專利名稱：重組人血管內(nèi)皮抑制素在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及重組人血管內(nèi)皮抑制素的制藥用途，該藥物可用于血管生成性眼底病的治療。

背景技術(shù)：
眼底病是一種復(fù)雜的致盲率很高的眼部疾病，目前大部分的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，國(guó)內(nèi)眼底病導(dǎo)致低視力和致盲的比例呈上升趨勢(shì)。眼球是一個(gè)球形的物體，其后部的玻璃體、視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜等部分即為眼底，眼底有血管、視神經(jīng)、黃斑部，這些部位的病變就稱為眼底病。包括老年黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、缺血性視乳頭病變等。其中有一些是與血管生成相關(guān)的，如增齡性黃斑變性、中心性滲出性視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變以及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等，即血管生成性眼底病。
增齡性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)即老年性黃斑變性又稱為年齡相關(guān)性黃斑變性，是一種無(wú)痛性慢性視力下降的眼底病，近些年逐漸成為導(dǎo)致高齡者視力下降甚至失明的主要原因，因而備受關(guān)注，但其病因目前還不明確。AMD主要分為萎縮型和滲出型，其中萎縮型主要是指視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、脈絡(luò)膜毛細(xì)血管板的萎縮，與脈絡(luò)膜血管新生無(wú)關(guān)，而滲出型則主要是由于在高齡者的黃斑部，從脈絡(luò)膜向視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或者是在視網(wǎng)膜下伸展新生血管而導(dǎo)致出血或滲出型病變。
中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變又稱Rieger中心性視網(wǎng)膜炎、青年性出血性黃斑病變。臨床上一般為單眼發(fā)病，年齡多在50歲以下。主要發(fā)生于黃斑部及其周圍的弧立的滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病灶，伴有視網(wǎng)膜下新生血管及出血。
增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是指在孔源性視網(wǎng)膜脫離或視網(wǎng)膜復(fù)位手術(shù)后，以及眼外傷后，由于玻璃體內(nèi)及視網(wǎng)膜表面的細(xì)胞增生和收縮，造成牽引性視網(wǎng)膜脫離的病變。PVR的治療主要是手術(shù)治療，但盡管采用了許多手術(shù)方法促使增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變的視網(wǎng)膜復(fù)位，可仍有1/3的病例手術(shù)失敗，其原因是雖然玻璃體手術(shù)能切除已形成的增殖膜，但不能完全去除增殖細(xì)胞，甚至還刺激其產(chǎn)生分化、增殖，因此，藥物防治PVR是非常必要的。
視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)是一種起源于視網(wǎng)膜核層原始干細(xì)胞的胚胎性惡性腫瘤，表現(xiàn)為視網(wǎng)膜細(xì)胞不受控制地生長(zhǎng)，具有遺傳性，占眼腫瘤的首位。此病多在三歲以前發(fā)病，偶見于成人，無(wú)性別差異，雙眼同時(shí)或先后發(fā)病者約占1/4。
人血管內(nèi)皮抑制素(endostatin)是膠原XVIII羧基端的一段分子量大小為20kDa的酶切產(chǎn)物，具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及體內(nèi)血管生成的活性，是目前已知最強(qiáng)的內(nèi)源性血管形成抑制因子。
重組人血管內(nèi)皮抑制素是利用DNA重組工程技術(shù)，以原核或真核表達(dá)載體，將人血管內(nèi)皮抑制素基因經(jīng)克隆、表達(dá)和純化得到的有血管生成抑制活性形式的蛋白質(zhì)。
中國(guó)發(fā)明專利(專利公開號(hào)為CN1324818A，
公開日為2001年12月5日，發(fā)明名稱為“生產(chǎn)內(nèi)皮抑制素的方法”)提供了一種改良的，以更高的產(chǎn)率和更簡(jiǎn)單的純化工藝生產(chǎn)重組人內(nèi)皮抑制素的方法。該發(fā)明利用DNA重組工程技術(shù)，以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，以簡(jiǎn)單的方法和較低的成本大批量生產(chǎn)N末端帶有(Met)GlyGlyXaaHisHisHisHisHis附加氨基酸序列的人血管內(nèi)皮抑制素(其中Xaa代表中性氨基酸或不存在)，不僅保留了endostatin的完全的生物學(xué)活性，而且沒(méi)有產(chǎn)生因加入附加N端序列所致的體內(nèi)免疫性。上述附加氨基酸序列不僅提高了內(nèi)皮抑制素結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始效率，有利于重組蛋白的純化，而且附加氨基酸序列的結(jié)構(gòu)也增加了重組蛋白的穩(wěn)定性。
目前用于預(yù)防和治療血管生成性眼底病的方法主要包括藥物、激光療法、同位素治療、手術(shù)等，但這些方法均有各自的缺點(diǎn)，如容易傷及臨近組織、療效不穩(wěn)定、風(fēng)險(xiǎn)較大等，因此找到特異性好、療效顯著、副作用小的治療方法是目前國(guó)內(nèi)外研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。


發(fā)明內(nèi)容
血管生成性眼底病雖然致病原因不同，但均出現(xiàn)眼底病變部位新生的毛細(xì)血管的增殖，新生血管生成成為病情發(fā)生和發(fā)展的重要因素。從這個(gè)機(jī)制上考慮，如果能用某些治療手段特異性地抑制眼底病灶新生血管的增殖，則可能為血管生成性眼底病的治療帶來(lái)新的突破。
為了克服血管生成性眼底病的傳統(tǒng)療法不穩(wěn)定、風(fēng)險(xiǎn)較大的缺陷，本發(fā)明提供了重組人血管內(nèi)皮抑制素的一種制藥用途，具體是使用重組人血管內(nèi)皮抑制素制備治療血管生成性眼底病的藥物的制藥用途，該藥物具有特異性強(qiáng)、無(wú)毒、無(wú)耐藥性的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案涉及重組人血管內(nèi)皮抑制素在制備治療血管生成性眼底病的藥物中的應(yīng)用。
本文中所述重組人血管內(nèi)皮抑制素保留了endostatin的完全的生物學(xué)活性，可運(yùn)用基因工程手段獲得，通過(guò)將人的血管內(nèi)皮抑制素基因或?qū)⒏臉?gòu)的人血管內(nèi)皮抑制素基因構(gòu)建到大腸桿菌(E.Coli)或畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)中，經(jīng)過(guò)發(fā)酵、分離、純化等手段得到。
本發(fā)明中優(yōu)選的重組人血管內(nèi)皮抑制素是在人血管內(nèi)皮抑制素編碼氨基酸序列的起始氨基酸Me t后依次添加0-4個(gè)任意氨基酸和2-8個(gè)組氨酸序列。其制備方法同中國(guó)發(fā)明專利(專利公開號(hào)為CN1324818A，
公開日為2001年12月5日，發(fā)明名稱為“生產(chǎn)內(nèi)皮抑制素的方法”)。
上述重組人血管內(nèi)皮抑制素的起始氨基酸Met可能被切除，原因是在表達(dá)宿主中蛋白翻譯后的加工過(guò)程中可能被刪除。
本發(fā)明優(yōu)選的重組人血管內(nèi)皮抑制素的氨基酸序列如SEQID NO1所示，該序列和中國(guó)發(fā)明專利(專利公開號(hào)為CN1324818A)公開的SEQ IDNO2相同，該序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的制備方法和上述公開專利的制備實(shí)施例相同。
上述治療血管生成性眼底病的藥物的制劑可以是注射液或凍干制劑。所述述藥物的活性組分可以是重組人血管內(nèi)皮抑制素、PEG修飾的重組人血管內(nèi)皮抑制素或重組人血管內(nèi)皮抑制素微球。所述PEG的分子量是5000-30000，PEG通過(guò)共價(jià)鍵(如琥珀酰亞氨基或巰基等)與重組人血管內(nèi)皮抑制素相連。所述重組人血管內(nèi)皮抑制素微球是通過(guò)基質(zhì)材料與重組人血管內(nèi)皮抑制素混合制備而成，其基質(zhì)材料可以是聚乳酸羥基乙酸嵌段共聚物(PLGA)，聚乙醇酸(PLA)等。
上述治療血管生成性眼底病的藥物中還含有保護(hù)劑和PH值調(diào)節(jié)劑。所述保護(hù)劑選自多元醇、糖類、氨基酸、表面活性劑，人血白蛋白、EDTA和NaCl。所述藥物的PH值范圍是4.0-8.5。
上述所述血管生成性眼底病包括增齡性黃斑變性、中心性滲出性視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變以及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的至少一種，與血管生成相關(guān)的其它眼底病也屬于本發(fā)明的適應(yīng)癥。
本發(fā)明中所述治療血管生成性眼底病的藥物可與傳統(tǒng)的治療方法聯(lián)合應(yīng)用，如與手術(shù)或常規(guī)治療藥物聯(lián)合應(yīng)用。
本發(fā)明還公開了一種治療血管生成性眼底病的重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液的配方，是由重組人血管內(nèi)皮抑制素和藥用輔料配制而成，其中按每毫升注射液計(jì)含有重組人血管內(nèi)皮抑制素0.2mg～10mg，甘露醇60mg～80mg，PH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH值為4.0～8.5。
本發(fā)明的實(shí)施例中還公開了重組人血管內(nèi)皮抑制素凍干制劑的制備工藝，該工藝制得的凍干制劑產(chǎn)品穩(wěn)定性好，能夠長(zhǎng)期保存。凍干制劑使用時(shí)需要溶于注射用水中，使用量根據(jù)病變程度酌情使用。
本發(fā)明適用于各種原因引起的血管生成性眼底病的治療，治療劑量可根據(jù)病情酌情加減，重組人血管內(nèi)皮抑制素治療有效濃度為0.2mg/ml～10mg/ml，一般采用眼底病變局部注射用藥。
為了更好的說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合藥物實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床實(shí)驗(yàn)說(shuō)明其在制備治療血管生成性眼底病的藥物中的用途。在下文的實(shí)驗(yàn)例以及制備實(shí)施例中所使用的重組人血管內(nèi)皮抑制素具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。如無(wú)特殊說(shuō)明，下文中所涉及的實(shí)驗(yàn)用材料均可通過(guò)商業(yè)途徑獲得。
1、重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，調(diào)整密度至1×104/ml，接種于96孔板，160ul/孔，分別向孔中加入40ul/孔不同稀釋度的5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.313mg/ml、0.156mg/ml重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白(即孔內(nèi)蛋白濃度依次為1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml)，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4天后以MTT(四甲基偶氮唑鹽)法于490nm處測(cè)定吸光度，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率＝1-(實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD)。MTT法結(jié)果顯示，各稀釋倍數(shù)的血管內(nèi)皮抑制素蛋白均可有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，最高抑制率可達(dá)87.5％(見表1)，形態(tài)觀察顯示此抑制作用伴有細(xì)胞的凋亡，作用96h后，細(xì)胞即完全變圓，核出現(xiàn)濃縮現(xiàn)象，而空白對(duì)照組則無(wú)此現(xiàn)象。
表1重組人血管內(nèi)皮抑制素對(duì)HUVEC的抑制率 2、角膜新生血管兔模型實(shí)驗(yàn) 取健康雄性新西蘭大白兔36只，眼部正常。隨機(jī)分為重組人血管內(nèi)皮抑制素高劑量實(shí)驗(yàn)組、中劑量實(shí)驗(yàn)組、低劑量實(shí)驗(yàn)組、光動(dòng)力療法組(陽(yáng)性對(duì)照組)、生理鹽水對(duì)照組(對(duì)照組)、和空白對(duì)照組(空白組)，每組6只(12只眼)。無(wú)菌條件下埋縫線于角膜基質(zhì)內(nèi)，手術(shù)后當(dāng)日分別向高、中、低劑量實(shí)驗(yàn)組兔眼玻璃體注射0.5ml重組人血管內(nèi)皮抑制素，濃度依次為80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml，每?jī)商熳⑸湟淮危B續(xù)注射10次。而同時(shí)向?qū)φ战M兔眼玻璃體注射生理鹽水0.5ml。陽(yáng)性對(duì)照組則實(shí)施光動(dòng)力療法，即先將光敏劑注入患者血管中，然后用黑光燈或長(zhǎng)波段激光照射血管瘤區(qū)域。光敏劑激活后產(chǎn)生光化學(xué)反應(yīng)并導(dǎo)致血管瘤部血管內(nèi)膜及間質(zhì)出現(xiàn)光性過(guò)程，使血管管腔閉塞，以達(dá)到治療目的。空白組兔眼不做任何處理。
每日觀察角膜新生血管生長(zhǎng)情況，連續(xù)20天。術(shù)后第20天處死兔，摘除眼球，觀察眼球情況，比較各組眼球角膜新生血管的最大生長(zhǎng)面積及最長(zhǎng)生長(zhǎng)長(zhǎng)度。同時(shí)在摘除眼球時(shí)還要取其臟器(心、肝、腎、脾、肺)，以便進(jìn)行是否有毒副作用的研究。
結(jié)果生理鹽水對(duì)照組角膜基質(zhì)層的新生血管比實(shí)驗(yàn)組多，且管腔大，而各劑量實(shí)驗(yàn)組的角膜上皮細(xì)胞正常，新生血管較少，生長(zhǎng)緩慢而且稀疏(表2)，眼球結(jié)膜基本沒(méi)有出現(xiàn)充血及水腫現(xiàn)象，角膜未混濁、未水腫，且效果存在劑量依賴性。陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行光動(dòng)力治療后，激光區(qū)的炎癥反應(yīng)部分消失，部分新生血管封閉和變狹窄，狹窄的新生血管管腔內(nèi)有纖維樣物質(zhì)，但角膜內(nèi)皮細(xì)胞及周圍組織出現(xiàn)輕微損傷?？瞻讓?duì)照組角膜透明、無(wú)血管。另外，臟器病理檢測(cè)的結(jié)果顯示，各劑量實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組及空白對(duì)照組無(wú)明顯區(qū)別，這也就說(shuō)明本發(fā)明中重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液對(duì)身體的重要臟器沒(méi)有明顯的毒副作用。
表2角膜新生血管最大生長(zhǎng)面積及最長(zhǎng)生長(zhǎng)長(zhǎng)度 *組與陽(yáng)性對(duì)照組(光動(dòng)力療法組)的最大生長(zhǎng)面積比較p＜0.05、 *組與陽(yáng)性對(duì)照組(光動(dòng)力療法組)的最長(zhǎng)生長(zhǎng)長(zhǎng)度比較p＜0.05。
試驗(yàn)研究表明由兔眼部角膜縫線制備的角膜新生血管兔模型，其角膜基質(zhì)被人為縫線，造成血管生成性眼底病變，將重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液注射入兔眼部后，能夠顯著地抑制病變部位新生血管的形成，其血管的最長(zhǎng)生長(zhǎng)長(zhǎng)度及最大生長(zhǎng)面積均明顯低于生理鹽水對(duì)照組，明顯改善了血管生成性眼底病的癥狀，具有較好的療效，而且沒(méi)有明顯的毒副作用。
結(jié)論重組人血管內(nèi)皮抑制素可以顯著地抑制眼底部位新生血管的形成，其效果優(yōu)于光動(dòng)力治療法，有效達(dá)到治療血管生成性眼底病的目的，且該注射液對(duì)身體的重要臟器無(wú)明顯毒副作用。
以下通過(guò)試驗(yàn)病例和臨床療效觀察來(lái)闡述本發(fā)明藥物的有益效果。
病例一 患者，男，59歲?；颊咭蛴已垡曃锬：磺迩易冃危肽旰笥卺t(yī)院就診。經(jīng)檢查，左眼視力1.0，右眼視力0.2，雙眼前節(jié)及左眼眼底均未出現(xiàn)異常，右眼眼底部位視乳頭邊清，顳側(cè)稍淡，血管走行好，動(dòng)脈壁反光略強(qiáng)，黃斑區(qū)污穢，可見玻璃膜疣、色素紊亂、黃白色滲出物、出血、形成機(jī)化斑、黃斑中心凹光反射基本消失。FFA檢查顯示黃斑部熒光素滲出形成較強(qiáng)熒光，出血遮蔽熒光?；颊咂剿匦郧榧痹?，患冠心病心肌缺血3年，且伴隨腰膝酸軟頭暈、舌質(zhì)淡。臨床診斷右眼增齡性黃斑變性(滲出型)。治療經(jīng)患者及其家屬同意，向患者的右眼玻璃體注射3mg/ml重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液0.5ml，每3周注射一次，2個(gè)月為一個(gè)療程。第一療程過(guò)后，患者自述視物變形的情況消失，視物較以前清晰，復(fù)查視力結(jié)果為左眼1.0，右眼0.5，眼底黃斑區(qū)的出血片縮小，玻璃膜疣減少。繼續(xù)一個(gè)療程后，患者自述視物清晰，復(fù)查視力結(jié)果為左眼1.0，右眼0.9，右眼底黃斑區(qū)滲出及出血基本吸收，玻璃膜疣基本無(wú)殘留。
病例二 患者，女，1歲?；純貉弁?、哭鬧不安?；颊咦笱郯淄橐暳ο陆?，一周后到醫(yī)院就診。檢查結(jié)果為雙眼外眼未見異常，左眼結(jié)膜充血，網(wǎng)膜輕度水腫，瞳孔為6mm，隱見網(wǎng)膜隆起。雙眼球均可見彌漫性密度增高影，玻璃體腔內(nèi)出現(xiàn)稍高密度軟組織樣影，晶狀體顯示正常，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管擴(kuò)張，視網(wǎng)膜上有邊界不清的黃白色隆起腫塊，眼球后壁出現(xiàn)斑片狀鈣化。腫瘤有擴(kuò)大及轉(zhuǎn)移跡象。CT診斷雙眼視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。治療經(jīng)患者監(jiān)護(hù)人同意，分別向患者的雙眼玻璃體注射1mg/ml重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液0.5ml，每3周注射一次，2個(gè)月為一個(gè)療程。一個(gè)療程后，患者腫瘤沒(méi)有擴(kuò)大及轉(zhuǎn)移，且視網(wǎng)膜上的腫塊減小，雙眼球內(nèi)密度降低，鈣化斑癥狀減輕。繼續(xù)治療1個(gè)療程后，各癥狀均明顯改善，為防止復(fù)發(fā)，又繼續(xù)注射了2個(gè)療程，病變基本完全被抑制，患兒眼痛、頭痛等癥狀明顯減輕。
105例增齡性黃斑變性臨床觀察實(shí)驗(yàn): 對(duì)105例(114只患眼)增齡性黃斑變性(AMD)患者(臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)眼科學(xué)分會(huì)眼底病學(xué)組.老年性黃斑變性臨床診斷標(biāo)準(zhǔn).眼底病，1987，3封三)進(jìn)行玻璃體內(nèi)注射重組人血管內(nèi)皮抑制素，患眼每次1.5mg，每4周注射1次，給藥3個(gè)月后，結(jié)果顯示患者平均中心視網(wǎng)膜厚度從注射前305±89μm下降到235±99μm，平均視力增加了1.69行(p＝0.001)。其中顯著效果39例(43只眼)，視力較注射之前提高3行以上(包括3行)，視網(wǎng)膜厚度下降，黃斑部玻璃膜疣明顯減少，滲出停滯，全身癥狀基本消失。有效60例(64只眼)，視力較之前提高1～2行，黃斑部玻璃膜疣減少，滲出減少，全身癥狀明顯改善。效果不明顯6例(7只眼)，視力無(wú)明顯提高，眼底癥狀無(wú)明顯改善，需要繼續(xù)注射。在給藥的三個(gè)月內(nèi)追蹤調(diào)查的結(jié)果顯示，54％的患者在治療1周后視網(wǎng)膜厚度下降＞10％，4周后52只患眼視網(wǎng)膜水腫、視網(wǎng)膜下積液(SRF)和色素上皮脫離(PED)癥狀明顯減輕，甚至消失，8周后又有36只患眼的上述癥狀消失。
本發(fā)明將重組人血管內(nèi)皮抑制素直接進(jìn)行玻璃體注射來(lái)治療血管生成性眼底病，其帶來(lái)的有益效果是 1)挖掘了重組人血管內(nèi)皮抑制素的新的適應(yīng)癥的治療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。
2)本發(fā)明的重組人血管內(nèi)皮抑制素特異抑制眼底病灶新生血管的增殖，安全無(wú)毒，無(wú)耐藥性，預(yù)示著有很好的應(yīng)用前景。
3)本發(fā)明將重組人血管內(nèi)皮抑制素直接進(jìn)行玻璃體注射來(lái)治療血管生成性眼底病，治療方法簡(jiǎn)便快捷，顯效快，適用癥范圍廣。

具體實(shí)施例方式 下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面的理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1 配制含有重組人血管內(nèi)皮抑制素的注射液，使其每毫升含有血管內(nèi)皮抑制素2mg、甘露醇8mg，加入濃度為10mM醋酸鈉調(diào)節(jié)PH值為6.5。過(guò)濾除菌，無(wú)菌灌裝，每支3ml。
用法與用量將本藥注入生理鹽水或葡萄糖注射液中，玻璃體注射，用量根據(jù)病情酌情加減，每4周1次。
實(shí)施例2 使用30mM pH5.5±0.5左右的醋酸-醋酸鈉緩沖體系對(duì)純化后的重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制151.5ml濃度為9.9mg/ml的重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液，加入20％甘露醇60ml及20％蔗糖溶液7.5ml，補(bǔ)加1.5M pH5.5左右的醋酸-醋酸鈉緩沖液2.98ml，加入注射水至300ml。經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌過(guò)濾，分裝于預(yù)灌封注射器中，于4℃保存。
實(shí)施例3 使用30mM pH5.5±0.5左右的醋酸-醋酸鈉緩沖體系對(duì)純化后的重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制90.9ml濃度為9.9mg/ml的重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液，加入20％甘露醇60ml，補(bǔ)加1.5M pH5.5左右的醋酸-醋酸鈉緩沖液4.20ml，加入注射水至300ml。經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌過(guò)濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內(nèi)，制品溫度下降至-40℃，保持3-4小時(shí)，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-20℃，保持8小時(shí)，繼續(xù)加熱升高溫度至25℃，保持6小時(shí)，至真空度變化不大時(shí)，真空壓塞后取出，軋蓋。
實(shí)施例4 使用30mM pH5.5±0.5左右的醋酸-醋酸鈉緩沖體系對(duì)純化后的重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制151.5ml濃度為9.9mg/ml的重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液，加入20％甘露醇60ml及20％蔗糖溶液15ml，補(bǔ)加1.5M pH5.5左右的醋酸-醋酸鈉緩沖液2.98ml，加入注射水至300ml。經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌過(guò)濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內(nèi)，制品溫度下降至-40℃，保持4-5小時(shí)，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-25℃，保持10小時(shí)，繼續(xù)加熱升高溫度至30℃，保持4小時(shí)，至真空度變化不大時(shí)，真空壓塞后取出，軋蓋。
實(shí)施例5 使用30mM pH5.5±0.5左右的醋酸-醋酸鈉緩沖體系對(duì)純化后的重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制97.8ml濃度為30.61mg/ml的重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液，加入20％甘露醇60ml及20％蔗糖溶液60ml，補(bǔ)加1.5M pH5.5左右的醋酸-醋酸鈉緩沖液4.04ml，加入注射水至300ml。經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌過(guò)濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內(nèi)，制品溫度下降至-45℃，保持6小時(shí)，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-30℃，保持6小時(shí)，再加熱升高溫度至-25℃，保持6小時(shí)，繼續(xù)加熱升高溫度至25℃，保持8小時(shí)，至真空度變化不大時(shí)真空壓塞后取出，軋蓋。
實(shí)施例6 使用30mM pH5.5±0.5左右的醋酸-醋酸鈉緩沖體系對(duì)純化后的重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制147ml濃度為30.61mg/ml的重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液，加入20％甘露醇60ml、20％蔗糖溶液60ml及20％海藻糖溶液30ml，補(bǔ)加1.5M pH5.5左右的醋酸-醋酸鈉緩沖液3.06ml，加入注射水至300ml。經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌過(guò)濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內(nèi)，制品溫度下降至-45℃，保持2-4小時(shí)，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-30℃，保持12小時(shí)，繼續(xù)加熱升高溫度至30℃，保持6小時(shí)，至真空度變化不大時(shí)，真空壓塞后取出，軋蓋。
實(shí)施例7 使用10mM pH6.0±0.5左右的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系對(duì)純化后的重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制30ml濃度為9.9mg/ml的重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液，加入2％甘氨酸15ml、吐溫-800.15ml，補(bǔ)加1.0M pH6.5左右的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液2.70ml，加入注射水至300ml。經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌過(guò)濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內(nèi)，制品溫度下降至-40℃，保持2-4小時(shí)，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-30℃，保持8小時(shí)，繼續(xù)加熱升高溫度至30℃，保持8小時(shí)，至真空度變化不大時(shí)，真空壓塞后取出，軋蓋。
實(shí)施例8 使用10mM pH7.0±0.5左右的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖體系對(duì)純化后的重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制73.5ml濃度為30.61mg/ml的重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液，加入2％EDTA 30ml、20％甘露醇溶液30ml及20％蔗糖溶液7.5ml，補(bǔ)加1.5M pH7.0±0.5左右的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液2.26ml，加入注射水至300ml。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜除菌過(guò)濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內(nèi)，制品溫度下降至-45℃，保持8小時(shí)，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-30℃，保持12小時(shí)，繼續(xù)加熱升高溫度至25℃，保持10小時(shí)，至真空度變化不大時(shí)，真空壓塞后取出，軋蓋。
實(shí)施例9 使用30mM pH5.5±0.5左右的醋酸-醋酸鈉緩沖體系對(duì)純化后的重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制15ml濃度為9.9mg/ml的重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液，加入10％谷氨酸15ml及10％蘇氨酸15ml，補(bǔ)加1.5M pH5.5左右的醋酸-醋酸鈉緩沖液5.7ml，加入注射水至300ml。經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌過(guò)濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內(nèi)，制品溫度下降至-40℃，保持4-5小時(shí)，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-25℃，保持10小時(shí)，繼續(xù)加熱升高溫度至30℃，保持4小時(shí)，至真空度變化不大時(shí)，真空壓塞后取出，軋蓋。
實(shí)施例10 使用30mM pH5.5±0.5左右的醋酸-醋酸鈉緩沖體系對(duì)純化后的重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制151.5ml濃度為9.9mg/ml的重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液，加入20％人血白蛋白溶液30ml，補(bǔ)加1.5M pH5.5左右的醋酸-醋酸鈉緩沖液2.98ml，加入注射水至300ml。經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌過(guò)濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內(nèi)，制品溫度下降至-40℃，保持4-5小時(shí)，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至--15℃，保持10小時(shí)，繼續(xù)加熱升高溫度至20℃，保持10小時(shí)，至真空度變化不大時(shí)，真空壓塞后取出，軋蓋。
實(shí)施例11 稱取重組人血管內(nèi)皮抑制素微球(PLGA包合)30g，內(nèi)包合重組人血管內(nèi)皮抑制素3g，加入20％甘露醇60ml，20％蔗糖溶液15ml加入1.5MpH5.5左右的醋酸-醋酸鈉緩沖液6.0ml，加入注射水至300ml，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內(nèi)，制品溫度下降至-40℃，保持4-5小時(shí)，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-25℃，保持10小時(shí)，繼續(xù)加熱升高溫度至30℃，保持4小時(shí)，至真空度變化不大時(shí)，真空壓塞后取出，軋蓋。
序列表
<110>山東先聲麥得津生物制藥有限公司
<120>重組人血管內(nèi)皮抑制素在制藥中的應(yīng)用
<130>MP071323
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>192
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>重組人血管內(nèi)皮抑制素
<400>1
Met Gly Gly Ser His His His His His His Ser His Arg Asp Phe Gln
1 5 10 15
Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met
20 25 30
Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala
35 40 45
Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln
50 55 60
Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile
65 70 75 80
Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe
85 90 95
Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe
100 105 110
Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val
115 120 125
Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys
130 135 140
Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser
145 150 155 160
Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His
165 170 175
Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys
180 185 190
權(quán)利要求
1.重組人血管內(nèi)皮抑制素在制備治療血管生成性眼底病的藥物中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組人血管內(nèi)皮抑制素是在人血管內(nèi)皮抑制素編碼氨基酸序列的起始氨基酸Met后依次添加0-4個(gè)任意氨基酸和2-8個(gè)組氨酸序列。
3.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組人血管內(nèi)皮抑制素的起始氨基酸Met可以被切除。
4.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組人血管內(nèi)皮抑制素的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述治療血管生成性眼底病的藥物的制劑是注射液或凍干制劑。
6.權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物的活性組分是重組人血管內(nèi)皮抑制素、PEG修飾的重組人血管內(nèi)皮抑制素或重組人血管內(nèi)皮抑制素微球。
7.權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述PEG的分子量是5000-30000，PEG通過(guò)共價(jià)鍵與重組人血管內(nèi)皮抑制素相連。
8.權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組人血管內(nèi)皮抑制素微球是通過(guò)基質(zhì)材料與重組人血管內(nèi)皮抑制素混合制備而成。
9.權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物中還含有保護(hù)劑和PH值調(diào)節(jié)劑。
10.權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述保護(hù)劑選自多元醇、糖類、氨基酸、表面活性劑、人血白蛋白、EDTA和NaCl。
11.權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物的PH值范圍是4.0-8.5。
12.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述血管生成性眼底病包括增齡性黃斑變性、中心性滲出性視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變以及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組人血管內(nèi)皮抑制素在制藥中的應(yīng)用，具體公開了重組人血管內(nèi)皮抑制素在制備治療血管生成性眼底病的藥物中的應(yīng)用。通過(guò)重組人血管內(nèi)皮抑制素進(jìn)行玻璃體注射來(lái)治療血管生成性眼底病，可以有效地抑制眼底病變部位的新生血管增殖，從而治療血管生成性眼底病，改善癥狀。該方法特異性強(qiáng)、高效、無(wú)明顯毒副作用。
文檔編號(hào)A61K38/17GK101219206SQ20081000606
公開日2008年7月16日 申請(qǐng)日期2008年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月1日
發(fā)明者武 劉, 羅興洪, 靜 姜, 迪 宋 申請(qǐng)人:山東先聲麥得津生物制藥有限公司