專利名稱：環(huán)磷酰胺和人參皂甙在制備治療尖銳濕疣藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療尖銳濕疣的藥物，具體地說涉及環(huán)磷酰胺聯(lián)合人參皂苷在制備治 療尖銳濕疣藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
尖銳濕疣主要是由人乳頭瘤病毒(HPV)6型和11型感染所致的一類極為常見的性 傳播性疾病，目前常用的C02激光治療、冷凍治療、手術(shù)切除等治療方法均不能有效清除殘 余病毒并控制復(fù)發(fā)。這是由于人乳頭瘤病毒對(duì)人體而言屬于完全異己的生物體，機(jī)體免疫 系統(tǒng)對(duì)其可產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫排斥反應(yīng)，而過強(qiáng)的免疫排斥反應(yīng)會(huì)造成對(duì)自身組織的攻擊， 從而導(dǎo)致自身免疫性疾病。因此，為了避免這種情況，機(jī)體免疫系統(tǒng)進(jìn)化出一套對(duì)免疫排 斥反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)的機(jī)制，其核心是免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了一類被稱為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫細(xì)胞亞 群。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群能夠強(qiáng)烈地抑制機(jī)體排斥異己生物體的免疫排斥反應(yīng)?，F(xiàn)已知道，人 乳頭瘤病毒HPV感染可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在尖銳濕疣部位聚集，受其免疫抑制作用的影響， 使得機(jī)體免疫系統(tǒng)不能有效清除感染的HPV，從而導(dǎo)致尖銳濕疣的發(fā)生及治療后的復(fù)發(fā)。為 此，中國(guó)專利申請(qǐng)“環(huán)磷酰胺在治療尖銳濕疣中的應(yīng)用”(申請(qǐng)?zhí)?00910272393.0)公開了 一種將抗腫瘤化學(xué)藥物環(huán)磷酰胺用于治療尖銳濕疣的方法，在低劑量通過調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫 功能，對(duì)尖銳濕疣產(chǎn)生良好的治療效果，顯示出良好的應(yīng)用前景，但單一的環(huán)磷酰胺仍然不 能完全控制尖銳濕疣的復(fù)發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種環(huán)磷酰胺和人參皂苷在制備治療尖銳濕疣藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述治療尖銳濕疣藥物為含有環(huán)磷酰胺和人參皂苷及制藥學(xué)上可接受的 輔料制成的藥物制劑。上述藥物制劑為片劑。上述藥物制劑的每制劑單位中的環(huán)磷酰胺和人參皂苷的含量分別為50mg和 50mgo上述含有環(huán)磷酰胺和人參皂苷及制藥學(xué)上可接受的輔料的藥物制劑采用常規(guī)的 制備方法制成片劑。上述含有環(huán)磷酰胺和人參皂苷的片劑以口服方式給尖銳濕疣患者服用，具體為 每天一次，每次一片(每片含環(huán)磷酰胺和人參皂甙各50mg)，連續(xù)7天；或者每天一次，每 次一片，連續(xù)7天，間隔7天后，再連續(xù)服用7天。如前所述，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在尖銳濕疣組織中大量聚集，從而抑制裂解HPV病毒的免 疫細(xì)胞的活性。但是，解除調(diào)節(jié)性τ細(xì)胞的抑制作用并不意味著針對(duì)HPV病毒的免疫細(xì)胞 可以被充分激活。因此，采用聯(lián)合方式，即消除尖銳濕疣組織中聚集的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞并同時(shí) 活化針對(duì)抗HPV病毒的免疫細(xì)胞，將能充分調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫功能，從而可有效殺傷HPV病毒感染的細(xì)胞，并清除病毒。由于機(jī)體細(xì)胞本身具有對(duì)少量的環(huán)磷酰胺進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，使之變 為無毒物質(zhì)的功能，而高劑量使用環(huán)磷酰胺則會(huì)克服細(xì)胞的這種解毒功能，并通過與細(xì)胞 的DNA交聯(lián)，從而誘發(fā)細(xì)胞死亡。因此，作為臨床常用的抗腫瘤化學(xué)藥物，在高劑量(200mg) 使用環(huán)磷酰胺時(shí)即可殺傷機(jī)體免疫細(xì)胞從而誘導(dǎo)免疫抑制。研究證實(shí)，低劑量的環(huán)磷酰胺 僅對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞進(jìn)行殺傷，對(duì)其它免疫細(xì)胞則無作用，即低劑量(50mg)使用環(huán)磷酰胺時(shí) 可增強(qiáng)免疫。人參在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)作為藥材使用已有2000多年歷史，作為人參主要活性成 分的人參皂甙，其一個(gè)重要作用機(jī)理就是對(duì)機(jī)體免疫細(xì)胞具有激活作用。本發(fā)明正是據(jù)此 提出，將環(huán)磷酰胺聯(lián)合人參皂苷應(yīng)用在制備治療尖銳濕疣藥物中，即給尖銳濕疣患者服用 含低劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙的藥物，不但可消除尖銳濕疣組織中聚集的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞， 并且可同時(shí)增強(qiáng)針對(duì)抗HPV病毒的免疫細(xì)胞的活性，從而有效調(diào)動(dòng)機(jī)體產(chǎn)生有效抗人乳頭 瘤病毒HPV的免疫應(yīng)答。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，低劑量的環(huán)磷酰胺聯(lián)合人參皂苷可有效清除尖銳濕 疣患者所感染的人乳頭瘤病毒，對(duì)尖銳濕疣產(chǎn)生良好治療作用，并可防止其復(fù)發(fā)，而且對(duì)尖 銳濕疣患者肝腎功能均不產(chǎn)生影響，無明顯的毒副作用，顯示環(huán)磷酰胺聯(lián)合人參皂甙在治 療尖銳濕疣中所具有的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。


圖1人參皂甙不影響低劑量環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的清除。圖2人參皂甙增強(qiáng)低劑量環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠體內(nèi)效應(yīng)性T細(xì)胞的活化作用。圖3人參皂甙增強(qiáng)低劑量環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠體內(nèi)自然殺傷NK細(xì)胞的活化作用。圖4聯(lián)合服用低劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙不影響小鼠的肝腎功能。圖5聯(lián)合服用低劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙顯著降低尖銳濕疣患者外周血調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞數(shù)量。圖6聯(lián)合服用低劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙不影響尖銳濕疣患者外周血總T細(xì)胞數(shù)量。圖7聯(lián)合服用低劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙不影響尖銳濕疣患者外周血外周血NK 細(xì)胞數(shù)量。圖8聯(lián)合服用低劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙增強(qiáng)尖銳濕疣患者T細(xì)胞非特異性增殖。圖9聯(lián)合服用低劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙增強(qiáng)尖銳濕疣患者HPV特異性T細(xì)胞增殖。圖10聯(lián)合服用低劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙增強(qiáng)尖銳濕疣患者NK細(xì)胞對(duì)HPV感染 細(xì)胞的殺傷。圖11與單獨(dú)低劑量環(huán)磷酰胺相比，聯(lián)合服用低劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙對(duì)尖銳 濕疣具有更好的治療效果。圖12聯(lián)合服用低劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙服用低劑量環(huán)磷酰胺不影響尖銳濕疣 患者的肝腎功能。
具體實(shí)施例方式為了證實(shí)環(huán)磷酰胺聯(lián)合人參皂甙對(duì)尖銳濕疣具有治療作用，并可防止其復(fù)發(fā)，且無明顯的毒副作用，下面結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1 見圖1，人參皂甙不影響低劑量環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的清 除。給小鼠腹腔注射生理鹽水或0. 5mg環(huán)磷酰胺或0. 5mg的環(huán)磷酰胺和人參皂甙，每天一 次，共7天。解剖小鼠，研磨脾組織，制備單個(gè)脾細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù) 量，結(jié)果顯示，人參皂甙不影響低劑量環(huán)磷酰胺對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞清除(見圖中上部分所示)； 另外，取少量脾細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性標(biāo)志Foxp3和內(nèi)參GAPDH(見圖 中下部分所示)。實(shí)施例2 見圖2-3，人參皂甙增強(qiáng)低劑量環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠體內(nèi)效應(yīng)性T細(xì)胞和自 然殺傷NK細(xì)胞的活化作用。給小鼠腹腔注射生理鹽水或0. 5mg環(huán)磷酰胺或0. 5mg的環(huán)磷 酰胺和人參皂甙，每天一次，共7天。解剖小鼠，研磨脾組織，制備單個(gè)脾細(xì)胞，進(jìn)行T細(xì)胞 增殖試驗(yàn)和NK細(xì)胞活化試驗(yàn)。圖2對(duì)培養(yǎng)的脾細(xì)胞中加入抗CD3和CD28的抗體，60小時(shí) 后，進(jìn)行氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)標(biāo)記檢測(cè)T細(xì)胞的增殖。與安慰劑和低劑量環(huán)磷酰 胺組相比，人參皂甙聯(lián)合環(huán)磷酰胺顯著增強(qiáng)T細(xì)胞增殖(p*<0.05)。圖3采用抗DX5(泛 NK細(xì)胞標(biāo)志)抗體磁珠分離的方法，分離并體外加入白介素_2培養(yǎng)NK細(xì)胞。24小時(shí)后， ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清Y-干擾素的水平。實(shí)施例3 見圖4，低劑量環(huán)磷酰胺聯(lián)合人參皂甙不影響小鼠的肝腎功能。給小鼠 腹腔注射一周低劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙。于服用后第1、7、14、30天，檢測(cè)小鼠血中谷丙 轉(zhuǎn)氨酶和肌酐含量。與對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺聯(lián)合人參皂甙組血中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和肌酐含量 沒有變化。圖4顯示為第7天所檢測(cè)結(jié)果，其中實(shí)驗(yàn)組η = 18，對(duì)照組η = 18。實(shí)施例4 見圖5-7，聯(lián)合服用低劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙選擇性清除尖銳濕疣 患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。尖銳濕疣患者聯(lián)合服用50mg低劑量環(huán)磷酰胺和50mg人參皂甙(η = 18)或者服用安慰劑(η =18)。7天后，取患者外周血進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。與安慰劑組 相比，低劑量和高劑量環(huán)磷酰胺組均能顯著降低患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)目(圖5，ρ* < 0. 05)，但對(duì)總T細(xì)胞(圖6)和NK細(xì)胞(圖7)的水平不產(chǎn)生影響。實(shí)施例5 見圖8-10，聯(lián)合服用低劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙增強(qiáng)尖銳濕疣患者抗 HPV病毒免疫反應(yīng)。尖銳濕疣患者聯(lián)合服用50mg低劑量環(huán)磷酰胺和50mg人參皂甙7天。 第8天取其外周血并分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，進(jìn)行T細(xì)胞增殖試驗(yàn)、和NK細(xì)胞對(duì)HPV感 染細(xì)胞的殺傷試驗(yàn)。圖8對(duì)培養(yǎng)的PBMCs中加入抗CD3和CD28的抗體，72小時(shí)后，進(jìn)行氚 標(biāo)記胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)標(biāo)記檢測(cè)T細(xì)胞的增殖。與安慰劑組相比，治療組的T細(xì)胞增 殖顯著增強(qiáng)(P* < 0. 05)。圖9對(duì)培養(yǎng)的PBMCs中加入尖銳濕疣的裂解物，96小時(shí)后，進(jìn)行 3H-TdR標(biāo)記檢測(cè)病毒特異性T細(xì)胞的增殖。與安慰劑組相比，治療組的特異性T細(xì)胞增殖 顯著增強(qiáng)(P* < 0. 05)。圖10采用NK細(xì)胞分離試劑盒從PBMCs中分離NK細(xì)胞。分別進(jìn)行 NK細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞敏感的K526白血病細(xì)胞和所分離的疣體細(xì)胞的殺傷試驗(yàn)。與安慰劑組相 比，治療組具有更強(qiáng)的殺傷作用(P* < 0. 05)。實(shí)施例6 見圖11，聯(lián)合服用低劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙低劑量環(huán)磷酰胺防止尖 銳濕疣的復(fù)發(fā)。對(duì)大的多發(fā)性尖銳濕疣組織進(jìn)行二氧化碳激光治療后，給患者聯(lián)合服用低 劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙(η = 24)、單獨(dú)服用低劑量環(huán)磷酰胺(η = 24)、安慰劑(η = 18)。 隨訪28周，安慰劑組復(fù)發(fā)率為94. 4%，聯(lián)合服用組復(fù)發(fā)率為16. 7%，而單獨(dú)服用組復(fù)發(fā)率 為33. 3%。比較聯(lián)合組和單獨(dú)組，Kaplan-Meier統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P < 0. 05，表明低劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙聯(lián)合治療具有更好的療效。實(shí)施例7 見圖12，聯(lián)合服用低劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙不影響尖銳濕疣患者的 肝腎功能。尖銳濕疣患者聯(lián)合服用一周的低劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙。于服用后第1、7、 14、30天，檢測(cè)患者血中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和肌酐含量。與安慰劑組比較，治療組血中谷丙轉(zhuǎn)氨酶 和肌酐含量沒有變化。圖13顯示為第7天所檢測(cè)結(jié)果，其中低劑量組η = 18，安慰劑組η =18。實(shí)施例8 聯(lián)合服用低劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙對(duì)小的尖銳濕疣的治療作用。小 的尖銳濕疣患者聯(lián)合服用50mg低劑量環(huán)磷酰胺和50mg人參皂甙7天。結(jié)果顯示，小的尖 銳濕疣顯著消退。實(shí)施例9 聯(lián)合服用低劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙防止大的尖銳濕疣的復(fù)發(fā)。對(duì)大 的多發(fā)性尖銳濕疣組織進(jìn)行二氧化碳激光治療后，給患者聯(lián)合服用50mg低劑量環(huán)磷酰胺 和50mg人參皂甙，服用一周，能夠有效防止復(fù)發(fā)。實(shí)施例10 藥物制劑的制備，所用環(huán)磷酰胺和人參皂甙可為商品購(gòu)買，輔料可采 用β _環(huán)糊精作為包裹物，并加入蔗糖或淀粉，按照常規(guī)的制備方法制備片劑，其中，每片 含環(huán)磷酰胺和人參皂甙各50mg?？诜鲜鲋频玫暮械蛣┝凯h(huán)磷酰胺和人參皂甙的片劑時(shí)，每天一次，每次一片， 連續(xù)7天；或者每天一次，每次一片，連續(xù)7天，間隔7天后，再連續(xù)服用7天。
權(quán)利要求
環(huán)磷酰胺和人參皂甙在制備治療尖銳濕疣藥物中的應(yīng)用。
2.一種治療尖銳濕疣的藥物制劑，其特征在于它含有環(huán)磷酰胺和人參皂甙及制藥學(xué) 上可接受的輔料。
3.按權(quán)利要求2所述的治療尖銳濕疣的藥物制劑，其特征在于所述藥物制劑是片劑。
4.按權(quán)利要求2或3所述的治療尖銳濕疣的藥物制劑，其特征在于所述藥物制劑的 每制劑單位中的環(huán)磷酰胺和人參皂苷的含量分別為50mg和50mg。
全文摘要
本發(fā)明公開了環(huán)磷酰胺和人參皂甙在制備治療尖銳濕疣藥物中的應(yīng)用。將環(huán)磷酰胺聯(lián)合人參皂苷應(yīng)用在制備治療尖銳濕疣藥物中，即給尖銳濕疣患者服用含低劑量環(huán)磷酰胺和人參皂甙的藥物，可有效調(diào)動(dòng)機(jī)體產(chǎn)生有效抗人乳頭瘤病毒HPV的免疫應(yīng)答，清除尖銳濕疣患者所感染的人乳頭瘤病毒，對(duì)尖銳濕疣產(chǎn)生良好治療作用，并可防止其復(fù)發(fā)，而且對(duì)尖銳濕疣患者肝腎功能均不產(chǎn)生影響，無明顯的毒副作用，顯示環(huán)磷酰胺聯(lián)合人參皂甙在治療尖銳濕疣中所具有的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)A61K31/704GK101919871SQ201010251788
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月10日
發(fā)明者黃波 申請(qǐng)人:黃波;湖北盛齊安生物科技有限公司