專利名稱：具有抗腫瘤活性的金鐵鎖總皂苷及其制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種金鐵鎖有效部位一總皂苷在抗腫瘤作用方面的應(yīng)用及其制劑。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤一直是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一?？鼓[瘤藥物的藥物毒性及不良反應(yīng)也越來(lái)越受到重視。世界各國(guó)科研人員一直在為尋找具備一定選擇性抗腫瘤的候選藥物而不懈努力。尋求毒副作用小、抗腫瘤作用強(qiáng)，具有一定選擇性抗腫瘤的藥物是目前和將來(lái)的研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)。天然藥物是理想的抗腫瘤候選藥物篩選的一大寶庫(kù)，如紫杉醇、喜樹堿等一批具有較強(qiáng)抗腫瘤活性的天然藥物被篩選出來(lái)，表現(xiàn)出了較好的臨床療效和應(yīng)用前景。因此，鑒于我國(guó)自然草藥資源豐富，民族、民間草藥用藥經(jīng)驗(yàn)廣泛的特點(diǎn)，從民族民間用藥中篩選出毒副作用小、抗腫瘤作用強(qiáng)的藥物及其有效部位，具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢(shì)。在從民族民間藥物中篩選抗腫瘤活性的候選藥物的過(guò)程中，首次發(fā)現(xiàn)了苗族藥物金鐵鎖具有很強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞和實(shí)體瘤生長(zhǎng)的作用，而對(duì)正常細(xì)胞和小鼠體重等方面的影響明顯，這是一個(gè)令人興奮的重要發(fā)現(xiàn)。金鐵鎖PsammosiIenetunicoides W. C. Wu et C. Y. Wu 為石竹科單屬種植物，別名獨(dú)定子、蜈蚣七、對(duì)葉七、白馬分鬃等，主要分布于貴州、云南、四川、西藏等中國(guó)西南地區(qū)， 是苗族民間常用藥物之一。其功效具有散淤定痛，止血，消癰排膿等作用。主治跌打損傷， 風(fēng)濕，胃痛，癰疽瘡癤，創(chuàng)傷出血等。主要化學(xué)成分含有三萜、三萜皂苷、環(huán)肽以及內(nèi)酰胺以及氨基酸和有機(jī)酸等，藥理作用主要集中在鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫和抗類風(fēng)濕等幾個(gè)方面。在本發(fā)明之前，尚未見有金鐵鎖抗腫瘤作用及臨床運(yùn)用方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供金鐵鎖具有抗腫瘤作用有效部位-總皂苷及制備方法；本發(fā)明的目的之二是提供金鐵鎖總皂苷藥物制劑的制備方法；本發(fā)明的目的之三是提供金鐵鎖的抗腫瘤作用的新用途及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明金鐵鎖總皂苷的制備方法取金鐵鎖藥材粉碎后，經(jīng)乙醇70°C _95°C回流提取1-3次，每次1-3小時(shí)，合并提取液，減壓回收乙醇得浸膏。取浸膏以2倍量的水溶解后， 以正丁醇萃取3次，合并正丁醇層，減壓蒸干溶劑后得金鐵鎖總皂苷粗提物；然后將金鐵鎖總皂苷粗提物用低碳醇溶解，過(guò)大孔吸附樹脂柱，以梯度乙醇-水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，再用TLC方法監(jiān)測(cè)流出產(chǎn)物，收集含金鐵鎖總皂苷的流出產(chǎn)物；合并洗脫液，減壓濃縮去除溶劑，冷凍或噴霧干燥至粉，得金鐵鎖總皂苷。本發(fā)明的藥物制劑含有-99%的金鐵鎖總皂苷和99% -1%的賦形劑，優(yōu)選含有20% -80%的賦形劑，最好含有40% -60%的金鐵鎖總皂苷和60% -40%的賦形劑。按照藥劑學(xué)制備工藝和方法，可以將本發(fā)明的金鐵鎖總皂苷制備成多種抗腫瘤藥物的臨床應(yīng)用劑型，包括口服制劑和非腸道給藥劑型。所指的口服機(jī)制包括片劑、膠囊劑、脂質(zhì)體、滴丸、緩控釋劑、微孔滲透、薄膜包衣、乳劑、顆粒劑、口崩片中的任何一種；非腸道給藥劑型包括注射劑、粉針劑中的任何一種。本發(fā)明通過(guò)體外腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，初篩金鐵鎖總皂苷的抗腫瘤作用的藥理學(xué)活性并評(píng)價(jià)其作用效價(jià)，然后通過(guò)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其抗腫瘤作用及強(qiáng)度。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)篩選了金鐵鎖總皂苷對(duì)胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌共5種腫瘤細(xì)胞抑制作用及其效價(jià)，同時(shí)比較的研究其對(duì)正常脾淋巴細(xì)胞抑制作用情況，考察了金鐵鎖總皂苷其對(duì)腫瘤細(xì)胞株殺傷作用的選擇性和敏感性，分析了其對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性抑制作用，以及對(duì)正常細(xì)胞生長(zhǎng)有無(wú)明顯影響。通過(guò)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，分析了金鐵鎖總皂苷對(duì)S18tl小鼠實(shí)體瘤生長(zhǎng)的抑制作用以及對(duì)小鼠體重的影響。


圖1是金鐵鎖總皂苷(TSPT)及各給藥組小鼠S18tl瘤體大小的比較中“生理鹽水”是指生理鹽水給藥組；“TSPT大劑量”、“TSPT中劑量”、“TSPT小劑量” 分別是指金鐵鎖總皂苷分別為10mg/kg、5mg/kg、2. 5mg/kg的給藥劑量組；“順鉬”是指陽(yáng)性對(duì)照藥順鉬給藥組。具體實(shí)施例如下實(shí)施例1金鐵鎖總皂苷的制備方法優(yōu)化后的提取條件是取金鐵鎖藥材3kg，以8倍量體積為95%的乙醇76°C條件下回流提取3次，每次lh，合并提取液，減壓回收乙醇至干，然后將金鐵鎖提取物用低碳醇溶解，過(guò)大孔吸附樹脂柱，分別以10 %，30 %，50 %，70 %，90 %乙醇-水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮去除溶劑，冷凍或噴霧干燥至粉，得金鐵鎖總皂苷151. 3g。實(shí)施例2金鐵鎖總皂苷對(duì)體外5種腫瘤細(xì)胞的抑制作用細(xì)胞乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、人結(jié)腸癌細(xì)胞C26、人肝癌細(xì)胞BEL-7401、人卵巢癌細(xì)胞(SK0V3)、人胃癌細(xì)胞(BGC-823)，上述5種腫瘤細(xì)胞均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院提供。藥品與試劑金鐵鎖總皂苷，由北京中醫(yī)藥大學(xué)分子生藥實(shí)驗(yàn)室提供，白色粉末，青霉素(Sigma, USA)、鏈霉素(Sigma, USA)；胰蛋白酶(Sigma, USA)、RPMI1640 培養(yǎng)基(Gibco, Invitragen co.，USA)；胎牛血清(Gibco, Invitragen co.，USA) ；二甲基亞砜(DMSO) (Sigma, USA)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT) (Sigma, USA)。培養(yǎng)條件溫度37°C、濕度 100%、含5%二氧化碳空氣中培養(yǎng)。儀器:C02培養(yǎng)箱(Thermo 311型)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；倒置熒光顯微鏡(BDS200型)；酶標(biāo)自動(dòng)分析儀(華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限公司)；臺(tái)式離心機(jī) (Anke7DL-50B型)；高壓滅菌鍋(日本森展企業(yè)有限公司)；冰箱(Hisense 225U型)；電熱恒溫干燥箱(中興202型)實(shí)驗(yàn)方法，MTT法各種腫瘤細(xì)胞株按照常規(guī)方法培養(yǎng)傳代，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度；取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入細(xì)胞懸液180 μ L (3000個(gè)/孔)， 于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)池。金鐵鎖總皂苷溶解在生理鹽水中，終濃度為4 μ g/mL、 16 μ g/mL,64 μ g/mL,256 μ g/mL、512 · μ g/mL,各 20 μ L/ 孔，每濃度 8 個(gè)復(fù)孔，正常對(duì)照組加入等量1640培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)順鉬陽(yáng)性對(duì)照20μ L，終濃度為312μ g/mL，于37°C，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入200 μ L MTT溶液(原液5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。 棄去MTT，每孔加入200 μ L 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD 540nm處測(cè)量各孔的吸光值。計(jì)算抑制率和IC5tl值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(見表1)，金鐵鎖皂苷1. 6 μ g/mL對(duì)部分腫瘤細(xì)胞株如人胃癌細(xì)胞 (BGC-823)、和乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的增殖沒有明顯的抑制作用，但隨著藥物劑量的增加至 6. 4 μ g/mL、25. 6 μ g/mL、52. 1 μ g/mL時(shí)，對(duì)各腫瘤細(xì)胞株均呈現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)抑制作用，并具有一定的濃度依賴關(guān)系，最高抑制率達(dá)71. 4% (人胃癌細(xì)胞株BGC-82;3)和71. 9% (人結(jié)腸癌細(xì)胞C26)。數(shù)據(jù)還顯示，人結(jié)腸癌細(xì)胞以6對(duì)金鐵鎖總皂苷最為敏感，IC50值最小僅為9. 02 μ g/mL，說(shuō)明金鐵鎖總皂苷抗癌作用效價(jià)較強(qiáng)，作用強(qiáng)度接近臨床常用化療西藥如順鉬等。表1金鐵鎖總皂苷對(duì)5種腫瘤細(xì)胞的抑制率及IC5tl值
P制率(%)
金鐵鎖總皂苷(Me/niL)
IC50
細(xì)胞株1.66.425.651.2BGC-8230.067.071.471.019.,85Bel-740113.039.854.155.423.,79SK0V315.955.457.158.815.,64MCF-70.058.763.258.323.,26C2624.250.871.963.59.02實(shí)施例3金鐵鎖總皂苷對(duì)正常脾細(xì)胞的作用脾細(xì)胞免疫細(xì)胞培養(yǎng)6 8周齡昆明小鼠，頸椎脫臼處死，75 %乙醇浸泡3min，取出小鼠置于無(wú)菌紙上， 左腹側(cè)朝上；在小鼠左腹側(cè)中部剪開小口，撕開皮膚，暴露腹壁，可見紅色長(zhǎng)條狀脾臟；在脾臟下側(cè)提起腹膜，剪開后上翻，暴露脾臟，用鑷子提起脾臟，眼科剪分離脾臟下面的結(jié)締組織，取出脾臟。放入盛有5mL Hanks液的培養(yǎng)皿中；將脾臟放置不銹鋼網(wǎng)QOO目)上， 用注射器針芯輕輕研壓脾臟，獲細(xì)胞懸液。培養(yǎng)液10%小牛血清、青霉素lOOu/mL、鏈霉素 100u/mL的RPMI 1640。培養(yǎng)條件溫度37°C、濕度100%、含5%二氧化碳空氣中培養(yǎng)。細(xì)胞增殖檢測(cè)取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入細(xì)胞懸液10(^1^，濃度3\105個(gè)/1^，371，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)濁。終濃度為 32μ g/mL、6. 4μ g/mL、8. Ομ g/mL、12. 8μ g/mL、25. 6g/mL，各 10 μ L/孔，每濃度8個(gè)復(fù)孔，正常對(duì)照組只加入等量的溶媒(30%乙醇-NaCl溶液)，同時(shí)設(shè) ConA陽(yáng)性對(duì)照組ConA 10 μ L，終濃度為5 μ g/mL,于37°C ,5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。每孔加入20 μ L MTT溶液(原液5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄去培養(yǎng)液，用PBS沖2-3遍(根據(jù)細(xì)胞貼壁情況確定是否沖洗)，每孔加入100 μ L 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD 540nm處測(cè)量各孔的吸光值。增殖率=(處理組OD值一對(duì)照組OD值)/對(duì)照組OD值X 100%實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(見表2)，金鐵鎖總皂苷在6. 4 μ g/mL時(shí)開始出現(xiàn)對(duì)脾淋巴細(xì)胞的輕微抑制作用，但這種作用較小，當(dāng)劑量高達(dá)51. 2 μ g/mL時(shí)，其抑制率僅為2. 1%，與相同劑量對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率71. 0%相比(參見表1)，金鐵鎖總皂苷對(duì)正常細(xì)胞的這種抑制作用顯得微不足道。由實(shí)施例2和實(shí)施例3可知，金鐵鎖總皂苷對(duì)腫瘤細(xì)胞具有選擇性細(xì)胞毒作用，而對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性相對(duì)較小。表2金鐵鎖總皂苷對(duì)脾細(xì)胞的增殖抑制作用
權(quán)利要求
1.苗藥金鐵鎖抗腫瘤活性有效部位，其特征在于其有效部位提取物為總皂苷，其基本母核結(jié)構(gòu)為齊墩果烷型五環(huán)三萜類化合物，該提取物中金鐵鎖總皂苷含量在50%以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金鐵鎖總皂苷，其特征在于所提取溶劑為乙醇、水及其不同的配比。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金鐵鎖總皂苷，所述提取方法為回流提取，提取溫度為 70-100°C，至少提取一次，每次時(shí)間為40分鐘-1小時(shí)。
4.一種用于腫瘤治療的藥物制劑，其特征在于含有抗腫瘤作用的有效劑量的金鐵鎖總皂苷和一種或多種藥學(xué)上可以接受的賦形劑，或可以與金鐵鎖總皂苷租方的其它藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制劑，其特征在于含有-99%的金鐵鎖總皂苷和 99% -1%的藥用賦形劑或其它可組方的藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物制劑，其特征在于所說(shuō)的藥物制劑是指非腸道給藥或口服類制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物制劑，其特征在于所說(shuō)的口服制劑選自于片劑、膠囊劑、 脂質(zhì)體、滴丸、緩控釋劑、微孔滲透泵、薄膜包衣、乳劑、顆粒劑、口崩片的任何一種；非腸道給藥的劑型選自于注射劑、粉針劑當(dāng)中的任何一種。
8.金鐵鎖總皂苷在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其特征在于所說(shuō)的抗腫瘤活性是指抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和抑制實(shí)體瘤的生長(zhǎng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其特征在所說(shuō)的腫瘤細(xì)胞包括5種乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、 人結(jié)腸癌細(xì)胞C26、人肝癌細(xì)胞BEL-7401、人卵巢癌細(xì)胞(SK0V3)、人胃癌細(xì)胞<(BGC-823)； 所說(shuō)的實(shí)體瘤為S180的小鼠移植性腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種苗族藥物金鐵鎖抗腫瘤作用的新用途，同時(shí)公開了其抗腫瘤活性藥用部位的制備方法及其制劑。制備方法主要經(jīng)過(guò)乙醇提取，濃縮，正丁醇萃取、大孔吸附樹脂純化等步驟獲得金鐵鎖總皂苷。以總皂苷為原料，制備成片劑、膠囊劑、注射劑等臨床常用的藥物制劑。藥效學(xué)評(píng)價(jià)采用體內(nèi)外結(jié)合的方法。體外試驗(yàn)顯示，TSPT對(duì)胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤，6種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)正常脾淋巴細(xì)胞抑制不明顯；整體動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該藥對(duì)S180實(shí)體瘤抑制率高達(dá)72％，作用效價(jià)高，而對(duì)小鼠體重影響不大；與陽(yáng)性藥順鉑比，副作用較低。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該藥抗癌效價(jià)強(qiáng)、副作用低，具備原始創(chuàng)新的優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102232988SQ20111016384
公開日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2011年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月17日
發(fā)明者劉春生, 張?jiān)?, 張園園, 王學(xué)勇, 王秀麗, 趙保勝, 高偉 申請(qǐng)人:王學(xué)勇