專利名稱：利用trail和hn基因構(gòu)建重組腺病毒的方法及重組腺病毒和應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及構(gòu)建重組腺病毒的方法，具體說，是一種利用TRAIL和HN基因構(gòu)建重組腺病毒的方法及重組腺病毒和應用。
背景技術(shù)：
近年來，隨著某些重要動物疫源性疾病和普通病相繼得到有效控制，畜禽腫瘤性疾病的防治越發(fā)顯得重要。如禽白血病(avian leukosis, AL)作為一類禽類腫瘤性疾病， 在許多國家和地區(qū)均有報道，常給養(yǎng)禽業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失。AL是由反轉(zhuǎn)錄病毒科禽白血病/肉瘤病毒群病毒(avian leukosis/sarcoma virus, AL/SV)引起的禽類多種腫瘤性疾病的總稱。以病禽造血組織發(fā)生惡性、無限制增生和全身許多器官組織出現(xiàn)腫瘤性病灶為主要病理變化特征。迄今為止，獸醫(yī)臨診上還未研制出能有效預防該病的疫苗，故尚無切實可行的防治措施。在生產(chǎn)實踐中主要通過病原檢測、淘汰陽性雞和凈化種群等方法控制該病的發(fā)生。因此，如何突破畜禽腫瘤性疾病防治過程中的技術(shù)桎梏，已成為動物醫(yī)學界在該研究領域一直努力和亟待解決的難題，而目前興起的基因療法無疑為此類疾病的防治提供了嶄新的研究思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，將TRAIL對腫瘤細胞的靶向性、HN基因的細胞凋亡作用與腺病毒表達載體系統(tǒng)高效穩(wěn)定表達外源基因的特性相結(jié)合，構(gòu)建融合表達上述基因的重組腺病毒Ad-TRAIL-Iinker-HN，使雙基因在抑制腫瘤細胞生長方面發(fā)揮協(xié)同作用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種利用TRAIL和HN基因重組腺病毒的構(gòu)建方法及重組腺病毒和應用，包括以下步驟I)雞TRAIL和新城疫病毒HN基因的克隆與序列分析；2) TRAIL和TRAIL-linker-HN基因重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建；3) TRAIL和TRAIL-linker-HN基因重組腺病毒的構(gòu)建；4)重組腺病毒介導禽淋巴白血病DT40細胞凋亡的體外實驗。具體包括步驟如下本試驗從雞脾細胞和新城疫病毒(NDV)LaSota株中分別擴增出TRAIL和HN基因序列，通過定點突變和重疊延伸拼接法實現(xiàn)TRAIL和HN基因以5-15個柔性氨基酸的 linker連接；將獲得的目的基因克隆到pShuttle-CMV穿梭載體中，經(jīng)與pAd-Easy骨架載體共轉(zhuǎn)染大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細胞，使其在BJ5183內(nèi)進行同源重組，構(gòu)建了包含目的基因的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-TRAIL和pAd-TRAIL-1 inker-HN ;將重組腺病毒質(zhì)粒由PacI酶切后，經(jīng)脂質(zhì)體介導，轉(zhuǎn)染AD293細胞，包裝后獲得重組腺病毒；應用RT-PCR對重組腺病毒在 AD293細胞中表達情況進行鑒定；通過熒光顯微技術(shù)和細胞毒試驗檢測病毒感染AD293細胞后的形態(tài)變化；利用氯化銫(CsCl)密度梯度離心法純化病毒并測定其滴度；將獲得的重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染禽淋巴白血病DT40細胞，通過RT-PCR和Western blotting檢測重組腺病毒的感染性和外源基因的表達情況；分別采用MTT和流式細胞儀檢測重組腺病毒對DT40 細胞生長的影響以及TRAIL和TRAIL-linker-HN基因?qū)T40細胞的凋亡作用，并對雙基因抑瘤作用的協(xié)同效應進行評價。本發(fā)明的有益效果是將TRAIL對腫瘤細胞的靶向性、HN基因的細胞凋亡作用與腺病毒表達載體系統(tǒng)高效穩(wěn)定表達外源基因的特性相結(jié)合，構(gòu)建融合表達上述基因的重組腺病毒Ad-TRAIL-linker-HN，使雙基因在抑制腫瘤細胞生長方面發(fā)揮協(xié)同作用。通過對重組腺病毒在DT40細胞中的病毒滴度、外源基因的蛋白表達、細胞活力和細胞凋亡的檢測， 綜合評價了重組腺病毒對DT40細胞的抑瘤作用，闡明重組腺病毒在DT40細胞中的表達規(guī)律及殺傷腫瘤細胞的生物學效應，結(jié)果顯示TRAIL和TRAIL-linker-HN基因均可抑制DT40 細胞的生長并誘導腫瘤細胞凋亡(P < 0.01)，并且TRAIL-linker-HN基因的抑瘤作用(凋亡率為29. 52% )顯著優(yōu)于TRAIL基因(凋亡率為4. 86% )。本發(fā)明最終研制出一種針對動物腫瘤性疾病的廣譜疫苗。


圖I 是 TRAIL和 HN基因 RT-PCR擴增結(jié)果(I. DL15000 ;2. HN基因；3. TRAIL基因)。圖2是TRAIL基因Blast結(jié)果。圖3是HN基因Blast結(jié)果。圖4 是 PCR 擴增結(jié)果(I. DL2000 ；2.對照；3、DL15000 ；4. Iinker-HN 基因；
5.TRAIL-Iinker ；6. TRAIL-linker-HN 基因)。圖5 是 pShuttle-TRAIL 雙酶切結(jié)果(I. DL2000 ;2. pShuttle-TRAIL 酶切產(chǎn)物；
3.pShuttle-TRAIL)。圖 6 是 pShuttle-TRAIL-linker-HN 雙酶切結(jié)果(I. pShuttle-TRAIL-1 inker-HN 酶切產(chǎn)物；2. pShuttle-TRAIL-1 inker-HN ；3. DL15000)。圖7是重組腺病毒質(zhì)粒酶切結(jié)果(I. pAd-TRAIL-1 inker-HN ;
2.pAd-TRAIL-1 inker-HN 酶切產(chǎn)物；3. DL15000 ;4.對照；5. pAd-TRAIL 酶切產(chǎn)物；
6.pAd-TRAIL)。圖8 是 pAd-GFP 酶切結(jié)果(I. pAd-GFP 酶切產(chǎn)物；2. pAd-GFP ；3. DL15000)。圖9是重組腺病毒感染AD293細胞后RT-PCR檢測目的基因(I. A -DNA/Ecol301 ；
2.TRAIL RT-PCR 產(chǎn)物；3. HN RT-PCR 產(chǎn)物；4. TRAIL-linker-HN RT-PCR 產(chǎn)物)。圖10是重組腺病毒對DT40的細胞毒作用(A. Control Id ；B. Control2d ； C. Ad-TRAIL Id ;D. Ad-TRAIL-linker-HN Id ；E.Ad-TRAIL 2d ；F.Ad-TRAIL-linker-HN 2d; G. Ad-TRAIL 3d ；H. Ad-TRAIL-linker-HN 3d)。圖11是Western blotting檢測重組腺病毒感染DT40細胞后TRAIL和 TRAIL-linker-HN 蛋白的變化。圖12是重組腺病毒感染DT40細胞后的生長曲線。圖13是重組腺病毒誘導DT40細胞凋亡(A. Ad-GFP組；B. Ad-TRAIL組； C. Ad-TRAIL-linker-HN組；D.三組重組腺病毒誘導DT40細胞凋亡率)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明I材料與方法I. ITRAIL和HN基因的擴增取健康SPF雞，按照《現(xiàn)代動物免疫學》中的實驗方法制備淋巴細胞，加入 ImlTrizol試劑，按照產(chǎn)品說明書操作，提取總RNA。根據(jù)GeneBank中雞TRAIL基因序列 (GI 45383401)，設計一對RT-PCR擴增引物。按Takara 公司 PrimeScript TM One Step RT-PCR kit 說明書米用一步法進行擴增TRAIL基因序列。擴增產(chǎn)物克隆到PMD18-T載體上。將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為 pMD-TRAIL,于 _20°C保存?zhèn)溆?。用滅菌生理鹽水溶解凍干保存的NDV LaSota系毒株(I 1000倍稀釋)，經(jīng)雙抗 (青霉素鏈霉素=I : I配成100萬U/ml溶液)處理后,提取總RNA。根據(jù)GeneBank中已發(fā)表的NDV HN cDNA序列(GI =124295088)設計如下引物。經(jīng)RT-PCR擴增(反應體系見表I)和T-A克隆(反應體系見表2)，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pMD-HN。引物序列見下表3。表IRT-PCR反應體系
權(quán)利要求
1.一種利用TRAIL和HN基因構(gòu)建重組腺病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟1)從雞脾細胞和新城疫病毒LaSota株中分別擴增出TRAIL和HN基因序列，通過定點突變和重疊延伸拼接法實現(xiàn)TRAIL和HN基因以多個柔性氨基酸的linker連接；2)將獲得的目的基因克隆到pShuttle-CMV穿梭載體中，經(jīng)與pAd-Easy骨架載體共轉(zhuǎn)染大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細胞，使其在BJ5183內(nèi)進行同源重組，構(gòu)建了包含目的基因的重組腺病毒質(zhì)粒 pAd-TRAIL 和 pAd-TRAIL-linker-HN ；3)將重組腺病毒質(zhì)粒由PacI酶切后，經(jīng)脂質(zhì)體介導，轉(zhuǎn)染AD293細胞，包裝后獲得重組腺病毒 Ad-TRAIL-Linker-HN。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用TRAIL和HN基因構(gòu)建重組腺病毒的方法，其特征在于， 所述步驟I)中柔性氨基酸為5-15個。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用TRAIL和HN基因構(gòu)建重組腺病毒的方法，其特征在于， 所述步驟I)雞脾細胞為雞脾的外周淋巴細胞。
4.如權(quán)利要求I所述的利用TRAIL和HN基因構(gòu)建重組腺病毒的方法制備的重組腺病毒。
5.如權(quán)利要求I所述的利用TRAIL和HN基因構(gòu)建重組腺病毒的方法制備的重組腺病毒在防治動物腫瘤性疾病的生物制品中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用TRAIL和HN基因構(gòu)建重組腺病毒的方法及重組腺病毒和應用，使雙基因在抑制腫瘤細胞生長方面發(fā)揮協(xié)同作用。采用從雞脾細胞和新城疫病毒(NDV)LaSota株中分別擴增出TRAIL和HN基因序列，通過定點突變和重疊延伸拼接法實現(xiàn)TRAIL和HN基因以柔性氨基酸的linker連接；將獲得的目的基因克隆到pShuttle-CMV穿梭載體中，經(jīng)與pAd-Easy骨架載體共轉(zhuǎn)染大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細胞，使其在BJ5183內(nèi)進行同源重組，構(gòu)建了包含目的基因的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-TRAIL和pAd-TRAIL-linker-HN；將重組腺病毒質(zhì)粒由PacI酶切后，經(jīng)脂質(zhì)體介導，轉(zhuǎn)染AD293細胞，包裝后獲得重組腺病毒；并對雙基因抑瘤作用的協(xié)同效應進行評價。
文檔編號A61K48/00GK102604992SQ20121004769
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日
發(fā)明者孫穎, 徐良, 秦云倩, 董東曉, 金天明, 高靜 申請人:天津農(nóng)學院