專利名稱：阿魏酸在制備減輕流產(chǎn)后子宮出血藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種阿魏酸的新用途，具體涉及一種阿魏酸在制備減輕流產(chǎn)后子宮出血藥物中的新用途。
背景技術(shù)：
藥流后異常子宮出血嚴(yán)重?fù)p害患者身心健康，一定程度上影響了藥流的接受性，影響了計(jì)劃生育國(guó)策的順利實(shí)施?，F(xiàn)有的藥流后異常子宮出血治療方法主要包括清宮術(shù)和米非司酮?jiǎng)┝績(jī)?yōu)化，但清宮術(shù)具有宮腔操作導(dǎo)致感染、穿孔、疼痛等多種并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，而現(xiàn)有的米非司酮?jiǎng)┝績(jī)?yōu)化方案存在療效不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。因此，尋找有療效確切且副作用小的減輕藥流后子宮出血方法和藥物將具有重要的臨床價(jià)值及社會(huì)意義。隨著生殖免疫學(xué)不斷發(fā)展，免疫因素在妊娠及妊娠相關(guān)疾病中的作用日益受到關(guān)注。從免疫學(xué)角度，正常妊娠類似于成功的半同種異體移植；母體對(duì)攜帶父方組織相容性抗原的胚胎不僅不排斥，而且通過精細(xì)的母-胎對(duì)話建立獨(dú)特的母-胎免疫耐受微環(huán)境，允許胎兒在子宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育直至分娩。免疫細(xì)胞在母-胎免疫耐受的誘導(dǎo)與維持中扮演了重要角色，T淋巴細(xì)胞在其中發(fā)揮著重要作用。初始T細(xì)胞遇抗原刺激后在特異性核轉(zhuǎn)錄因子作用下，分化Thl/Th2/Thl7/Treg亞群，產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子，在抗感染、維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及誘導(dǎo)母-胎免疫耐受中發(fā)揮著不同作用。Thl亞群產(chǎn)生IFN Y等細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫，在機(jī)體抗感染中發(fā)揮著重要作用，但其過度表達(dá)能夠誘導(dǎo)母胎免疫排斥，導(dǎo)致流產(chǎn)；Th2亞群產(chǎn)生IL-4等細(xì)胞因子，能降低巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞活性和淋巴毒素作用，使胚胎逃逸母體免疫排斥，有利于妊娠。正常妊娠存在Th2型免疫偏移，而Thl類細(xì)胞因子的優(yōu)勢(shì)表達(dá)可導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。Thl7細(xì)胞能分泌大量的IL-17A、IL-17F等細(xì)胞因子，在清除胞外病原體、抗真菌中發(fā)揮重要作用，同時(shí)在組織炎癥和自身免疫性疾病發(fā)生的過程中起著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)模型動(dòng)物及患者Thl7亞群比例較正常妊娠升高。Treg通過產(chǎn)生TGF- ^等細(xì)胞因子參與維持外周T細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及在移植耐受的形成，在母-胎免疫耐受中亦發(fā)揮關(guān)鍵作用，其功能障礙參與了流產(chǎn)的發(fā)生。Thl7細(xì)胞與Treg細(xì)胞起源于共同的前體細(xì)胞，在不同的免疫微環(huán)境中向著不同方向分化。正常妊娠時(shí)Thl7/Treg向Treg偏移，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者則存在Thl7偏移現(xiàn)象。Thl/Th2/Thl7/Treg亞群共同形成復(fù)雜精細(xì)的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，維持母-胎免疫耐受微環(huán)境的穩(wěn)定，其亞群失衡則打破維持母-胎免疫耐受狀態(tài)而導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生。研究證實(shí)，米非司酮藥流婦女血清及蛻膜組織中Thl類細(xì)胞因子表達(dá)升高、Th2類細(xì)胞因子表達(dá)降低；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)米非司酮誘導(dǎo)妊娠小鼠Thl7特征性細(xì)胞因子IL-17表達(dá)，抑制Treg特征性細(xì)胞因子IL_10、TGF_ ^表達(dá)，提示T細(xì)胞亞群偏移在米非司酮藥流中扮演了重要角色。阿魏酸的化學(xué)名稱為4-羥-3-甲氧基肉桂酸或3-(4-羥基-3-甲氧苯基)_2_丙烯酸，是植物界普遍存在的一種酚酸，在植物中主要與細(xì)胞壁多糖和木質(zhì)素交聯(lián)構(gòu)成細(xì)胞壁的一部分，是當(dāng)歸、川芎、阿魏等中藥的有效成分之一。阿魏酸具有許多功能，如抗氧化、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌消炎、抗突變、防癌等，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域，但目前還未見阿魏酸有減輕流產(chǎn)后子宮出血的作用。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種阿魏酸在制備減輕流產(chǎn)后子宮出血藥物中的新用途。阿魏酸通過誘導(dǎo)藥物流產(chǎn)小鼠母胎界面T細(xì)胞亞群(Thl/Th2/Thl7/Treg)向Thl、Thl7亞群偏移，促進(jìn)母胎免疫排斥，進(jìn)而減少流產(chǎn)小鼠子宮出血量。為了進(jìn)一步的說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面用阿魏酸的藥理實(shí)驗(yàn)來說明阿魏酸在制備減輕流產(chǎn)后子宮出血藥物中的新用途。藥理實(shí)驗(yàn) 藥物
米非司酮由浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)(國(guó)藥準(zhǔn)字H20000648，批號(hào)091102)。本發(fā)明有效單體成分阿魏酸(CltlHltlNO4),購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。小鼠分組與處理
清潔級(jí)Balb/C小鼠，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，鼠齡10周，體重(22±2) g，雌性小鼠未交配過，雄性小鼠證明有生育能力。置于室溫24 °C,相對(duì)濕度60% 65%的超凈動(dòng)物飼養(yǎng)柜內(nèi)，給予12 h光照，12 h暗室，自由飲水?dāng)z食。雌雄小鼠按2:1比例于每日下午5 :00合籠，次日清晨觀察小鼠陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓日為妊娠第I天。將孕鼠隨機(jī)分為米非司酮對(duì)照組、米非司酮+阿魏酸組(大、中、小劑量)，各10只。米非司酮對(duì)照組自小鼠妊娠第6天起，灌胃米非司酮(I. 5 mg O雙蒸水，連續(xù)灌胃3天；米非司酮+阿魏酸組大、中、小劑量組分別灌胃米非司酮(I. 5 mg - kg-1 .d-1)+大、中、小劑量阿魏酸(20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg)連續(xù)灌胃3天。 標(biāo)本收集與檢測(cè)
(I)自藥物處理第I天起，小鼠陰道內(nèi)置入20 g定量棉球，每日更換，置于密閉EP管內(nèi)，4°C保存，改良?jí)A性正鐵血紅素法檢測(cè)小鼠子宮出血量。(2)流式細(xì)胞術(shù)包內(nèi)外雙染色法檢測(cè)母胎界面Thl/Th2/Thl7/Treg亞群比例分離子宮組織，剪至ImmX Imm大小，200目銅網(wǎng)研磨過濾，I XPBS沖洗，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離子宮組織單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整子宮組織單個(gè)核細(xì)胞濃度為I X IO6個(gè)/mL，加入佛波酯30 ng/mL、離子霉素I y g/mL、莫能霉素I. 7 ng/mL, 37 °C, 5% CO2孵育4 h。收集細(xì)胞，I XPBS洗2遍，去上清，加入大鼠血清，室溫避光孵育30 min。將外標(biāo)抗體(FITC-⑶4、PC5-⑶25)按說明書分別加入到細(xì)胞懸液中，4 1避光孵育30 min;lXPBS洗2次，去上清；BD固定穿膜試劑盒固定穿膜(按說明書操作)，加入內(nèi)標(biāo)抗體(PE-IFN-y，PE-IL-4，PE-IL17A，PE-Foxp3)，4 1避光孵育30 min ;穿膜緩沖液洗2次，去上清，I XPBS重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)管，上機(jī)檢測(cè)。Winmidi 2. 9 分析 Thl 亞群(CD4+ IFN-Y+)、Th2 亞群(CD4+IL_4+)、Thl7 亞群(CD4+IL-17A+)及 Treg (CD4+CD25+Foxp3+)比例，計(jì)算 Thl/Th2 比值及 Thl7/Treg 比值。(3) Western blot法檢測(cè)子宮組織T細(xì)胞亞群分化特異性核轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)分離子宮組織，剪至ImmX Imm大小，200目銅網(wǎng)研磨過濾，I XPBS沖洗，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離子宮組織單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整子宮組織單個(gè)核細(xì)胞濃度為IX IO6個(gè)/mL，加入蛋白裂解液100微升，冰浴混勻，冰浴靜置30分鐘，4°C 12000rpm / min，離心30min，取上清，10%SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜，封閉、加入兔抗小鼠T-bet、GATA3、R0R Y t、Foxp3抗體(按說明書操作)，4°C孵育過夜；洗滌后加入山羊抗兔辣根過氧化酶標(biāo)記二抗，37°C孵育I. 5h ;充分洗滌后與增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法曝光顯色(LAS-4000mini化學(xué)發(fā)光圖像分析儀)，以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算目的蛋白與同步GAPDH灰度值比值作為相對(duì)表達(dá)量。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
采用方差分析，計(jì)量資料以;± s表示，采用One Way-ANOVA方差分析，組間比較采用Student-Newman-Keuls法檢驗(yàn)〈O. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果
(I)阿魏酸有效減少藥流小鼠子宮出血量 表I各組藥流后小鼠子宮出血量對(duì)照表
權(quán)利要求
1.阿魏酸在制備減輕流產(chǎn)后子宮出血藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種阿魏酸的新用途，具體涉及一種阿魏酸在制備減輕流產(chǎn)后子宮出血藥物中的新用途，阿魏酸能優(yōu)勢(shì)誘導(dǎo)米非司酮藥流小鼠母胎界面Th1、Th17亞群特異性核轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)啊，降低Th2、Treg亞群特異性核轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1、Th17亞群偏移，促進(jìn)母胎免疫排斥，從而減輕藥流小鼠子宮出血量。
文檔編號(hào)A61P15/00GK102961370SQ201210497129
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月29日
發(fā)明者李霞, 王彬, 姚成芳, 王麗, 周憲賓, 郭鈺琪, 趙向忠, 張巧鳳, 姜國(guó)勝 申請(qǐng)人:山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所