專利名稱：防治肝病的鯊魚肝多肽結(jié)構(gòu)及純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種源于鯊魚肝臟的防治肝病的多肽結(jié)構(gòu)及其純化方法，具體的講，其涉及一種從幼齡鯊魚的新鮮肝臟中提取的純肝細(xì)胞再生刺激因子結(jié)構(gòu)特征及其純化方法，可用于治療乙型肝炎、遷慢性肝炎、肝硬化、免疫性肝炎等肝臟疾病。
肝病是威脅人類生命和健康的主要疾病之一。國內(nèi)外學(xué)者一般利用陸地生長的動(dòng)物肝臟研究和開發(fā)治療肝病的藥物。自Lebrecque首先從斷乳大鼠的肝臟發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞再生刺激因子(Hepatic Stimulator Substance，簡稱HSS)，并經(jīng)臨床證實(shí)治療各類肝病有較好療效以來，國內(nèi)外有關(guān)HSS的基礎(chǔ)和臨床工作已開展許多，關(guān)于HSS的純化、理化性質(zhì)、氨基酸組成、作用機(jī)理均有相應(yīng)報(bào)道，但不同研究者純化的HSS性質(zhì)有所差異，這可能是由于HSS來源不同，提取方法各異及樣品不純等原因所致。如美國Lebrecque等，從斷乳大鼠的肝臟中提取的HSS，因?yàn)樘崛∵^程中采用了乙醇沉淀方法，使得HSS活性降低，且工藝煩瑣、收率低，不宜批量生產(chǎn)，所以至今仍停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段(DOUGLA R．LABRECQUE etc，Purification and Physical-Chemical Characterization of HepaticStimulator Substance．Hepatology，Vo1．7，No1，pp．100～106，1987)。
國內(nèi)已在臨床上廣泛應(yīng)用的肝細(xì)胞活性物質(zhì)均是從陸地生長的胎、幼動(dòng)物肝臟中提取的混合物，成份不明確。如鼠、豬、牛、狗等動(dòng)物的胎、幼肝分離提取的肝細(xì)胞活性物質(zhì)，純度都較低，雖然在體內(nèi)外有專一地刺激肝細(xì)胞生長的能力，但實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)劑量加大到一定程度后，其抗肝細(xì)胞損傷和促進(jìn)肝細(xì)胞生長的作用反而下降(黃才國、彭敏、魏善健等，人肝細(xì)胞生長刺激因子的部分純化及活性測定，第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)1996，4月；17(2)184～186)。粗制品中難免含有一些雜質(zhì)，其抑制肝細(xì)胞生長。CN1096053A公開的“低分子量肝細(xì)胞生長素的制備方法”，它采用乳豬肝臟為原料，經(jīng)勻漿、加熱、離心沉淀、降解、純化、凍干等步驟制備，其特征在于用胰蛋白酶降解，用超濾進(jìn)行純化，這種方法雖能得到分子量小于1萬的活性多肽，但用超濾仍很難準(zhǔn)確控制分子量，而且純度較低，仍然是混合物。我們在中國專利申請CN1250780A中公開了可防治肝病的鯊魚肝刺激物質(zhì)及其提取、純化方法，其除去了抑制肝細(xì)胞生長的雜質(zhì)，純度較高，活性也較高。但該鯊魚肝刺激物質(zhì)的純度仍不足以確定其精確分子量及其氨基酸組成和N-端氨基酸序列。
本發(fā)明的目的是提供治療乙型肝炎、遷慢性肝炎、免疫性肝損傷等肝病的純的鯊魚肝多肽，確定其準(zhǔn)確的物理化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征。
本發(fā)明的目的還在于提供純化鯊肝刺激物質(zhì)的方法，尤其是柱層析的條件。
為解決上述任務(wù)，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種防治肝病的多肽，其分子量為16950Da，等電點(diǎn)為5．60，紫外特征吸收峰為276nm。
用液相色譜法測氨基酸組成為(pmol／μg)114．39Glu，82．86Ala，101．43Asp，78．25Gly，38．21Val，34．1Ser，28．99Cys-Cys，13．21Phe，11．29His，11．13Arg，6．89Thr，5．92Lys，2．75Tyr，32．41Leu，23．75Ilu，14．58Trp。
用PE-ABD491A蛋白質(zhì)N-端測序儀測其N-末端氨基酸殘基的排列順序?yàn)镹-Met-Arg-Thr-Gln-Glu-His-Thr-Lys-Ser-Val。
該防治肝病的多肽的純化方法，包括取鯊魚肝臟，絞碎，離心，超濾，陰離子交換層析，F(xiàn)PLC Mono Q層析，其特征在于將鯊魚肝刺激物質(zhì)采用FPLCMono Q色譜進(jìn)行純化，層析柱溫度25℃，流速2ml／min，流動(dòng)相A0．01～0．03mol／L，pH8．0～8．6的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol／L NaCl的A液，用A液洗滌未結(jié)合的雜蛋白，多肽的洗脫梯度為B(0～10％)，5min，B(10％～30％)，20-25min，B(30％～100％)，10-15min。
該多肽的較好的純化方法，其特征在于將鯊魚肝刺激物質(zhì)采用FPLC Mono Q色譜進(jìn)行純化，層析柱溫度25℃，流速2ml／min，流動(dòng)相A0．01～0．02mol／L，pH8．1～8．4的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol／L NaCl的A液，用A液洗滌未結(jié)合的雜蛋白，多肽的洗脫梯度為B(0～7％)，5min，B(7％～25％)，21-23min，B(25％～100％)，11-14min。
該多肽的較好的純化方法還有，將鯊魚肝刺激物質(zhì)采用FPLC Mono Q色譜進(jìn)行純化，層析柱溫度25℃，流速2ml／min，流動(dòng)相A0．01～0．02mol／L，pH8．2～8．3的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol／L NaCl的A液，用A液洗滌未結(jié)合的雜蛋白，多肽的洗脫梯度為B(0～7％)，5min，B(7％～25％)，21-23min，B(25％～100％)，11-14min。
純鯊魚肝多肽的制備方法，實(shí)際上包括兩部分1、先采用CN1250780A中公開的提取純化方法，獲得較純的防治肝病的鯊魚肝刺激物質(zhì)；2、再用本發(fā)明提供的純化方法，得純的鯊魚肝多肽。
具體制備純鯊魚肝多肽的方法是首先，取經(jīng)檢疫的幼鯊肝臟，去除肝膜及血液，用蒸餾水洗滌，絞碎后，加入蒸餾水在高速搗碎機(jī)中制成勻漿。在90℃～100℃水浴中保持5～10分鐘，然后在8000rpm-1下離心20分鐘，取上清液，棄沉淀以去除雜蛋白。用截留分子量30KD的中空纖維素膜進(jìn)行超濾，收集濾出液。然后用DEAE-Sephadex A25陰離子交換柱進(jìn)行陰離子交換層析，用0．005～0．02mol／L pH6．8～7．5的PBS緩沖液洗滌未結(jié)合雜蛋白，用含0～0．3mol／LNaCl的PBS緩沖液洗脫鯊魚肝刺激物質(zhì)。
用上述CN1250780A專利方法制備的鯊魚肝刺激物質(zhì)，經(jīng)FPLC的Mono Q柱純化，流動(dòng)相A0．01～0．03mol／L pH8．0～8．6的Tris-HCl緩沖液，B含1mol／LNaCl的A液，用A液洗滌未結(jié)合蛋白，多肽的洗脫梯度為B(0～10％)5min，B(10％～30％)25min，B(30％～100％)15min，即可得到鯊魚肝的純多肽。
將鯊魚肝刺激物質(zhì)采用FPLC Mono Q色譜進(jìn)行純化時(shí)，也可選擇層析柱溫度25℃，流速2ml／min，流動(dòng)相A0．01～0．02mol／L，pH8．1～8．4或pH8．2～8．3的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol／L NaCl的A液，用A液洗滌未結(jié)合的雜蛋白，多肽的洗脫梯度為B(0～7％)，5min，B(7％～25％)，25min，B(25％～100％)，10min。
純化后的鯊魚肝多肽，用質(zhì)譜測其分子量為16950Da，等電點(diǎn)為5．60，紫外特征吸收峰為276nm。用液相色譜法測氨基酸組成為(pmol／μg)114．39Glu，82．86Ala，101．43Asp，78．25Gly，38．21Val，34．1Ser，28．99Cys-Cys，13．21Phe，11．29His，11．13Arg，6．89Thr，5．92Lys，2．75Tyr，32．41Leu，23．75Ilu，14．58Trp。
用PE-ABD491A蛋白質(zhì)N-端測序儀測其N-末端氨基酸殘基的排列順序?yàn)镹-Met-Arg-Thr-Gln-Glu-His-Thr-Lys-Ser-Val。
體內(nèi)藥效學(xué)試驗(yàn)證明純化后的鯊魚肝多肽在鴨乙型肝炎病毒感染鴨體內(nèi)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)治療中，能有效抑制鴨乙型肝炎病毒的復(fù)制。實(shí)驗(yàn)采用一日齡北京鴨，靜脈注射鴨乙型肝炎病毒，七天后分組，每組5-6只，鯊魚肝多肽實(shí)驗(yàn)用2．5、5．0和10mg／Kg，3個(gè)劑量組，腹腔注射1天2次，給藥10天(Bid×10)，并與阿昔洛韋(ACV)比較，100mg／Kg作陽性對照，同時(shí)設(shè)病毒對照組，以生理鹽水代替藥物。給藥前(T0)，給藥后第5天(T5)和10天(T10)及停藥后3天(P3)取血，分離血清，同時(shí)進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，測定鴨血清DHBV-DNA的OD值。計(jì)算血清DHBV-DNA抑制率，觀察藥效。(見表1，表2)結(jié)果表明純鯊魚肝多肽治療組能顯著降低鴨血清中DHBV-DNA水平。
在對四氯化碳所致大鼠慢性肝損傷的治療作用實(shí)驗(yàn)中，用大鼠72只，除正常對照組外，其余大鼠每周sc25％CCl4花生油溶液2．0ml／kg，連續(xù)三個(gè)月。造型8周時(shí)，眼眶取血，分離血清，測定血清ALT、AST的含量，按血清ALT含量，將大鼠隨機(jī)分組(見表3)，按表中劑量給藥，每天一次。結(jié)果表明純鯊魚肝多肽用藥8周，對四氯化碳引起的肝損傷大鼠血清中AST活性的升高、羥脯氨酸含量的升高均有抑制作用，能增加白蛋白含量，降低球蛋白含量，使白／球比有一定的升高。說明鯊肝肽對肝細(xì)胞生成膠原纖維的變化有一定抑制，有減輕肝臟纖維化的作用，即對四氯化碳致大鼠慢性肝損傷有一定的治療作用。(見表3)(實(shí)驗(yàn)方法參見《現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，張均田，北大協(xié)和聯(lián)合出版社，1998。)鯊魚肝多肽在小鼠免疫性肝損傷模型中對肝損傷具有改善作用的實(shí)驗(yàn)。用健康小鼠隨機(jī)分組(具體見表4)(實(shí)驗(yàn)方法參見《中藥新藥與臨床藥理》1999，9(1)30，清肝沖劑對免疫性肝炎模型小鼠的保護(hù)作用及免疫調(diào)節(jié)作用，林培英，張丹，肖柳英等)。除正常對照組外，其余各組小鼠均予以靜脈注射卡介苗1mg／只，次日起環(huán)磷酰胺組小鼠以30mg／kg劑量隔天腹腔注射給藥，其它給藥組于免疫第8天開始腹腔給藥，每天一次，連續(xù)三天，正常對照和模型對照給予相應(yīng)體積的生理鹽水。至免疫第10天，給藥1小時(shí)后，除正常對照組外，其余各組均靜脈注射內(nèi)毒素10g／只，攻擊后6小時(shí)，小鼠眼眶靜脈叢取血，分別測AST和ALT。結(jié)果表明鯊魚肝多肽能減輕免疫反應(yīng)介導(dǎo)的肝細(xì)胞損害。
本發(fā)明的多肽可以與藥物載體組合，或與有生理活性的其它藥物成份組合，制成治療乙型肝炎、遷慢性肝炎、免疫性肝損傷等肝病的藥物組合物。這種藥物組合物可以通過常用技術(shù)配制，載體的形式可以根據(jù)所選擇的施用途徑而變化，常用施用途徑有口服、靜脈注射、肌肉注射等。表1鯊魚肝多肽治療組與病毒感染前鴨血清DHBV-DNA OD值比較表表2鯊魚肝多肽治療組與病毒感染對照組鴨血清DHBV-DNA水平抑制率的比較表表3鯊魚肝多肽對四氯化碳致大鼠慢性肝損傷的治療作用(X±S)表表4鯊魚肝多肽對小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用(x±s)表實(shí)例一取經(jīng)檢疫的幼鯊肝臟，去除肝膜及血液，用蒸餾水洗滌，絞碎后，加入蒸餾水在高速搗碎機(jī)中制成勻漿。在90℃～100℃水浴中保持5～10分鐘，然后在8000rpm-1下離心20分鐘，取上清液，棄沉淀以去除雜蛋白。用截留分子量30KD的中空纖維素膜進(jìn)行超濾，收集濾出液。然后用DEAE-Sephadex A25陰離子交換柱進(jìn)行陰離子交換層析，用0．005～0．02mol／L pH6．8～7．5的PBS緩沖液洗滌未結(jié)合雜蛋白，用含0～0．3mol／L NaCl的PBS緩沖液洗脫鯊魚肝刺激物質(zhì)。
取5mg的鯊魚肝刺激物質(zhì)，溶于5ml的0．01mol／L pH8．0的Tris-HCl緩沖液中，經(jīng)FPLC的Mono Q 1ml柱，層柱溫度25℃，流速2ml／min，流動(dòng)相A0．01mol／L pH8．0的Tris-HCl緩沖液，B含1mol／L NaCl的A液，用A液洗滌未結(jié)合蛋白，多肽的洗脫梯度為B(0～10％)5min，B(10％～30％)25min，B(30％～100％)15min，即可得到鯊肝純多肽0．5mg。
純化后的鯊魚肝多肽，用質(zhì)譜測其分子量為16950Da，等電點(diǎn)為5．60，紫外特征吸收峰為276nm。用液相色譜法測氨基酸組成為(pmol／μg)114．39Glu，82．86Ala，101．43Asp，78．25Gly，38．21Val，34．1Ser，28．99Cys-Cys，13．21Phe，11．29His，11．13Arg，6．89Thr，5．92Lys，2．75Tyr，32．41Leu，23．75Ilu，14．58Trp。
用PE-ABD491A蛋白質(zhì)N-端測序儀測其N-末端氨基酸殘基的排列順序?yàn)镹-Met-Arg-Thr-Gln-Glu-His-Thr-Lys-Ser-Val。
藥效學(xué)見表1～表4。實(shí)例二取6mg的鯊魚肝刺激物質(zhì)(見專利CN1250780A)，溶于6ml的0．02mol／LpH8．6的Tris-HCl緩沖液中，經(jīng)FPLC的Mono Q 1ml，層柱溫度25℃，流速2ml／min，流動(dòng)相A0．02mol／L pH8．6的Tris-HCl緩沖液，B含1mol／L NaCl的A液，用A液洗滌未結(jié)合蛋白，多肽的洗脫梯度為B(0～7％)5min，B(7％～25％)20min，B(25％～100％)10min，即可得到鯊魚肝的純多肽0．60mg。純化后的鯊魚肝多肽，用質(zhì)譜測其分子量為16950Da，等電點(diǎn)為5．60，紫外特征吸收峰為276nm。用液相色譜法測氨基酸組成為(pmol／μg)114．39Glu，82．86Ala，101．43Asp，78．25Gly，38．21Val，34．1Ser，28．99Cys-Cys，13．21Phe，11．29His，11．13Arg，6．89Thr，5．92Lys，2．75Tyr，32．41Leu，23．75Ilu，14．58Trp。
用PE-ABD491A蛋白質(zhì)N-端測序儀測其N-末端氨基酸殘基的排列順序?yàn)镹-Met-Arg-Thr-Gln-Glu-His-Thr-Lys-Ser-Val。
藥效學(xué)見表1～表4。表1鯊魚肝多肽治療組與病毒感染對照組鴨血清DHBV-DNA OD值比較
*P＜0．05，**P＜0．01表2鯊魚肝多肽治療組與病毒感染對照組鴨血清DHBV-DNA水平抑制率的比較
*P＜0．05，**P＜0．01表3、鯊魚肝多肽對CCl4致大鼠慢性肝損傷的治療作用(±SD)
與模型對照相比，*p＞0.05，**p＜0.05表4 鯊魚肝多肽對小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用( X±S)
與模型對照組相比，*P＜0．05，**P＜0．0權(quán)利要求
1．一種防治肝病的多肽，其特征在于其分子量為16950Da，等電點(diǎn)為5．60，紫外特征吸收峰為276nm。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治肝病的多肽，其特征在于氨基酸組成為(pmol／μg)114．39Glu，82．86Ala，101．43Asp，78．25Gly，38．21Val，34．1Ser，28．99Cys-Cys，13．21Phe，11．29His，11．13Arg，6．89Thr，5．92Lys，2．75Tyr，32．41Leu，23．75Ilu，14．58Trp。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治肝病的多肽，其特征在于N-末端氨基酸殘基的排列順序?yàn)镹-Met-Arg-Thr-Gln-Glu-His-Thr-Lys-Ser-Val。
4．一種防治肝病的多肽的純化方法，包括取鯊魚肝臟，絞碎，離心，超濾，陰離子交換層析，F(xiàn)PLC Mono Q層析其特征在于將鯊魚肝刺激物質(zhì)采用FPLCMono Q色譜進(jìn)行純化時(shí)，流動(dòng)相A0．01～0．03mol／L，pH8．0～8．6的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol／L NaCl的A液，用A液洗滌未結(jié)合的雜蛋白，多肽的洗脫梯度為B(0～10％)，5min，B(10％～30％)，20-25min，B(30％～100％)，10-15min。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述防治肝病多肽的純化方法，其特征在于將鯊魚肝刺激物質(zhì)采用FPLC Mono Q色譜進(jìn)行純化，流動(dòng)相A0．01～0．02mol／L，pH8．1～8．4的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol／L NaCl的A液，用A液洗滌未結(jié)合的雜蛋白，多肽的洗脫梯度為B(0～7％)，5min，B(7％～25％)，21-23min，B(25％～100％)，11-14min。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述防治肝病多肽的純化方法，其特征在于將鯊魚肝刺激物質(zhì)采用FPLC Mono Q色譜進(jìn)行純化，流動(dòng)相A0．01～0．02mol／L，pH8．2～8．3的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol／L NaCl的A液，用A液洗滌未結(jié)合的雜蛋白，多肽的洗脫梯度為B(0～7％)，5min，B(7％～25％)，21-23min，B(25％～100％)，11-14min。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述防治肝病的多肽，其特征在于可治療乙型肝炎、遷慢性肝炎、肝硬化、免疫性肝炎。
8．根據(jù)權(quán)利要求1所述防治肝病的多肽，其特征在于可與藥物載體組合制成藥物組合物。
9．根據(jù)權(quán)利要求1所述防治肝病的多肽，其特征在于可與其它藥物活性成份組合制成藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種源于鯊魚肝臟的刺激肝細(xì)胞再生的純的多肽的氨基酸組成和N－端氨基酸序列及其純化方法,其精確分子量為16950Da,等電點(diǎn)為5.60,紫外特征吸收峰為276nm,該多肽能治療鴨乙型肝炎病毒感染、減輕四氯化碳所致大鼠慢性肝損傷、緩解纖維化、保護(hù)小鼠免疫性損傷肝臟,其藥物組合物可作為治療乙型肝炎、遷慢性肝炎、肝硬化等嚴(yán)重肝病的有效藥物。
文檔編號A61K38/10GK1294134SQ0011906
公開日2001年5月9日 申請日期2000年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月24日
發(fā)明者吳梧桐, 郭昱, 吳文俊 申請人:中國藥科大學(xué)