專利名稱：一種核糖核酸注射液及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥配制品，具體地說是一種用于防治動(dòng)脈硬化癥的藥物制劑。
核糖核酸(RNA)是一類十分重要的生物大分子，它不僅在基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的生物合成起著關(guān)鍵作用，而且還能促進(jìn)細(xì)胞的諸多功能。隨著人們對(duì)核糖核酸研究的深入，其在醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用越來越多。早在1982年林單坤等人就把從免疫羊肝中提取得到的免疫核糖核酸做成制劑注入體內(nèi)，用于治療腫瘤和癌癥，并取得了明顯療效(參見林卓、肖天昆?？鼓[瘤免疫動(dòng)物肝RNA的研制[1]。臟器生化制藥。1982.3(2)1-8)。有人把從脾臟中提取得到的免疫核糖核酸做成的制劑注入體內(nèi)，用于治療與免疫功能下降有關(guān)的疾病如慢性支氣管炎、哮喘病、慢性乙型肝炎等，也取得了顯著的療效(參見沈郁。人脾免疫核酸的臨床應(yīng)用[J]。中國生化藥物雜志。1996.17(1)34-36)。有人把從酵母(白地霉)提取出來的核糖核酸制成片劑，用來治療黃疸型肝炎(參見許劍秋。核糖核酸生產(chǎn)工業(yè)化及其它臨床應(yīng)用探討[J]。食品科學(xué)。1997.18(4).46-48)。核糖核酸在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用研究雖然很多，但目前人們尚未研制出適于治療心、腦血管疾病的核糖核酸藥物。
本發(fā)明的目的之一就是提供一種新的核糖核酸藥物；其目的之二是提供一種制備該藥物注射液的方法；其目的之三是提供一種該藥物的用途。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所提供的核糖核酸藥物是由動(dòng)物血管內(nèi)皮為原料制成的血管內(nèi)皮核糖核酸注射液，其紫外吸收260nm有一吸收高峰，230nm和280nm為吸收低谷。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的以動(dòng)物血管內(nèi)皮為原料，采用以下步驟提取制得a、選用動(dòng)物血管，在5-20℃溫度下，剝離血管內(nèi)皮；動(dòng)物血管可選用年輕、健康的豬、牛、羊等動(dòng)物的血管。進(jìn)行剝離時(shí)，應(yīng)在低溫狀態(tài)下操作，以免原料酸腐變質(zhì)。
b、按重量份比計(jì)，取血管內(nèi)皮1-2份，加入蛋白變性劑和去垢劑各5-10份，混合后絞切打碎，在4-8℃溫度下放置1-2小時(shí)(該溫度可保證蛋白變性，并使酶失去活性，可以避免在以后加熱過程中造成的降解)；
蛋白變性劑可選鹽酸胍、苯酚，但最好選用飽和酚。
去垢劑可選用十二烷基肌酸鈉、十二烷基磺酸鈉，但最好選用十二烷基磺酸鈉。
c、將b步驟中制備成的混合物，振搖10一30分鐘，在56-60℃水浴中，加熱15-20分鐘后，冷卻；該步驟可使蛋白變性更充分。
d、離心，收集上清液；該上清液中含有RNA和少量混濁物。該混濁物可能是脂類，其不影響制劑的效果。
為了使d步驟中收集的上清液進(jìn)一步純化，最好在該步驟收集的上清液中加入b步驟中蛋白變性劑的1/4體積量的飽和酚，再次在56-60℃水浴15-20分鐘，冷卻后，加入b步驟中蛋白變性劑的1/4體積量的氯仿，振搖15-20分鐘。以使沒有變性的蛋白質(zhì)進(jìn)一步變性、沉淀，再次離心，提取上清液。
e、按1∶3的體積比，在上清液中加入1-2％無機(jī)鹽-無水乙醇液，在4-8℃溫度下，放置10-16小時(shí)；無機(jī)鹽可選用氯化鈉、硫酸鎂等，但最好選用乙酸鉀。
f、離心機(jī)離心，收集沉淀物，沉淀物加乙醇洗1-3次后，加入等滲鹽水溶解沉淀物(加至沉淀物全部溶解)，低溫、高速離心(一般可在8-12℃，10000rpm，10分鐘)，收集上清液；g、測定上清液的紫外線吸收260/280nm的比值，計(jì)算核糖核酸的含量。
h、包裝、貯存。
由于上清液中所溶解的核糖核酸不穩(wěn)定，故一般要以一種適當(dāng)?shù)馁A存形式將其進(jìn)行包裝。如采用乙酸鉀-無水乙醇沉淀后加乙醇懸起，存貯其懸濁液；或者在上清液中加入賦形劑(如右旋糖酐)后，凍干。
該方法制備的血管內(nèi)皮核糖核酸注射液，性能穩(wěn)定、療效好。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的血管內(nèi)皮核糖核酸注射液，在制備治療動(dòng)脈硬化癥藥物中的應(yīng)用。
大量研究證實(shí)動(dòng)脈硬化疾病屬于由年齡增長引起的衰老性疾病。通常衰老細(xì)胞與年輕細(xì)胞比較，DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生顯著變化。一般認(rèn)為衰老發(fā)生的原因主要是因?yàn)榛虮磉_(dá)失調(diào)。有人檢查了年輕血管和年老血管的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有百余種基因表達(dá)出現(xiàn)差異，且衰老細(xì)胞染色質(zhì)濃縮。衰老細(xì)胞的染色質(zhì)對(duì)Dnasel(DNA酶1)的抵抗性上升，Dnasel的抵抗性上升說明染色質(zhì)的疏松程度減弱，而表達(dá)基因均位于染色體組織的疏松區(qū)段。
既然動(dòng)脈硬化疾病與衰老有關(guān)，而衰老發(fā)生的原因是因?yàn)榧?xì)胞的染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。那么如何打開這些衰老細(xì)胞染色質(zhì)，可能是有效治療動(dòng)脈硬化癥的關(guān)鍵。
本發(fā)明所提供的血管內(nèi)皮核糖核酸注射液可在染色質(zhì)重組系統(tǒng)中特異性地增加基因?qū)nasel的敏感性，特異性地改變細(xì)胞形態(tài)、增加蛋白質(zhì)表達(dá)。在制備治療動(dòng)脈硬化癥藥物的應(yīng)用中取得了顯著的效果。
本發(fā)明藥物經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，其可使老年動(dòng)物血管內(nèi)膜光滑，血細(xì)胞附著減少；使高脂飼料引起的家兔動(dòng)脈粥樣硬化程度減輕。
本發(fā)明藥物在治療動(dòng)脈硬化及由動(dòng)脈硬化引起的多種疾病如高血壓、腔隙性腦梗塞、冠心病、末梢循環(huán)障礙等疾病中具有顯著的治療效果，且無毒副作用。
本發(fā)明藥物的用法用量為肌肉或靜脈注射，一般每周注射一次，每次1-4mg，溶于2-4ml等滲鹽水中。靜脈注射時(shí)，務(wù)須緩慢注射。一般要5分鐘注完。輕癥病人可以4周注射一次。
本發(fā)明藥物也可制備成粘膜透入劑，粘膜給藥。
本發(fā)明藥物經(jīng)急性毒性實(shí)驗(yàn)給予小鼠相當(dāng)于人體用量的300-600倍劑量，未見毒性反應(yīng)。經(jīng)長期毒性試驗(yàn)，給予大鼠相當(dāng)于人體用量的10倍劑量，連續(xù)給藥三個(gè)月，未見毒性反應(yīng)。
本發(fā)明中的注射液，經(jīng)豚鼠實(shí)驗(yàn)不發(fā)生過敏反應(yīng)。但對(duì)過敏體質(zhì)的個(gè)體病人，間隔2周以上用藥，注射時(shí)應(yīng)在10分鐘以上注射完畢。
本發(fā)明藥物的有益效果通過以下實(shí)驗(yàn)得到了證實(shí)。
本發(fā)明藥物在治療家兔高脂血癥動(dòng)脈硬化中的應(yīng)用材料和方法家兔體重2kg(1.8-2.2)皮毛白色的家兔，購自正定家兔飼養(yǎng)廠。
高脂飼料配方常規(guī)飼料加膽固醇和豬油。
本發(fā)明注射液 紫外吸收260/280nm OD值≥2.0。
制備動(dòng)物模型 購來的家兔喂普通飼料1周，然后換為高脂飼料喂4周，接著喂減量的高脂飼料2周。
給藥方案 家兔分為4組，每組3-6只，其中3組飼喂高脂飼料組，1組飼喂普通飼料。飼喂高脂飼料的三組分別為本發(fā)明注射液組(2mg/0.8m1)、復(fù)方丹參注射液組(0.8ml為陽性對(duì)照)，鹽水對(duì)照組(陰性對(duì)照)；飼喂普通飼料組為正常對(duì)照組(注射鹽水)。每周注射一次共注射8次，末次注射后3天，取血測血脂(取靜脈血分離血清測血脂)，取主動(dòng)脈測動(dòng)脈斑塊病變。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1、表2、表3表1飼喂高脂飼料前，4組動(dòng)物的膽固醇和甘油三脂值
喂高脂飼料前各組血脂比較測家兔血脂后按血脂的量隨機(jī)分層分組，分組結(jié)果如表1，結(jié)果表明各組之間無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各組家兔具有可比性。
表2治療后，4組動(dòng)物的膽固醇和甘油三脂值
實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明藥物可明顯降低動(dòng)物膽固醇。與其它組相比具有顯著差異(P＜0.5)。
表3 動(dòng)脈壁動(dòng)脈粥樣硬化斑塊改變
表3表明，用本發(fā)明注射液組其動(dòng)脈斑塊程度小于其他高脂飼料組。經(jīng)配對(duì)T檢驗(yàn)，具有顯著差異。
綜上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明藥物可以防治家兔高脂飼料引起的動(dòng)脈硬化，其療效優(yōu)于復(fù)方丹參注射液。
本發(fā)明對(duì)30例病例進(jìn)行了臨床觀察，觀察結(jié)果見表4。
表4臨床觀察
診斷依據(jù)龔蘭生主編，上海科學(xué)技術(shù)出版社出版《內(nèi)科手冊(cè)》P495，P823。
臨床觀察表明，本發(fā)明注射液對(duì)動(dòng)脈硬化導(dǎo)致的各種癥狀和體征均有顯著療效，且療效鞏固、持久。它能改善包括頭暈、震顫、末梢循環(huán)障礙、無力、視物不清，記憶力減退、夜尿增多、大便干燥等多種老年動(dòng)脈硬化所致癥狀。
實(shí)施例1 血管內(nèi)皮核糖核酸注射液一、制備血管內(nèi)皮取新鮮的豬血管1kg(18條)，在15-18℃溫度下進(jìn)行分離，獲血管內(nèi)皮98.6g。
二、制備飽和酚分析純重結(jié)晶酚500g，放于水浴中加熱(60℃)融化，加入8羥基奎林0.5g，加0.1MpH5.0乙酸鈉緩沖液200ml，過夜后吸出上清，再加100ml 0.1MpH5.0乙酸鈉緩沖液，過夜吸出上清，下層酚相即可以使用。
三、制備十二烷基磺酸鈉(SDS)液0.3％SDS用pH5.0，0.1M乙酸鈉配制，加熱滅菌后保存。
四、血管內(nèi)皮核糖核酸的提取a血管內(nèi)皮80g加飽和酚和SDS液各400ml，高速絞切打碎組織，4-8℃操作，維持2小時(shí)。
b、振搖15分鐘，60℃水浴15分鐘，自來水冷卻。
c、制備離心機(jī)離心，室溫，2500rpm30分鐘。
小心吸出上清，共360ml。
d、上清中加入100ml飽和酚(相當(dāng)于蛋白變性劑量的1/4)，再次60℃水浴加熱，15分鐘，自來水冷卻，加入100ml的氯仿，振搖15分鐘。
e、制備離心機(jī)離心，室溫，2500rpm，30分鐘。
吸出上清360ml，加入2％乙酸鉀-無水乙醇，1080ml，4℃放置12小時(shí)。
f、制備離心機(jī)離心，室溫，2500rpm，30分鐘，慢停。
g、75％乙醇洗2次，每次50ml。等滲鹽水4ml溶解沉淀，高速離心，(8℃，10000rpm，10分鐘)。
h、包裝存貯，即取上清液加2％乙酸鉀-無水乙醇12ml，4℃過夜。高速離心，(8℃，10000rpm，10分鐘)。沉淀用95％乙醇8ml洗一次。再用95％乙醇8ml懸起，即為血管內(nèi)皮核糖核酸懸濁液。
比色皿中加3ml蒸餾水，加血管內(nèi)皮RNA懸濁液20微升，260nm/280nm比值＝0.488/0.231＝2.113RNA總量＝0.488(260nmOD值)/24×150(稀釋倍數(shù))×8ml(體積)＝24.4mg。
每安瓶加血管內(nèi)皮RNA懸濁液0.33ml，2000rpm，離心，吸出上清0.23ml，融封安瓶，共制備24支。
權(quán)利要求
1.一種核糖核酸注射液，其特征在于它是由動(dòng)物血管內(nèi)皮為原料制成的血管內(nèi)皮核糖核酸注射液，其紫外吸收；260nm有一吸收高峰，230nm和280nm為吸收低谷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核糖核酸注射液的制備方法，其特征在于它以動(dòng)物血管內(nèi)皮為原料，采用以下步驟制得a、選用動(dòng)物血管，在5-20℃溫度下，剝離血管內(nèi)皮；b、按重量份比計(jì)，取血管內(nèi)皮1-2份，加入蛋白變性劑和去垢劑各5-10份，混合后絞切打碎，在4-8℃溫度下放置1-2小時(shí)；c、將b步驟中制備成的混合物振搖10-30分鐘，56-60℃水浴加熱15-20分鐘后，冷卻；d、離心，收集上清液；e、按1∶3的體積比，在上清液中加入1-2％無機(jī)鹽-無水乙醇液，4-8℃溫度下，放置10-16小時(shí)；f、離心機(jī)離心，收集沉淀物，沉淀物加乙醇洗1-3次后，加入等滲鹽水溶解沉淀物，低溫、高速離心，收集上清液；g、測定上清液的紫外線吸收260/280nm的比值，計(jì)算核糖核酸的含量；h、包裝存貯。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核糖核酸注射液的制備方法，其特征在于所說的蛋白變性劑為飽和酚，去垢劑為0.3％十二烷基硫酸鈉；
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的核糖核酸注射液的制備方法，其特征在于所說的無機(jī)鹽為乙酸鉀。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核糖核酸注射液的制備方法，其特征在于所說的在d步驟收集的上清液，加入b步驟中蛋白變性劑的1/4體積量的飽和酚，再次在60℃水浴15-20分鐘，冷卻后，加入b步驟中蛋白變性劑的1/4體積量的氯仿，振搖15-20分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核糖核酸注射液，其特征在于該注射液適于制備治療動(dòng)脈硬化癥的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種核糖核酸注射液，同時(shí)公開了其的制備方法和用途。它是由動(dòng)物血管內(nèi)皮為原料制成的血管內(nèi)皮核糖核酸注射液，其紫外吸收；260nm有一吸收高峰，230nm和280nm為吸收低谷。制備方法是在5－20℃溫度下，剝離血管內(nèi)皮；按重量份比計(jì)，取血管內(nèi)皮1－2份，加入蛋白變性劑和去垢劑各5－10份，混合后絞切打碎，在4－8℃溫度下放置1－2小時(shí)；振搖10－30分鐘，56－60℃水浴加熱15－20分鐘后，冷卻；離心、純化、收集上清液；該注射劑可在制備治療動(dòng)脈硬化癥藥物中的得到應(yīng)用。本發(fā)明藥物在治療動(dòng)脈硬化及由動(dòng)脈硬化引起的多種疾病如高血壓、腔隙性腦梗塞、冠心病、末梢循環(huán)障礙等疾病中具有顯著的治療效果，且無毒副作用。
文檔編號(hào)A61K31/7105GK1500493SQ0214866
公開日2004年6月2日 申請(qǐng)日期2002年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月15日
發(fā)明者呂占軍 申請(qǐng)人:呂占軍