專利名稱：甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于天然藥物有效成分提取領域。具體涉及到甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物及制備方法、質(zhì)量控制方法及其在醫(yī)藥和保健食品領域的應用。
背景技術：
近幾年來，人們營養(yǎng)過剩的問題日益嚴重，戒糖的呼聲越來越高，食用蔗糖過量給人們帶來的眾多危害促使科學家不斷尋找開發(fā)新型的糖源。甜葉菊葉片提取物中的甜菊苷及其它雙萜糖苷相關物作為一類高甜度、低熱值的天然甜味劑產(chǎn)品越來越受到廣大消費者的青睞。它不僅符合現(xiàn)代飲食健康的要求，而且也為糖尿病、肥胖病、高血壓、心臟病的患者提供了不誘發(fā)病情的甜味代替品，有著廣闊的發(fā)展前途。近年來，甜菊苷在食品、飲料和醫(yī)藥衛(wèi)生方面獲得了廣泛的應用，被譽為世界“第三糖源”。1985年6月我國衛(wèi)生部審定批準甜菊苷可以在各種食品、飲料及藥品中使用。
甜葉菊(Stevia Rebaudiana Bertoni.)屬菊科甜菊屬多年生草本植物，別名甜茶。甜葉菊原產(chǎn)于巴拉圭東北部與巴西接壤的阿曼拜山脈，當?shù)鼐用癜阉鳛樘鹚庯嬘靡延幸话俣嗄甑臍v史。甜葉菊性味甘、平，甜葉菊葉中富含甜葉菊苷類成分，除此之外，還含有甾醇類和黃酮類成分。目前，甜葉菊中甜菊苷類成分的制備方法國內(nèi)外均有報道，但同時提取分離制備甜葉菊葉中甜菊苷類成分和黃酮類成分，而制得甜葉菊提取物中甜菊苷類成分和黃酮類成分含量達50％以上的方法，未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種甜葉菊葉中甜菊苷類和黃酮類提取物及其制備方法。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種甜葉菊葉中甜菊苷類和黃酮類提取物作為甜昧劑、藥品輔料和矯味劑在食品、醫(yī)藥保健領域的應用。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種甜葉菊葉中甜菊苷類和黃酮類提取物可單獨作為制劑或與某些降壓降脂藥合用制成劑型，應用于醫(yī)藥保健領域。
本發(fā)明提出的甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物，是從甜葉菊葉中提取的甜菊苷類和黃酮類活性成分的組合，其中主要化合物結(jié)構(gòu)如下
本發(fā)明所述甜葉菊，來源于菊科甜菊屬多年生草本植物甜葉菊SteviaRebaudiana Bertoni.的全部植株或任何部位，如根、根莖、莖、葉、花穗、果實等，其中優(yōu)選的藥材部位為其干燥葉。
本發(fā)明所述的甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物，包含甜菊苷類和黃酮類的活性成分的組合物，這些組合物成分主要包括甜菊苷，萊鮑迪苷A；木犀草素，槲皮素，木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷，芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷，槲皮苷，槲皮素-3-O-β-D-阿拉伯糖苷，槲皮素-3-O-[4-O-反式-咖啡?；?α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷]及其衍生物等。
作為甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物，其中甜菊苷類和黃酮類成分百分含量的總和為5～100％(w/w)，其中優(yōu)選的為50～100％(w/w)。
本發(fā)明所述的甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物，除可應用于食品工業(yè)外，還可用于醫(yī)藥工業(yè)作矯味劑(矯正某些藥物的異殊、怪味)和輔料(片劑、丸劑、膠囊等)。并且由于甜菊苷可耐酸堿，在pH4～10范圍內(nèi)，100℃下加熱，其化學結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化、也不分解、不產(chǎn)生微生物所需要的葡萄糖，是屬于非發(fā)酵性物質(zhì)，也有利于食品保鮮和藥品防霉。
本發(fā)明所述的甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物可單獨制成制劑或與其他降壓、降脂藥物合用，用于高血壓、糖尿病的治療。這些制劑具有與上述甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物相同或相近的藥理活性和用途。
在本發(fā)明所述的甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物所涵蓋的各種活性成分之中，最主要的是甜菊苷、萊鮑迪苷A和黃酮類成分。
本發(fā)明還提出了所述甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物的制備工藝，它可以采用以下任意一種方法，或這些方法的任意組合進行制備(1)溶劑提取法；(2)溶劑萃取法；(3)大孔吸附樹脂法；(4)超臨界流體萃取法；(5)柱色譜法；(6)液-液逆流分配色譜法。其中優(yōu)選的方法為大孔吸附樹脂法。
在使用這些方法進行制備時，一般包括以下幾個步驟(1)提取所用溶劑可以是水或任意一種醇類、酮類及酯類溶劑，或這些溶劑按一定比例組成的混合溶劑，或由這些溶劑與酸、堿、鹽配成的酸性或堿性溶劑。提取方法可以是煎煮、加熱回流、超聲提取、冷浸、滲漉、微波提取、高壓提取等。
優(yōu)選的提取工藝為甜葉菊干燥葉片加30～90％乙醇，回流提取2～3次，每次提取1～2小時，溶劑用量為5～15倍量(L/kg)。
(2)過濾包括離心、抽濾、超濾、壓濾等方法，使用或不使用以下任意一種澄清劑或其組合醇沉劑，明膠，高嶺土，各種樹脂，聚乙二醇，聚乙三醇，殼聚糖以及天然澄清劑成品如101果汁澄清劑、ZTC+1天然澄清劑等。
(3)濃縮包括常壓或減壓條件下的薄膜蒸發(fā)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)及煎煮濃縮等。
(4)干燥包括真空干燥、噴霧干燥、冷凍干燥等。
當采用溶劑萃取法進行制備時，一般先將提取物混懸于水中，然后用低極性的酯類、烷烴類或醚類溶劑(如石油醚、乙醚、己烷、汽油、乙酸乙酯等)萃取除去脂溶性雜質(zhì)，然后用合適極性的溶劑，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是這些溶劑的混合物，萃取獲得甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物。
當采用大孔吸附樹脂法進行制備時，所用的大孔樹脂可以是非極性、弱極性、中等極性、弱堿性或弱酸性等任意一種類型，如D101、D4020、HPD400、AB-8、S-8、HZ-806等，其中優(yōu)選的為弱極性或中等極性的樹脂，如AB-8、HPD400、D101等。所用的洗脫劑為水和含水的乙醇、甲醇、丙酮等，其中優(yōu)選的為0～100％的乙醇。
優(yōu)選的甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物樹脂純化工藝為選用AB-8、HPD400等中等極性或弱極性大孔吸附樹脂作為純化用樹脂，甜葉菊乙醇提取物上樣液濃度1∶4～1∶12(以生藥量(g)∶分散毫升數(shù))，吸附流速2～9BV/h，樹脂柱徑高比1∶5～1∶10，上樣量為100～500mg/mL(以生藥量計)，0～40％乙醇洗脫1～4倍樹脂體積進行除雜，用40～90％乙醇洗脫3～6倍樹脂體積，洗脫流速為2～9BV/h。
當采用超臨界流體萃取法進行制備時，可以對甜葉菊原材料直接進行萃取，也可以對上述任一方法和步驟所獲得的產(chǎn)物進行萃取。萃取時可以使用或不使用以下任一種類溶劑及溶劑混合物水、醇類、酮類及酯類溶劑。
當采用柱色譜法進行制備時，其處理的對象可以是上述提取步驟所獲得的產(chǎn)物，也可以是經(jīng)上述溶劑提取法、溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法或超臨界流體萃取法初步純化后的產(chǎn)物。所用的固定相可以是硅膠、聚酰胺、氧化鋁、葡聚糖(Sephadex系列或Sephadex LH-20系列)、C-8、C-18、活性炭、纖維素等，所用的洗脫液因固定相的不同而不同，一般是由水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、石油醚等組成的混合溶劑。
當采用液-液逆流萃取法進行制備時，其處理的對象可以是上述提取步驟的產(chǎn)物，也可以是經(jīng)上述溶劑提取法、溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法或超臨界流體萃取法初步純化后的產(chǎn)物。一般先將提取物混懸于水中，然后用低極性的酯類、烷烴類或醚類溶劑(如石油醚、乙醚、己烷、汽油、乙酸乙酯等)萃取除去脂溶性雜質(zhì)，然后用合適極性的溶劑，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是這些溶劑的混合物，萃取獲得甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物。
該提取物可以單獨或與其它任何中西藥物或食物按任意比例配伍，用于制備藥物或功能性食品，所制得的藥物或功能性食品可以是膠囊劑、片劑、丸劑、顆粒劑、口服液、糖漿、沖劑、酒劑、注射劑、膏劑、散劑、飲料等。
本發(fā)明質(zhì)量控制方法可包括以下含量測定方法中的一種或兩種1.總黃酮精密稱取槲皮苷對照品適量(約5mg)，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。精密吸取槲皮苷對照品溶液0.5、1、2、3、3.5ml于25ml量瓶中，加5％NaNO2溶液1ml，搖勻，放置6min；然后加10％Al(NO3)3溶液1ml，搖勻，放置6min；再加4％NaOH溶液10ml，最后用稀醇稀釋定容至刻度，搖勻，放置15min，并隨行做空白對照，于506nm波長處測定吸光度。以槲皮苷對照品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。
精密稱取干燥甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物樣品各3份，每份20mg，置10mL量瓶中，加50％乙醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述樣品溶液2mL，槲皮苷對照品溶液0.5mL、3.5mL于25ml量瓶中，加5％NaNO2溶液1ml，搖勻，放置6min；然后加10％Al(NO3)3溶液1ml，搖勻，放置6min；再加4％NaOH溶液10ml，最后用稀醇稀釋定容至刻度，搖勻，放置15min，于506nm波長處測定吸光度，外標兩點法計算含量。
2.甜菊苷、萊鮑迪苷A色譜條件色譜柱Phenomenex Luna NH2(250mm*4.6mm，5μm)；流動相乙腈-水(78∶22)；流速1ml/min；檢測波長210hm；柱溫35℃。
標準曲線繪制分別精密吸取甜菊苷對照品溶液(濃度為0.67μg/μL)、萊鮑迪苷A對照品溶液(濃度為0.72μg/μL)、0、2、4、6、8、10μL注入液相色譜儀，測定各色譜峰峰面積，以對照品進樣量(μg)為橫坐標，色譜峰峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。
含量測定精密稱取3批甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物樣品各3份，每份約20mg，置10mL量瓶中，加70％乙腈超聲溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為甜菊苷、萊鮑迪苷A含量測定的供試品溶液。精密吸取上述供試品溶液5μL，注入液相色譜儀，測定各色譜峰峰面積，計算含量。
3.木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷及槲皮素-3-O-[4-O-反式-咖啡?；?α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷]色譜條件色譜柱Hypersil ODS2(250mm*4.6mm，5μm)；流動相乙腈-0.2％磷酸水梯度洗脫，17％乙腈～25％乙腈(0～30min)，25％乙腈～35％乙腈(30min～40min)；流速1.0mL/min；檢測波長254nm；柱溫35℃。
標準曲線繪制分別精密吸取木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷對照品溶液(濃度為0.082μg/μL)、槲皮苷對照品溶液(濃度為0.0232μg/μl)和槲皮素-3-O-[4-O-反式-咖啡?；?α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷](濃度為0.08μg/μL)0、2、4、6、8、10μL注入液相色譜儀，測定各色譜峰峰面積，以對照品進樣量(μg)為橫坐標，色譜峰峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。
含量測定精密稱取3批提取物樣品各3份，每份約20mg，置10mL量瓶中，加20％乙腈超聲溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷及槲皮素-3-O-[4-O-反式-咖啡?；?α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷]測定的供試品溶液。精密吸取上述供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測定各色譜峰峰面積，計算含量。
具體實施例方式
實施例1甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物制備工藝甜葉菊干燥葉片1kg，50％乙醇14L回流提取3次，每次提取1小時，減壓回收溶劑，得提取物，加水分散溶解，使水溶液濃度為1∶8(生藥量∶分散毫升數(shù))，通過4L AB-8大孔吸附樹脂，吸附流速2BV/h，樹脂柱徑高比為1∶6，上樣量為250mg/mL(以生藥量計)，水洗脫3倍樹脂體積進行除雜，50％乙醇洗脫5倍樹脂體積，洗脫流速為2BV/h，收集50％乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即為甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物。測定甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物中總黃酮含量為36％，其中木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷及槲皮素-3-O-[4-O-反式-咖啡酰基-α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷]三種成分的含量為4％。甜菊苷含量為34％，萊鮑迪苷含量為10％。
實施例2甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物制備工藝甜葉菊干燥葉片2kg，70％乙醇12L，回流提取3次，每次提取1.5小時，回收溶劑，提取物加水分散溶解，使水溶液濃度為1∶6(生藥量∶分散毫升數(shù))，通過6L AB-8大孔吸附樹脂，吸附流速4BV/h，樹脂柱徑高比為1∶7，上樣量為400mg/mL(以生藥量計)，水洗脫2倍樹脂體積進行除雜，70％乙醇洗脫4倍樹脂體積，洗脫流速為4BV/h，收集70％乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即為甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物。測定甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物中總黃酮含量為32％，其中木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷及槲皮素-3-O-[4-O-反式-咖啡?；?α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷]三種成分的含量為3％。甜菊苷含量為30％，萊鮑迪苷含量為7％。
實施例3甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物制備工藝甜葉菊干燥葉片10kg，70％乙醇12L回流提取2次，每次提取2小時，回收溶劑，提取物加水分散溶解，使水溶液濃度為1∶4(生藥量∶分散毫升數(shù))，通過7LAB-8大孔吸附樹脂，吸附流速4BV/h，樹脂柱徑高比為1∶9，上樣量為350mg/mL(以生藥量計)，水洗脫4倍樹脂體積進行除雜，90％乙醇洗脫4倍樹脂體積，洗脫流速為4BV/h，收集90％乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即為甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物。測定甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物中總黃酮含量為30％，其中木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷及槲皮素-3-O-[4-O-反式-咖啡?；?α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷]三種成分的含量為3％。甜菊苷含量為40％，萊鮑迪苷含量為15％。
實施例4甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物制備工藝甜葉菊干燥葉片10kg，70％乙醇12L回流提取2次，每次提取2小時，回收溶劑，提取物加水分散溶解，使水溶液濃度為1∶10(生藥量∶分散毫升數(shù))，通過7L AB-8大孔吸附樹脂，吸附流速4BV/h，樹脂柱徑高比為1∶4，上樣量為150mg/mL(以生藥量計)，水洗脫2倍樹脂體積進行除雜，70％乙醇洗脫4倍樹脂體積，洗脫流速為2.0mL/min，收集70％乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即為甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物。測定甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物中總黃酮含量為31％，其中木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷及槲皮素-3-O-[4-O-反式-咖啡?；?α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷]三種成分的含量為3％。甜菊苷含量為30％，萊鮑迪苷含量為12％。
實施例5甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物片的制備甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物100g
淀粉100g上述組分混合均勻，加滑石粉適量，壓制成1000片。
實施例6甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物復方制劑的制備甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物50g枳實總黃酮提取物50g銀杏提取物 100g上述組分混合均勻，裝入硬明膠膠囊中，共2000粒膠囊。
權利要求
1.一種甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物，其特征在于該提取物由甜葉菊中提取獲得，并含有以下主要成分甜菊苷，萊鮑迪苷A，木犀草素，槲皮素，木犀草素-7-O-β-D葡萄糖苷，芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷，槲皮苷，槲皮素-3-O-β-D-阿拉伯糖苷，槲皮素-3-O-[4-O-反式-咖啡?；?α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷]及其衍生物等。
2.如權利要求1所述的甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物，其特征在于甜葉菊為菊科甜菊屬多年生草本植物甜葉菊Stevia Rebaudiana Bertoni.的全部植株或任何部位，如根、根莖、莖、葉、花穗、果實等。
3.如權利要求1所述的甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物，其特征在于上述甜菊苷類和黃酮類成分含量總和以重量計為5～100％。
4.如權利要求3所述的甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物，其特征在于甜菊苷、萊鮑迪苷及總黃酮的含量占全部甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物含量以重量計為5～100％。
5.如權利要求1所述的甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物，其特征在于上述甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物可應用于食品工業(yè)，還可用于醫(yī)藥工業(yè)作矯味劑(矯正某些藥物的異殊、怪味)和輔料(片劑、丸劑、膠囊等)，以及用于食品保鮮和藥品防霉等。
6.如權利要求1～5所述的甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物，其特征在于采用溶劑提取法、溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法、超臨界流體萃取法、柱色譜法、液-液逆流分配色譜法等任意一種方法，或這些方法的任意組合進行制備。
7.如權利要求6所述的甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物制備方法，其特征在于，在使用這些方法進行制備時，包括以下一個或幾個步驟提取所用溶劑可以是水或任意一種醇類、酮類及酯類溶劑，或這些溶劑按一定比例組成的混合溶劑，或由這些溶劑與酸、堿、鹽配成的酸性或堿性溶劑；提取方法可以是煎煮、加熱回流、超聲提取、冷浸、滲漉、微波提取、高壓提取等；過濾包括離心、抽濾、超濾、壓濾等方法，使用或不使用以下任一種澄清劑或其組合醇沉劑，明膠，高嶺土，各種樹脂，聚乙二醇，聚乙三醇，殼聚糖以及天然澄清劑成品如101果汁澄清劑、ZTC+1天然澄清劑等；濃縮包括常壓或減壓條件下的薄膜蒸發(fā)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)及煎煮濃縮等；干燥包括真空干燥、噴霧干燥、冷凍干燥等。
8.如權利要求6所述的甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物制備方法，其特征在于當使用大孔吸附樹脂法時，所用的大孔樹脂可以是非極性、弱極性、中等極性、弱堿性或弱酸性等任何一種類型，如D101、D4020、HPD400、AB-8、S-8、HZ-806等，其中優(yōu)選的為弱極性或中等極性的樹脂，如AB-8、HPD400、D101等，所用的洗脫劑為水和含水的乙醇、甲醇、丙酮等。
9.如權利要求8所述的甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物制備方法提取物制備方法，其特征在于選用AB-8、HPD400等中等極性或弱極性大孔吸附樹脂作為純化用樹脂，甜葉菊乙醇提取物以生藥量(g)分散毫升數(shù)計的上樣液濃度1∶2～1∶14，吸附流速2～9BV/h，樹脂柱徑高比1∶5～1∶10，以生藥量計的上樣量為100～300mg/mL，0～20％乙醇洗脫1～4倍樹脂體積進行除雜，用40～90％乙醇洗脫3～6倍樹脂體積，洗脫流速為2～9BV/h。
10.如權利要求1～5所述的提取物的應用，其特征在于，該提取物可以單獨或與其它任何中西藥物或食物按任意比例配伍，用于制備藥物或功能性食品，所制得的藥物或功能性食品可以是膠囊劑、片劑、丸劑、顆粒劑、口服液、糖漿、沖劑、酒劑、注射劑、膏劑、散劑、飲料等。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從甜葉菊中提取得到的甜菊苷類和黃酮類提取物及其制備方法。該提取物主要包括甜菊苷，萊鮑迪苷A，木犀草素，槲皮素，木犀草素－7－O－β－D葡萄糖苷，芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖苷，槲皮苷，槲皮素－3－O－β－D－阿拉伯糖苷，槲皮素－3－O－[4－O－反式－咖啡酰基－α－L－鼠李糖－(1→6)－β－D－半乳糖苷]及其衍生物等。該提取物可由溶劑提取法、溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法、超臨界流體萃取法、柱色譜法、液－液逆流分配色譜法等任意一種方法，或這些方法的任意組合制備獲得。所制得的甜葉菊甜菊苷類和黃酮類提取物中各種甜菊苷類和黃酮類成分百分含量的總和為5～100％(w/w)，其中甜菊苷、萊鮑迪苷A兩種甜菊苷類和木犀草素－7－O－β－D－葡萄糖苷、槲皮苷、槲皮素－3－O－[4－O－反式－咖啡?；粒璍－鼠李糖－(1→6)－β－D－半乳糖苷]三種黃酮類成分的含量之和為5～100％(w/w)。
文檔編號A61P3/06GK101062078SQ20071011131
公開日2007年10月31日 申請日期2007年6月18日 優(yōu)先權日2007年6月18日
發(fā)明者石任兵, 劉斌, 姜華 申請人:石任兵, 劉斌