DC培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，第6天開始，收集含有非貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)上清，更換培養(yǎng)基，共兩天，合并所收集的上清，離心，脫離貼壁的細(xì)胞，即為未成熟的DCs ；
(8)收集到的懸浮溶液300g離心lOmin，收集到的細(xì)胞為異質(zhì)性T淋巴細(xì)胞群。2. DC的誘導(dǎo)成熟
(1)特異性腫瘤抗原的制備
先將腫瘤組織在75%的酒精中浸泡10秒，立即置入無菌生理鹽水中浸泡5分鐘。然后將腫瘤組織置入適量的1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，用無菌手術(shù)剪將其剪碎，放入低溫冰箱中反復(fù)凍融3次，用超聲波細(xì)胞破碎儀將腫瘤組織進(jìn)一步打碎。離心除去細(xì)胞殘渣，上清液經(jīng) 0. 22 μ針式過濾器過濾，用核酸蛋白測定儀標(biāo)定蛋白含量，即特異性的腫瘤抗原。(2)腫瘤特異性抗原誘導(dǎo)DC的分化
IO6個DCs混懸于0. 5 mL的無血清培養(yǎng)基內(nèi)，加入相應(yīng)的腫瘤特異性抗原蛋白，37°C， CO2孵箱內(nèi)感染2小時，加入CM至2 mL含GM-CSF 20ng/mL、IL_4 ng/mL，繼續(xù)培養(yǎng)M-48小時，即為誘導(dǎo)成熟的DC。3.⑶8+ T淋巴細(xì)胞的磁性分離
(1)將得到的異質(zhì)性T淋巴細(xì)胞群懸浮液，兩次洗滌，分別300g離心，IOmin；
(2)臺盼藍(lán)染色計數(shù)；
(3)重懸細(xì)胞80uLbuffer (0. 5%BSA、2mM EDTA PH7. 2 PBS，真空抽濾除菌及液體內(nèi)氣體)/107細(xì)胞，手工混勻；
(4)加入20uL CD8磁珠標(biāo)記的抗體/IO7細(xì)胞；
(5)充分混勻，在2-8°C孵育15min；
(6)加入1-2mL buffer清洗/IO7細(xì)胞，然后加入10-20倍體積緩沖液300g離心， IOmin ；
(7)500 uL buffer溶液重懸108細(xì)胞；
(8)buffer緩沖液潤洗柱子；
(9)0.5mL細(xì)胞懸液過柱子進(jìn)行磁性分選；
(10)收集未標(biāo)記的陰選細(xì)胞，沖洗柱子三次；MS=3x500 uL，LS :3x3 mL ；
(11)從磁場中取下分離柱，插在適當(dāng)?shù)脑嚬芸谏?；用分選柱配備的活塞用力推盡液體， 沖出陽性結(jié)合的細(xì)胞。4. DC-CD8+ T 淋巴的誘導(dǎo)
⑶8+T淋巴細(xì)胞/DCs 10 :1混合，培養(yǎng)三天后，加入IL-2 10U/mL，及時分盤，每三天需補(bǔ)充IL-2，細(xì)胞分裂速度低于⑶4細(xì)胞，14天后用INF y ELISPOT法測活性?；罨募?xì)胞即為去除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性腫瘤疫苗。綜上所述，DC-CD8+T淋巴細(xì)胞即為去除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性腫瘤疫苗，攜帶特異性腫瘤抗原的DC細(xì)胞會將抗原信息提呈給CD8+T淋巴細(xì)胞并使之活化，進(jìn)而激活機(jī)體中有細(xì)胞毒性功能的T淋巴細(xì)胞，從而對腫瘤細(xì)胞具有特異性殺傷作用。
權(quán)利要求
1.一種去除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性腫瘤疫苗的制備方法，其特征為，主要包括如下步驟(1)采集患者6(Tl20ml的自體外周血，分離其中的單核細(xì)胞和單個核細(xì)胞，置于全營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別誘導(dǎo)獲得CD8+及CD4+CD25+組成的異質(zhì)性T淋巴細(xì)胞群和具有強(qiáng)大抗原提呈作用的DC細(xì)胞；(2) DC細(xì)胞用相應(yīng)的腫瘤抗原刺激，使DC在細(xì)胞在體外致敏，得到致敏的DC細(xì)胞；(3) T淋巴細(xì)胞群通過磁性分選，去除⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)， 獲?、?+T淋巴細(xì)胞；(4)將致敏的DC細(xì)胞和分選出的⑶8+T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，攜帶腫瘤抗原的DC細(xì)胞將抗原信息提呈給CD8+T淋巴細(xì)胞并使之活化，得到特異性腫瘤疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的去除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于步驟(1)中，所述全營養(yǎng)培養(yǎng)基為添加青/鏈霉素和10%FBS的1640培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基置于(X)2細(xì)胞孵育箱內(nèi)放置2小時后收集懸浮液，離心獲得T淋巴細(xì)胞群，貼壁的DC細(xì)胞加DC培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，然后收集上清液，離心獲得DC細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的去除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于步驟(2)中，DC細(xì)胞置于無血清培養(yǎng)基中，加入相應(yīng)的腫瘤特異性抗原蛋白，37°C 下于(X)2孵育箱內(nèi)感染2小時，加入全營養(yǎng)培養(yǎng)基至anl，繼續(xù)培養(yǎng)M 48小時，即得到誘導(dǎo)成熟的DC細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的去除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于步驟(4)中，⑶8+T淋巴細(xì)胞和DC細(xì)胞按10:1的體積比混合，培養(yǎng)三天后加入IL-2 10U/mL，及時分盤，每三天補(bǔ)充IL-2，14天后得到活化特異性腫瘤疫苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的去除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于所述全營養(yǎng)培養(yǎng)基中含有20ng/mL的GM-CSF和IL-4。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別公開了一種去除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性腫瘤疫苗的制備方法。本發(fā)明通過去除淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，獲得了CD8+T淋巴細(xì)胞，能夠大大增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤的作用，此細(xì)胞簡稱去除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性腫瘤疫苗。本發(fā)明步驟簡捷，操作簡便，培養(yǎng)的細(xì)胞活化性好，對腫瘤細(xì)胞具有特異性殺傷作用，有效治愈腫瘤疾病，適于廣泛推廣應(yīng)用。
文檔編號A61K39/00GK102319426SQ20111022561
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月8日
發(fā)明者刁曉娟, 孫理蘭, 張慧慧, 李榮榮, 王泰華 申請人:王泰華