專利名稱：藥劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及2-[4-(4-氯苯基)環(huán)己基]-3-羥基-1，4-萘醌(阿托瓦醌，atovaquone)和氯胍的具有抗寄生蟲活性的增效組合物。更具體地說，本發(fā)明涉及含有上述組合物的藥用組合物，它們?cè)谥委熢鷦?dòng)物寄生蟲感染(例如瘧疾和弓形體病)中的應(yīng)用和在治療由卡氏肺囊蟲引起的感染中的應(yīng)用。
先前已經(jīng)公開了化合物2-[4-(4-氯苯基)環(huán)己基]-3-羥基-1，4-萘醌(阿托瓦醌)，例如在歐洲專利123，238中提到了式(Ⅰ)的2-取代的-3-羥基-1，4-萘醌及其生理上可接受的鹽
其中R1是氫，R2選自C1-6烷氧基、芳基烷氧基、C1-6烷基-C1-6烷氧基、用選自鹵素和C1-6烷基的一或二個(gè)基團(tuán)取代的苯基、鹵素和全鹵-C1-6烷基，或者R1和R2都是C1-6烷基或苯基，n是0或1。據(jù)說這些化合物具有抗原生動(dòng)物活性。特別是，其中的n為0的式(Ⅰ)化合物據(jù)稱有防治人類瘧原蟲(plasmodium falciparum)的活性。而且還具有防治球蟲病病原體艾美球蟲屬(例如禽艾美球蟲和堆形艾美球蟲)的活性，其中的n為1的式(Ⅰ)化合物則具有防治泰氏梨漿蟲屬，特別是環(huán)狀泰氏梨漿蟲和小泰氏梨漿蟲等原生動(dòng)物的活性。在這些化合物中特別提到并舉例說明的是其中的n為0，R為氫和R2為4-氯苯基的式(Ⅰ)化合物，即阿托瓦醌(atovaquone)。
氯胍是著名的預(yù)防瘧疾的藥物，但不能用于治療。它是最安全的防瘧藥，可以用于兒童和孕婦。但是，惡性瘧原蟲對(duì)氯胍已出現(xiàn)抗性，特別是在東南亞，而且日益嚴(yán)重。
為了克服抗藥性，同時(shí)或先后服用一種以上的防瘧藥已成為常規(guī)作法。但是，這種組合中很多是對(duì)抗性的，造成療效降低，而且服藥方式常常很復(fù)雜，增加了患者不能完成治療的可能性。因此，本發(fā)明的目的是提供一種沒有對(duì)抗作用的防瘧藥的組合，而且它不需要復(fù)雜的服藥方式。
現(xiàn)已出乎意料地發(fā)現(xiàn)，將在本說明書中用式(Ⅱ)表示的阿托瓦醌和氯胍一起或先后結(jié)合服用，其抗寄生蟲活性、特別是抗瘧活性，呈現(xiàn)增效作用。另外，式(Ⅱ)化合物和氯胍的增效組合可以簡(jiǎn)單地在單一種藥物制劑中表現(xiàn)出來。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物(包括人)中原生動(dòng)物寄生蟲感染(例如瘧疾或弓形體病)或卡氏肺囊蟲造成的感染的方法，此法包括服用有效數(shù)量的阿托瓦醌或其生理上可接受的鹽，并且同時(shí)或隨后服用有效數(shù)量的氯胍。
在第二方面，本發(fā)明提供了用于制造藥劑的阿托瓦醌，以便與氯胍同時(shí)服用或先后服用，治療和/或預(yù)防在哺乳動(dòng)物(包括人)中的原生動(dòng)物寄生蟲感染(例如瘧疾或弓形體病)或卡氏肺囊蟲造成的感染。
式(Ⅱ)化合物和氯胍優(yōu)選同時(shí)服用。最好是式(Ⅱ)化合物和氯胍以增效比例服用。
因此，根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了阿托瓦醌或其生理上可接受的鹽與氯胍的組合物，其中阿托瓦醌或其鹽與氯胍以增效比例存在。
這里使用的“增效比例”一詞表示，阿托瓦醌和氯胍的比例使組合物的抗寄生蟲活性大于阿托瓦醌或氯胍單獨(dú)存在時(shí)的活性或者根據(jù)各個(gè)組分的活性對(duì)組合物所預(yù)期的加和活性。因此，各組分若是按增效比例相組合，則協(xié)同地起增效作用。
可以成功地用來治療瘧疾、包括抗羥萘醌的瘧疾品系的增效比例是在氯胍∶阿托瓦醌為1∶0.1～1∶100的范圍內(nèi)。增效比例以1∶0.2～1∶10為宜。
特別優(yōu)選的增效比例是1∶1～1∶3。
本發(fā)明另一方面還提供了治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物(包括人)中的瘧疾的方法，該方法包括服用阿托瓦醌或其生理上可接受的鹽與氯胍的有效數(shù)量的組合物。
阿托瓦醌的羥基可以與適當(dāng)?shù)膲A形成鹽，阿托瓦醌的生理上可接受的鹽包括無機(jī)堿鹽，例如堿金屬(如鈉和鉀)鹽和堿土金屬(如鈣)鹽;有機(jī)堿鹽，例如苯乙基芐基胺、二芐基乙二胺、乙醇胺和二乙醇胺鹽;以及氨基酸鹽，例如賴氨酸和精氨酸鹽。
式(Ⅱ)化合物可以以順式或反式異構(gòu)體的形式存在，也就是說，其中的環(huán)己基環(huán)可以被萘醌核和氯苯基順式或反式取代。順式和反式異構(gòu)體以及它們的任何比例的混合物均可根據(jù)本發(fā)明使用。一般來說，當(dāng)化合物是異構(gòu)體的混合物時(shí)，反式異構(gòu)體的含量應(yīng)約為50%或者是主要的異構(gòu)體，但是使用順式異構(gòu)體占主要地位的混合物也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。異構(gòu)體的具體比例可以隨需要而變;典型的混合物包括其中的順/反異構(gòu)體之比約為1∶1，40∶60和5∶95的那些混合物。對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的使用，優(yōu)選式(Ⅱ)化合物的反式異構(gòu)體，或是其中至少含95%(例如99%)反式異構(gòu)體的順、反異構(gòu)體的混合物。
式(Ⅱ)化合物也可以以互變異構(gòu)體的形式存在，其中羥基將其質(zhì)子給予一個(gè)氧代基，這種互變異構(gòu)形式的使用也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。但是，據(jù)信式(Ⅱ)所示的形式是穩(wěn)定的形式。
阿托瓦醌和氯胍的組合物作為有效的抗寄生蟲劑所需的數(shù)量當(dāng)然是可變的，最終要由醫(yī)師或獸醫(yī)決定。要考慮的因素包括服藥的途徑和制劑的本質(zhì)，哺乳動(dòng)物的體重、年齡和一般狀況，以及要治療的疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度。一般來說，對(duì)于治療人類瘧疾，要服用的合適有效劑量是每千克體重每天2.0毫克至30毫克氯胍和0.5毫克至30毫克阿托瓦醌，例如3到20毫克/千克/天的氯胍和1到20毫克/千克/天的阿托瓦醌，特別是5到15毫克/千克/天的氯胍和3到15毫克/千克/天的阿托瓦醌。
用于預(yù)防人類瘧疾時(shí)，合適的有效劑量是氯胍和阿托瓦醌均為每千克體重每周3至20毫克，例如氯胍和阿托瓦醌均為6毫克/千克/周至10毫克/千克/周。
應(yīng)該清楚，上面提到的劑量均按藥物本身計(jì)算。
對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用，阿托瓦醌和氯胍的組合物最好以藥物制劑的形式存在。
藥物制劑包括活性成分(即，阿托瓦醌和氯胍的組合物)和其一種或多種藥學(xué)上可接受的載體以及任選地其它用于治療和/或預(yù)防的成分。載體在與藥劑的其它成分相容和不損害服藥者方面必須是可接受的。
因此，本發(fā)明提供了一種藥物制劑，其中含有阿托瓦醌和氯胍的組合物以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明還提供了制備藥物制劑的方法，該方法包括使阿托瓦醌和氯胍的組合物與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體相組合。
阿托瓦醌和氯胍的組合物可以方便地制備成單位劑量形式的藥物制劑。一種方便的單位劑量的制劑含有數(shù)量各為10毫克至3克(例如50毫克至3克)的活性成分。典型的單位劑量可以含有例如500毫克的阿托瓦醌和200毫克的氯胍，或是500毫克的阿托瓦醌和500毫克的氯胍。
藥物制劑包括適合口服、局部施用(包括經(jīng)皮、頰含和舌下服用)、肛門用藥和非腸道用藥(包括皮下、真皮內(nèi)和靜脈內(nèi)用藥)以及用鼻飼管用藥的藥劑。這些藥劑在適當(dāng)?shù)那闆r下可以方便地制成分離的劑量單位，并且可以用制藥工藝中熟知的任何方法制備。所有這些方法都包括使活性組分與液體載體或磨得很細(xì)的固體載體或與兩種載體一起混合的步驟，隨后更有必要，將產(chǎn)品成型，得到所要的制劑。
其中的載體是固體的適合口服的藥物制劑最好是制成單位劑量的制劑，例如大丸劑、膠囊劑或片劑，每單位劑量中含有預(yù)定數(shù)量的活性成分。片劑可以用壓制或模塑的方法制得，可以任選地加有一種或多種輔助成分。壓制藥片可以通過在合適的機(jī)械內(nèi)將處于自由流動(dòng)形式(例如粉末或顆粒)的活性化合物任選地與粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、表面活性劑或分散劑混合壓制得到。模塑藥片可以用模塑惰性液體稀釋劑的方法制得。片劑可以任選包糖衣，如果不包糖衣，則可以任選地打印符號(hào)。膠囊可以通過將活性成分單獨(dú)地或與一種或多種輔助成分以混合物形式裝入膠囊殼中然后用常規(guī)方法封口來制備。扁囊劑與膠囊類似，其中的活性成分與任何輔助成分一起密封在米紙封皮中。式(Ⅱ)化合物與氯胍的組合物也可以配制成可分散的顆粒，在服用前這些顆?？梢詰腋≡谒谢蛘呷鲈谑澄锷?。顆粒也可以封裝在例如小袋中。其中的載體是液體的適合口服的制劑可以制成在水基液體或非水液體中的溶液或懸浮液的形式，或者是水包油的乳狀液。
口服制劑中包括可控釋放的服用形式，例如片劑，其中的活性成分配制在合適的控制釋放的基質(zhì)中，或是包覆著合適的控制釋放的薄膜。這類制劑可能特別適合用于預(yù)防。
活性成分也可以配制成適合經(jīng)過鼻飼管用藥的溶液或懸浮液。
其中的載體為固體的適合肛門用藥的藥物制劑最好制成單位劑量的栓劑。合適的載體包括可可脂和工藝中常用的其它材料。栓劑可以方便地通過活性組合物和軟化或熔化的載體混合然后冷卻并在模具中成型來制備。
適合非腸道用藥的藥物制劑包括活性組合物在水基或油質(zhì)溶劑中的滅菌溶液或懸浮液。可注射的制劑可以適合于快速濃注或連續(xù)注入。這些制劑適合于在單位劑量或多劑量的容器中保存，在裝入制劑后將容器密封直到需要用時(shí)開封?；蛘呤牵钚猿煞挚梢允欠勰┬问?，在使用前將其與合適的溶劑，例如與滅菌的無熱原的水一起構(gòu)成制劑。
阿托瓦醌和氯胍的組合物也可以配制成長(zhǎng)效的儲(chǔ)存制劑，這種制劑可以肌內(nèi)注射或以植入法用藥，例如皮下植入或肌肉內(nèi)植入。儲(chǔ)存制劑可以包含合適的聚合物或疏水物質(zhì)，或者離子交換樹脂。這類長(zhǎng)效的藥劑特別適合用于預(yù)防。
應(yīng)該清楚，除了上述的載體成分之外，用于上述各種服藥途徑的藥物制劑在合適時(shí)還可以包括一種或多種的輔助載體成分，例如稀釋劑、緩沖劑、香味劑、粘合劑、表面活性劑、增稠劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑(包括防氧化劑)等，以及用來使制劑與服用對(duì)象的血液等滲透壓的物質(zhì)。
適合獸用的組合物包括適合口服、非腸道服用和瘤胃內(nèi)用藥的那些組合物。
制備阿托瓦醌的方法在歐洲專利123，238中有說明，實(shí)施例1示例說明了一種特定的方法。
實(shí)施例12-[反-4-(4-氯苯基)環(huán)己基]-3-羥基-1，4-萘醌a).4-(4-氯苯基)環(huán)己烷-1-羧酸將乙酰氯(30克)和氯化鋁細(xì)粉(60克)在二硫化碳(120毫升)中一起攪拌，然后在CO2/苯基溶纖劑浴中冷卻到-50℃。在10分鐘內(nèi)逐滴加入預(yù)先冷到-50℃的環(huán)己烯(30克)，同時(shí)保持反應(yīng)混合物的溫度低于-20℃?；旌衔镌?50℃下再攪拌60分鐘，然后倒掉溶劑，留下膠狀的橙色復(fù)合物。當(dāng)把此物質(zhì)溫?zé)岬绞覝貢r(shí)加入少量氯苯，然后加入其余的氯苯(總計(jì)300毫升)，將這樣得到的溶液在40℃下攪拌加熱3小時(shí)，倒在冰和濃鹽酸的混合物上，分離出有機(jī)層，用2M的鹽酸、2M氫氧化鈉和水洗，用無水硫酸鈉去水，蒸發(fā)干燥。將產(chǎn)物真空蒸餾，收集沸點(diǎn)在140-154℃(0.1mmHg)的餾分，用等體積的石油醚(40-60)稀釋，冷卻到-6℃，鼓入連續(xù)的氮?dú)饬?，回收分離出的無色固體。
在0℃下向氫氧化鈉(6.2克)在水(42毫升)中的溶液加入溴(2.8毫升)。將上面得到的取代的六羥基乙酰苯(3.1克)溶在15毫升二噁烷中，然后加入冷的次溴酸鹽溶液，保持反應(yīng)混合物低于20℃。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌6小時(shí)，然后放置過夜。加入焦亞硫酸鈉以破壞多余的次溴酸鹽，將混合物冷卻，然后酸化，得到無色的固體。濾出固體，用水洗，干燥，自乙醇中重結(jié)晶，得到4-(4-氯苯基)環(huán)己烷-1-羧酸，熔點(diǎn)254-256℃。
b).2-[4-(4-氯苯基)環(huán)己基]-3-氯-1，4-萘醌將2-氯-1，4-萘醌(3.95克，0.02摩爾)、4-(4-氯苯基)環(huán)己烷-1-羧酸(4.9克，0.02摩爾)和粉狀硝酸銀(1.05克，0.0062摩爾)的混合物在40毫升乙腈中于激烈攪拌下加熱回流。在1小時(shí)內(nèi)逐滴加入過硫酸銨(12.0克，0.0525摩爾)在50毫升水中的溶液。將該混合物回流3小時(shí)，然后在冰中冷卻30分鐘，隨后過濾，該殘留的粘性固體用沸騰的氯仿萃取兩次以去掉無機(jī)物。蒸發(fā)除掉該氯仿，留下黃褐色的固體(約2.7克)。將它溶解在沸騰的乙腈中，過濾除掉少量不溶的物質(zhì)。冷卻時(shí)該標(biāo)題化合物以黃色晶體的形式分離出來(550毫克)，熔點(diǎn).172-175℃。
NMR，dH(δ6-二甲基亞砜)8.05(2H，mult.，β-萘醌)，7.85(2H，mult.，α-萘醌)，7.30(4H，s.，PhH)，3.30(1H，br.t.，CH)，2，67(1H，br.t.，CH)。1.2-2.4(8H，mult.，4xCH2).
c).2-[4-(4-氯苯基)環(huán)己基]-3-羥基-1，4-萘醌將步驟(b)的產(chǎn)物懸浮在10毫升沸騰的甲醇中，在15分鐘內(nèi)逐滴加入在5.5毫升水中的0.55克氫氧化鉀。將該混合物回流，直到形成深紅化的溶液(約6小時(shí)后)，此時(shí)小心地逐滴加入2毫升濃鹽酸。將該混合物冷卻過濾，用水將該固體殘余物充分清洗。水洗液重新酸化并過濾。將合并的固體殘余物(500毫克，熔點(diǎn).200-209℃)自乙腈中重結(jié)晶，得到反式異構(gòu)體的該標(biāo)題產(chǎn)物(300毫克)，熔點(diǎn).216-219℃。
實(shí)施例2以下實(shí)施例示例說明了可以根據(jù)本發(fā)明使用的常規(guī)的藥物制劑。
A.薄膜包衣藥片核心實(shí)施例1的化合物500毫克氯胍鹽酸鹽200毫克微晶纖維素(AvicelpH101)130毫克羥丙基纖維素，Lo-sub，(LHPC，LH11)99毫克羥基乙酸淀粉鈉(Explotab)30毫克聚乙烯吡咯烷酮K3036毫克硬脂酸鈉5毫克壓片重量1000毫克包衣聚合物分散體(羥丙基甲基纖維素和二氧化鈦、聚乙二醇400及著色劑)20毫克拋光劑聚乙二醇80002毫克總重1022毫克B.可分散的薄膜包衣藥片核心實(shí)施例1的化合物500毫克氯胍鹽酸鹽200毫克微晶纖維素(AvicelpH101)100毫克羥丙基纖維素，Lo-sub(LHPC，LH11)83毫克羥基乙酸淀粉鈉(Explotab)40毫克聚乙烯吡咯烷酮K3020毫克硬脂酸鎂5毫克二辛基磺化琥珀酸鈉1毫克硅酸鋁鎂(VeegumF)50毫克糖精鈉1毫克壓片重量1000毫克包衣
聚合物分散體(羥丙基甲基纖維素和二氧化鈦、聚乙二醇400及著色劑)10毫克拋光劑聚乙二醇80002毫克總重1012毫克生物試驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例3實(shí)施例1化合物與其它抗瘧藥的組合物中藥物相互作用的比較用Desjardins的半自動(dòng)化技術(shù)進(jìn)行體外藥物靈敏度研究(Desjardins等，AntimalarialAgentsandChemotherapy.1979，16(6)，710-718)。在該體系中通過濃度遞變的藥物對(duì)放射性標(biāo)記的次黃嘌呤在寄生蟲中結(jié)合的抑制作用來評(píng)定抗瘧活性。
將試驗(yàn)的抗瘧藥物溶在水、95%乙醇或二甲基亞砜中;溶在水中的藥物用95%的乙醇按1∶1稀釋，溶在乙醇中的藥物用水按1∶1稀釋。然后用含10%人血清的培養(yǎng)介質(zhì)將藥物溶液稀釋到起始濃度為估計(jì)的IC50的20-50倍。所試驗(yàn)的藥物及其溶劑列出如下藥物初始溶劑介質(zhì)實(shí)施例1化合物二甲基亞砜1640奎寧乙醇-水1640氯喹水-乙醇1640甲氟喹乙醇-水1640伯氨喹乙醇-水1640青蒿酯鈉乙醇-水1640
PM443二甲基亞砜1640四環(huán)素二甲基亞砜1640諾氟沙星二甲基亞砜1640環(huán)丙沙星二甲基亞砜1640氯胍乙醇-水低濃度葉酸鹽環(huán)氯胍乙醇-水低濃度葉酸鹽乙胺嘧啶二甲基亞砜低濃度葉酸鹽甲氧芐氨嘧啶二甲基亞砜低濃度葉酸鹽磺胺甲基異惡唑二甲基亞砜低濃度葉酸鹽氨苯砜二甲基亞砜低濃度葉酸鹽二氯二甲吡啶酚二甲基亞砜低濃度葉酸鹽別嘌呤醇乙醇-水低濃度葉酸鹽PS-15二甲基亞砜低濃度葉酸鹽WR99210二甲基亞砜低濃度葉酸鹽為研究藥物組合物，將起始濃度的藥物溶液按不同的比例(1∶5，1∶2，2∶1和5∶1)組合。然后將藥物溶液和組合物加到96孔的微量滴定板中，形成二排實(shí)施例1化合物、要組合的藥物和兩種藥物的四個(gè)組合物。用介質(zhì)按1∶3連續(xù)稀釋藥物，使用12通道的移液器加到96孔的微量滴定板中。為了評(píng)價(jià)分類為二氫葉酸還原酶(DHFR)抑制劑的藥物，使用只含生理濃度的葉酸和對(duì)氨基苯甲酸的改性的培養(yǎng)介質(zhì)。
其余的生物步驟按Desjardins方法進(jìn)行，不同之處在于，使用三種品系的惡性瘧原蟲(抗多種藥物的W-2無性繁殖系，對(duì)藥物敏感但是抗甲氟喹的D-6無性繁殖系和抗實(shí)施例1化合物的C2B分離物)，而且培育時(shí)間延長(zhǎng)到72小時(shí)。
用Micromath Scientific Software公司的“MINSQ”程序計(jì)算各個(gè)IC50值。將各組成對(duì)的數(shù)據(jù)對(duì)Desjardins使用的雙曲線切線函數(shù)進(jìn)行擬合。
將IC50值歸一化，作法是指定實(shí)施例1化合物和所組合的其它藥物的IC50為1，對(duì)于所研究的各個(gè)比例的兩種藥物則得出成比例的歸一化數(shù)值。使數(shù)據(jù)符合以下公式以構(gòu)成等和圖(Isobologram)Yi＝1-[Xi/(Xi+eI＊(1-Xi))]其中Yi＝實(shí)施例1的化合物與另一種藥物組合時(shí)的IC50Xi＝另一種藥物在與實(shí)施例1化合物組合時(shí)的IC50I＝代表反向度的相互作用參數(shù)對(duì)于每種組合，計(jì)算I的值。正的I值表示增效組合，負(fù)值表示對(duì)抗，而I＝0代表加和相互作用。
結(jié)果示于表1中。
表1與實(shí)施例1I組合的藥物W-2D-6C2B奎寧-1.36氯喹-1.84-1.40甲氟喹-1.19四環(huán)素1.271.110.02,-0.08伯氨喹-0.79青蒿酸-0.18PM443-1.28諾福沙星1.02環(huán)丙沙星-1.22乙胺嘧啶0.36-0.48甲氧芐氨嘧啶1.270.58氯胍2.43,2.882.562.56環(huán)氯胍2.211.660.13,-0.73別嘌呤醇1.140.43PS-151.77,0.65,1.97-0.74WR992100.02磺胺甲基異惡唑2.75氨苯砜-0.39二氯二甲吡啶酚2.38,2.650.73
結(jié)果表明，2-[4-(4-氯苯基)環(huán)己基]-3-羥基-1，4-萘醌和氯胍組合，與所試驗(yàn)的其它藥物組合物相比，顯示出最穩(wěn)定的增效作用，特別是對(duì)于抗羥基萘醌的C2B品系。
通過測(cè)定氯胍的IC50與式(Ⅱ)化合物的IC50的比值，對(duì)于三種品系的瘧疾寄生蟲估計(jì)與氯胍的組合物的最佳比例。結(jié)果列在下面的表2中。
表2W-2D-6C2B氯胍:式(I)化合物920:14038:10.2:12473:1實(shí)施例4實(shí)施例1化合物、氯胍及其組合物在體內(nèi)抗弓形體活性的比較這些化合物及其組合物的活性在鼠弓形體的小鼠樣品動(dòng)物中檢驗(yàn)，延長(zhǎng)時(shí)間至死，以存活的小鼠百分?jǐn)?shù)作為藥物活性的量度。
用管飼法使10只一組的20克CBA/CA小鼠口服感染6囊胞的C56品系鼠弓形體，3天后開始藥物治療，繼續(xù)10天。所有的藥物均管飼口服。檢驗(yàn)以下各組對(duì)照組阿托瓦醌，10毫克/千克阿托瓦醌，25毫克/千克氯胍，25毫克/千克阿托瓦醌，10毫克/千克+氯胍，25毫克/千克阿托瓦醌，25毫克/千克+氯胍，25毫克/千克所有的動(dòng)物均每天檢查二次，檢驗(yàn)30天，記下死亡總數(shù)。
結(jié)果列在表3和表4中。
表3致死的平均時(shí)間(天)阿托瓦醌010毫克/千克25毫克/千克氯胍014020.124.1(毫克/千克)259.018.429.3表4存活%阿托瓦醌010毫克/千克25毫克/千克氯胍010.010.110.0(毫克/千克)250.00.080.0對(duì)照鼠的平均死亡時(shí)間是14天，只有一只動(dòng)物存活[10%](此動(dòng)物可能未被所用的低濃度接種物感染)。只用阿托瓦醌，在10毫克/千克時(shí)此時(shí)間增加到20.1天，在25毫克/千克時(shí)增加到24.1天，兩種情形下都只有一只存活[10%]。氯胍雖然對(duì)人極其安全，但對(duì)小鼠有毒。在25毫克/千克時(shí)氯胍顯示出毒性，將死亡時(shí)間減小到9天，無一只存活。將10毫克/千克的阿托瓦醌與25毫克/千克的氯胍組合，平均死亡時(shí)間為18.4天。將25毫克/千克阿托瓦醌和25毫克/千克氯醌組合，雖然氯胍有毒，但小鼠的死亡時(shí)間增加，而且與只用阿托瓦醌時(shí)10%的微小存活率相比，小鼠的存活率達(dá)到80%。
實(shí)施例5實(shí)施例1化合物、氯胍及其組合物在體外抗弓形體活性的比較使用根據(jù)對(duì)瘧疾采用的半自動(dòng)化技術(shù)(Desjardins等，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1979，16(6)710-718)在體外研究藥物靈敏性，但是采用選擇性結(jié)合了3[H]-尿嘧啶的鼠弓形體。此體系中的抗弓形體活性通過濃度遞變的藥物對(duì)放射性標(biāo)記的尿嘧啶吸收到寄生蟲內(nèi)的抑制作用進(jìn)行評(píng)定。
將藥物溶解在二甲基亞砜中，用含3%胎牛血清的培養(yǎng)介質(zhì)配制稀釋液。為了研究藥物組合物，將起始濃度的藥物溶液以1∶1、1∶3和3∶1等不同比例組合。配制這些藥物溶液及組合物按1∶2連續(xù)稀釋的稀釋液，加在事先用海拉細(xì)胞和RH品系鼠弓形體接種的96孔板的雙排孔中。在寄生蟲和板在37℃下培育24小時(shí)后加入3[H]-尿嘧啶，2小時(shí)后加入藥物，繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)。去掉上層流體，在十二烷基硫酸鈉中破壞含鼠弓形體的細(xì)胞，用三氯乙酸將標(biāo)記的蛋白質(zhì)沉淀在濾墊上。用β射線平板型閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定標(biāo)記物的結(jié)合情況。對(duì)各化合物和其組合物計(jì)算對(duì)尿嘧啶結(jié)合的抑制百分?jǐn)?shù)，用GS1程序計(jì)算IC50。使IC50值歸一化，其作法是指定實(shí)施例1化合物和氯胍的IC50為1，對(duì)于所研究的各個(gè)比例的兩種化合物則指定其歸一化的數(shù)值。將這些歸一化的IC50值彼此對(duì)照作圖，構(gòu)成等和圖(Isobologram)。在此等和圖的直線以下的數(shù)值表示增效作用，在線上表示加合作用，線以上的數(shù)值表示對(duì)抗作用。
使用三套試驗(yàn)板，所有數(shù)值均畫在圖上。結(jié)果示于表5中。
表5歸一化的IC50阿托瓦醌氯胍增效作用0.5592780.583893無0.1966890.614094有0.7293810.253691有0.3452380.527273有0.1309520.6有0.2333330.118182有0.4049590.451538有0.2292010.768462有0.2449040.091538有結(jié)果表明，阿托瓦醌與氯胍的組合顯示出體外對(duì)抗鼠弓形體的活性。
實(shí)施例6實(shí)施例1的化合物、氯胍及其組合物在體內(nèi)抗肺囊蟲活性的比較在患間質(zhì)性漿細(xì)胞性肺炎的試驗(yàn)用Scid小鼠上檢驗(yàn)各化合物和組合物的活性。
每組中的小鼠的感染程度用標(biāo)準(zhǔn)的肺印模涂片和免疫熒光試驗(yàn)法測(cè)定。對(duì)每只鼠打分，其中0＝無感染，+4＝嚴(yán)重感染。結(jié)果示于表6中。
表6處置情況SCOEE感染數(shù)/平均分?jǐn)?shù)為對(duì)照0+1+3+4+4檢驗(yàn)數(shù)±SE試驗(yàn)的%未處置的對(duì)照動(dòng)物0003710/103.70±0.14100阿托瓦醌,每天500055010/102.50±0.1668毫克/千克,口服阿托瓦醌,每天250017210/103.10±0.1784毫克/千克,口服氯胍,每天25毫克/0002810/103.8±0.1385千克,口服阿托瓦醌和氯胍,541005/100.50±0.2114每日50+25毫克/千克,口服阿托瓦醌和氯胍,104408/92.22±0.3160每日25+25毫克/千克,口服在單獨(dú)服用時(shí)，阿托瓦醌使感染分?jǐn)?shù)減小。單獨(dú)服用25毫克/千克/天的氯胍在預(yù)防Scid小鼠的間質(zhì)性漿細(xì)胞性肺炎方面無效。氯胍與阿托瓦醌組合顯示出增效作用。
權(quán)利要求
1.一種治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的原生動(dòng)物寄生蟲感染或由卡氏肺囊蟲引起的感染的方法，該方法包括服用2-[4-(4-氯苯基)環(huán)己基]-3-羥基-1，4-萘醌和氯胍。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中2-[4-(4-氯苯基)環(huán)己基]-3-羥基-1，4-萘醌和氯胍同時(shí)服用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的一種方法，其中2-[4-(4-氯苯基)環(huán)己基]-3-羥基-1，4-萘醌和氯胍以增效比例服用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的方法，其中原生動(dòng)物寄生蟲感染是瘧疾。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的方法，其中原生動(dòng)物寄生蟲感染是弓形體病。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的方法，用于治療和/或預(yù)防由卡氏肺囊蟲引起的感染。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)的方法，其中2-[4-(4-氯苯基)環(huán)己基]-3-羥基-1，4-萘醌是反式異構(gòu)體的形式，或者是以反式異構(gòu)體為主的順式和反式異構(gòu)體的混合物。
8.使用2-[4-(4-氯苯基)環(huán)己基]-3-羥基-1，4-萘醌制造藥劑，用來與氯胍同時(shí)服用或先后服用，以治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的原生動(dòng)物寄生蟲感染或由卡氏肺囊蟲引起的感染。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的應(yīng)用，其中原用動(dòng)物寄生蟲感染是瘧疾。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的應(yīng)用，其中原生動(dòng)物寄生蟲感染是弓形體病。
11.根據(jù)權(quán)利要求8用于治療和/或預(yù)防卡氏肺囊蟲引起的感染。
12.2-[4-(4-氯苯基)環(huán)己基]-3-羥基-1，4-萘醌和氯胍的組合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的一種組合物，其中2-[4-(4-氯苯基)環(huán)己基]-3-羥基-1，4-萘醌和氯胍以增效比例存在。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的一種組合物，其中氯胍與2-[4-(4-氯苯基)環(huán)己基]-3-羥基-1，4-萘醌之比是在1∶1到1∶3的范圍內(nèi)。
15.根據(jù)權(quán)利要求12至14中任何一項(xiàng)的一種組合物，其中2-[4-(4-氯苯基)環(huán)己基]-3-羥基-1，4-萘醌是反式異構(gòu)體或是以反式異構(gòu)體為主的順式和反式異構(gòu)體的混合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求12至15中任何一項(xiàng)的組合物，用于治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的原生動(dòng)物寄生蟲感染或卡氏肺囊蟲引起的感染。
17.根據(jù)權(quán)利要求12至15中任何一項(xiàng)的組合物，用于制造藥劑，該藥劑用來治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的原生動(dòng)物寄生蟲感染或由卡氏肺囊蟲引起的感染。
18.一種治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的原生動(dòng)物寄生蟲感染或卡氏肺囊蟲引起的感染的方法，該方法包括服用有效數(shù)量的權(quán)利要求12至15中任何一項(xiàng)的組合物。
19.一種藥物制劑，其中含有權(quán)利要求12至15中任何一項(xiàng)的組合物及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。
20.一種單位劑量的藥劑，其中含有各為50毫克至3克的2-[4-(4-氯苯基)環(huán)己基]-3-羥基-1，4-萘醌和氯胍。
21.根據(jù)權(quán)利要求17的一種單位劑量的藥劑，其中含有500毫克2-[4-(4-氯苯基)環(huán)己基]-3-羥基-1，4-萘醌和200毫克氯胍。
全文摘要
本發(fā)明涉及阿托瓦醌(atovaquone)與氯胍的組合物，它們?cè)谥委熀皖A(yù)防寄生蟲感染(例如原生動(dòng)物寄生蟲感染，如瘧疾和弓形體病)和卡氏肺囊蟲引起的感染方面的應(yīng)用，以及它們?cè)谥圃煊糜谥委熀?或預(yù)防這類感染的藥物中的應(yīng)用。這些組合物可以以單個(gè)藥物制劑的形式服用。最好是以增效比例服用阿托瓦醌和氯胍以使它們起增效作用。
文檔編號(hào)A61K31/12GK1091632SQ9311472
公開日1994年9月7日 申請(qǐng)日期1993年11月25日 優(yōu)先權(quán)日1992年11月26日
發(fā)明者W·E·古特里治, D·B·A·哈欽森, V·S·拉特, M·普尼 申請(qǐng)人:惠爾康基金會(huì)集團(tuán)公司